張?zhí)硪恚钚耜?，貢常委，汪雨蒙，?耀，朱新成，李 彬，王學貴*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130；2.成都綠金高新技術(shù)股份有限公司，成都 610023）

紅火蟻(Solenopsis invicta Buren)是一種原產(chǎn)于南美洲的外來入侵物種[1]，主要取食農(nóng)林作物種子、果實及根系，筑巢行為引起電線短路或設(shè)施故障，叮蟄人畜造成灼傷疼痛甚至休克和死亡。紅火蟻在世界范圍內(nèi)擴散速度十分迅速。上世紀開始在美國廣泛擴散[2]；2003年入侵臺灣后迅速蔓延[3]；2004年入侵廣州[4]，隨后經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西、福建、湖南等省亦有紅火蟻的存在[5]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄，四川省于2012年首次在攀枝花市發(fā)現(xiàn)紅火蟻，2013年在西昌發(fā)現(xiàn)紅火蟻，2019年紅火蟻已廣泛分布于攀西地區(qū)[6]。據(jù)調(diào)查，紅火蟻在四川省具有高度危險性[7-8]，其適生范圍廣、抗逆性強、繁殖速度極快[9]，且四川地區(qū)氣候溫暖、資源豐富，為紅火蟻的入侵提供了絕佳的環(huán)境條件，每年的雨季是紅火蟻婚飛的高峰期[10]，為四川省的紅火蟻防控帶來極大壓力。以往紅火蟻主要分布于攀西地區(qū)，但近年來紅火蟻在四川省迅速擴散，紅火蟻疫情發(fā)生程度有加重的趨勢，給四川省的生態(tài)環(huán)境和人民安全帶來嚴重威脅。

紅火蟻的傳播方式多樣，以人為傳播為主，隨苗木調(diào)運等人為因素入侵新的區(qū)域[11]。不同入侵來源的紅火蟻及其在新的入侵區(qū)域的適生性可能導致紅火蟻種群出現(xiàn)一定的遺傳分化[12]。就紅火蟻檢疫而言，明確入侵紅火蟻種群來源尤為重要。微衛(wèi)星（simple sequence repeat，SSR）分子標記是目前預測紅火蟻種群來源的一種快速、簡便和準確的分析技術(shù)[13]。邵敬國[14]利用微衛(wèi)星位點對紅火蟻種群遺傳多樣性進行分析，推測我國紅火蟻入侵源可能為美國。黃奕雯等[12]對我國各省紅火蟻種群進行微衛(wèi)星分析，認為國內(nèi)紅火蟻入侵種群與美國亞拉巴馬州紅火蟻種群在遺傳距離上十分接近。利用微衛(wèi)星位點的多態(tài)性來分析物種進化、遺傳多樣性已有大量報道[15-17]。對四川省紅火蟻種群分布調(diào)查和遺傳分化分析可以明確紅火蟻在四川省的入侵來源、入侵路線及進化過程，有助于四川省今后制訂更有針對性的紅火蟻檢驗檢疫措施。本試驗使用SSR分子標記對四川省紅火蟻地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)進行探索，希望揭示四川省紅火蟻的遺傳進化過程及地理種群間的親緣關(guān)系，為控制紅火蟻在四川省的擴散提供幫助。

1 材料和方法

1.1 調(diào)查地點及調(diào)查方法

根據(jù)四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳和四川省林業(yè)和草原局印發(fā)的四川省紅火蟻發(fā)生縣、鄉(xiāng)級行政區(qū)名錄，于2021年7—8月前往攀枝花市、瀘州市、綿陽市、廣元市、達州市和涼山州西昌市等紅火蟻發(fā)生區(qū)域，在當?shù)刂脖Ｕ救藛T的協(xié)助下進行紅火蟻疫情等級調(diào)查，根據(jù)紅火蟻疫情監(jiān)測規(guī)程[18]確定其發(fā)生程度。一級：輕度，活蟻巢為≤0.1個/100 m2；二級：中度，活蟻巢為（0.11～0.5）個/100 m2；三級：中偏重，活蟻巢為（0.51～1.0）個/100 m2；四級：重度，活蟻巢為（1.1～10）個/100 m2；五級：嚴重，活蟻巢>10個/100 m2。

1.2 采樣

使用100 mL離心管作為誘集瓶，瓶內(nèi)裝有涂抹蜂蜜的火腿腸放置于距蟻巢30 cm處誘集紅火蟻。誘集30 min后取回誘集瓶，加入10%丙酮水溶液，待紅火蟻全部死亡后使用100目篩網(wǎng)過濾收集紅火蟻，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取

參考改良的CTAB法[19]，提取紅火蟻樣本的DNA，用核酸濃度測定儀檢測DNA純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR-PCR擴增及凝膠電泳檢測

根據(jù)前人報道的SSR序列合成8對引物，引物序列為：

參照其反應(yīng)體系進行PCR擴增[20]。3%瓊脂糖凝膠電泳，控制電壓為80 V恒壓，電泳100 min。置于凝膠成像儀中成像觀察并拍照，將所得圖像直接在成像系統(tǒng)中進行處理，對擴增結(jié)果讀帶。所有引物均由成都擎科生物有限公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

