謝韻 帕麗達·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

曲霉病是由曲霉屬真菌，如煙曲霉(85%)、黃曲霉(5%～10%)、土曲霉(2%～10%)和黑曲霉(2%～3%)引起的一組疾病。它可引起過敏性疾病，如過敏性鼻竇炎或過敏性支氣管肺曲霉病，還可引起皮膚曲霉病、曲霉球、慢性肺曲霉病等臨床疾病[1]。就患者結局和疾病管理而言，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)是曲霉病最為嚴重的臨床表現(xiàn)形式[2]。據報道，IA在極少數(shù)情況下會發(fā)生于免疫功能正常的患者[3-4]，主要見于惡性腫瘤或接受化療、皮質類固醇和器官移植等免疫功能低下患者[5-6]。醫(yī)學進步提高了免疫抑制條件下患者的生存率，但增加了IA的感染風險[7-8]。煙曲霉是曲霉病的主要病原真菌，但近二十年來，除煙曲霉外，其他曲霉屬的分離率也越來越高。這一轉變歸因于免疫缺陷患者數(shù)量的增加、病原真菌檢測和鑒定的進步以及廣譜抗真菌藥物的廣泛使用。曲霉的鑒定通常是宏觀和微觀形態(tài)特征的判定[9]，這些方法難以將罕見曲霉菌種與其他相關菌種區(qū)分[10-11]。有一些罕見曲霉菌種如A.calidoustus和A.lentulus對多種抗真菌藥物敏感性降低[12-13]。因此實驗室需正確鑒定菌種、完善藥敏試驗結果以指導選擇合適的抗真菌藥。

1 流行情況

煙曲霉是臨床上分離率最高的曲霉，黑曲霉、黃曲霉和土曲霉分離頻率比煙曲霉低。以IA為對象的研究也表明，這4個菌種的分離頻率較高[14]。Balajee等[15](以下簡稱TRANSNET研究)和Alastruey-Izquierdo等[16](以下簡稱FILPOP研究)，分