按照電泳圖譜中同一位置上DNA帶進行統(tǒng)計，根據(jù)分子量大小對擴增結(jié)果讀帶以二倍體形式記錄 ，從大 到 小依 次 記作 A，B，C，……[21]。 用POPGENE 1.32軟件在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下，對全部種群和各單個種群分別進行遺傳參數(shù)分析，分別計算多態(tài)位點百分率（P）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（Nei's）、Shannon信息指數(shù)（I）、表觀雜合度（Ho）和預期雜合度（He）、種群內(nèi)近交系數(shù)（Fis）、總近交系數(shù)（Fit）、種群間分化系數(shù)（Fst）、種間信息流（Nem）、Nei's標準遺傳距離（D）和遺傳相似度（I）。根據(jù)D，利用NTSYS-pc 2.1軟件對各種群進行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫情分析

2.1.1 各地紅火蟻發(fā)生調(diào)查

結(jié)果表明（表1），綿陽的紅火蟻發(fā)生程度達到中偏重程度，疫情等級為3級；西昌的紅火蟻發(fā)生程度從輕度到重度不等，疫情等級為1～4級；攀枝花的紅火蟻發(fā)生程度從輕度到重度不等，疫情等級為1～4級；會理的紅火蟻發(fā)生程度達到重度，疫情等級為4級；達州的紅火蟻已被徹底防控，疫情等級為0級；廣元的紅火蟻發(fā)生程度為輕度，疫情等級為1級。

2.1.2 不同生境類型的紅火蟻發(fā)生情況

結(jié)果表明（表1），各地的紅火蟻發(fā)生的生境包括：草坪、建筑荒地、農(nóng)田、公園、綠化帶、果園、山路、公路等。紅火蟻發(fā)生較多的生境為：草坪、公園、果園、農(nóng)田、公路5種生境，發(fā)生程度達到重度程度，疫情等級為4級。

表1 2021年7—8月四川省紅火蟻疫情發(fā)生情況Table 1 Epidemic situation of Solenopsis invicta in Sichuan Province from July to August 2021

2.2 SSR-PCR擴增結(jié)果

選取8個SSR位點對5個紅火蟻地理種群的基因組DNA進行PCR擴增和電泳分析，共獲得出60個多態(tài)條帶，部分擴增結(jié)果見圖1。

圖1 8對SSR引物對部分紅火蟻種群基因組DNA的PCR擴增Figure 1 PCR amplification of 8 pairs of SSR primers on genomic DNA of some Solenopsis invicta populations

2.3 5個紅火蟻地理種群的遺傳多樣性

結(jié)果表明（表2），8對微衛(wèi)星引物在5個紅火蟻地理種群中共檢測到60個等位基因，每個微衛(wèi)星位點上平均有7.5個等位基因，在位點Sol-55上的等位基因最多為9個，綿陽種群在位點Sol-18上未檢測到等位基因。5個紅火蟻地理種群的多態(tài)位點百分率為36.67%～78.33%，其中，綿陽種群的多態(tài)位點百分率最低，攀枝花種群的多態(tài)位點百分率最高；各種群在8個微衛(wèi)星位點上觀測等位基因數(shù)的平均值為2.750 0～5.875 0，其中綿陽種群在最低，攀枝花種群最高；各種群在8個微衛(wèi)星位點上有效等位基因數(shù)的平均值為1.899 2～4.065 5，其中綿陽種群最低，攀枝花種群最高；各種群的Shannon信息指數(shù)為0.502 7～0.619 1；各種群的表觀雜合度為0.570 9～0.622 9；各種群的預期雜合度為0.555 6～0.616 1；西昌種群的基因多樣性指數(shù)最高為0.429 2，攀枝花種群的基因多樣性指數(shù)最低為0.315 1。各位點的等位基因表觀雜合度與預期雜合度基本一致，均相差不大，均符合Hardy-Weinberg平衡。

表2 5個紅火蟻地理種群在8個微衛(wèi)星位點的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of 5 geographical populations of Solenopsis invicta at 8 microsatellite sites

（續(xù) 表2）

2.4 5個紅火蟻地理種群的遺傳分化

結(jié)果表明（表3），四川省5個紅火蟻地理種群在8個微衛(wèi)星位點的種群內(nèi)近交系數(shù)為0.298 8～0.461 2，平均值為0.405 7；總近交系數(shù)為0.182 7～0.294 3，平均值為0.245 0。種群間分化系數(shù)為0.262 4～0.576 3，平均值為0.400 0，表明約60%的遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi)，約40%的遺傳變異發(fā)生在種群間。各種群的基因流為0.517 4～2.456 2，平均值為1.508 8，其中位點Sol-18的最低為0.517 4，位點Sol-20最高為2.456 2。四川省5個紅火蟻地理種群間的標準遺傳距離和遺傳相似度結(jié)果表明（表4），5個地理種群兩兩之間的遺傳相似度范圍為0.646 4～0.848 6，均大于0.6，這表示各種群間的基因交流較為頻繁。攀枝花種群和西昌種群之間的遺傳距離最小為0.164 2，綿陽種群和廣元種群之間的遺傳距離最大為0.432 8。

表3 各位點固定指數(shù)及基因流Table 3 The fixed index and gene flow of 8 microsatellite loci

表4 地理種群間Nei's標準遺傳距離（左下角）和遺傳相似度（右上角）Table 4 Nei's standard genetic distance(lower left)and genetic identity(upper right)among geographical populations

2.5 聚類分析

使用NTSYS-pc 2.1軟件對5個種群的遺傳距離進行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明（圖2），系統(tǒng)發(fā)育樹首先分為兩大分支，其中攀枝花種群與其它種群間的遺傳距離最遠，單獨為一個亞群；會理、廣元、綿陽、西昌4個種群為一個亞群。

圖2 地理種群的UPGMA聚類分析Figure 2 UPGMA cluster analysis of geographical populations

3 討論

3.1 四川省紅火蟻種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性的豐富與否直接影響了紅火蟻能否適應(yīng)復雜的環(huán)境變化[22]，多態(tài)位點百分率、Shan‐non信息指數(shù)及基因多樣性指數(shù)均是衡量種群遺傳多樣性的指標[23]。種群雜合度反映了地理種群的遺傳差異，種群雜合度的高低與群體的遺傳一致性成反比[21]。本次調(diào)查采集的樣品中，攀枝花種群和西昌種群的樣本量較多，其在8個SSR位點上所檢測出的有效等位基因數(shù)也最多，這與閆路娜和張德興[24]的研究結(jié)果一致。根據(jù)D.Botstein等[25]提出的多態(tài)位點百分率（P）作為衡量遺傳多樣性的一個重要指標：當P>50%時為高度多態(tài)位點；25%

3.2 四川省紅火蟻種群的遺傳分化

影響物種種群遺傳分化有多方面的因素，諸如有性生殖、體細胞突變、選擇、基因流、遺傳漂變及環(huán)境的影響[21]。本次調(diào)查的紅火蟻采集于不同生境，5個紅火蟻種群的種群間分化系數(shù)平均值達到0.4，表明種群間出現(xiàn)一定程度的遺傳變異。基因流是影響種群遺傳分化的一個重要因素[13]，基因流水平越高，種群間的遺傳分化程度越低，種群間遺傳趨于一致[15]。根據(jù)S.Wright[26]提出的：當種群間的基因流大于1時，可以抵制種群內(nèi)因遺傳漂變而引起的種群遺傳分化。本次研究中的5個紅火蟻種群在8個SSR位點上的基因流平均值為1.508 8，種群間基因交流頻繁，種群間較高的遺傳相似度（均大于0.6）也驗證了這一點。在黃奕雯等[12]的研究中，中國內(nèi)陸各省、香港及美國的紅火蟻種群間遺傳分化程度較高，可能受地理隔離影響。四川省河流極多，雨季漫長，為紅火蟻順水擴散和婚飛提供了有利條件[10]，地理隔離不能完全阻止紅火蟻在四川省的傳播擴散，各分布區(qū)間存在一定的基因交流。

3.3 四川省5個紅火蟻種群間的擴散途徑

利用種群間的遺傳距離可以估測其進化關(guān)系[14]，目前應(yīng)用較多的遺傳距離指標是M.Nei提出的Nei's標準遺傳距離[27]。國內(nèi)對于我國紅火蟻入侵擴散途徑已有一些報道：邵敬國等[14]推測我國紅火蟻入侵源可能是美國不同地區(qū)；黃奕雯等[12]認為地理距離較近的紅火蟻種群通過自然擴散形成，地理距離較遠的紅火蟻種群由人為傳播導致。根據(jù)Nei's標準遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖可以看出，會理、廣元、綿陽和西昌種群聚為一支，這些種群間地理距離較遠，推測可能是由人為傳播導致；攀枝花種群單獨聚為一支，推測攀枝花紅火蟻種群與四川省其它紅火蟻地理種群的入侵源不同。紅火蟻在自然條件下的遠距離傳播能力很弱[28]，在短時間內(nèi)不可能依靠自然傳播大面積擴散。由此看出，四川省紅火蟻各種群間不僅存在著受環(huán)境因素影響如：順水擴散、婚飛等導致的自然擴散；還存在著因各種人為因素如：苗木調(diào)運、長途貿(mào)易運輸?shù)葘е碌拈L距離種群擴散。

4 結(jié)論

紅火蟻在攀西地區(qū)報道發(fā)生已有近10年歷史，在四川省其它地區(qū)僅近幾年零星發(fā)生且很快撲滅，但這已為四川省的紅火蟻防控敲響警鐘。本試驗利用SSR分子標記對四川省紅火蟻地理種群進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)：5個紅火蟻地理種群間具有豐富的遺傳多樣性，遺傳分化程度不高，自然擴散和人為傳播并存。建議應(yīng)加強對目前已有紅火蟻疫區(qū)尤其是攀西地區(qū)的監(jiān)控與防治，嚴防紅火蟻在雨季的大量繁殖擴散，加強檢疫工作防止紅火蟻因人為傳播導致的遠距離擴散。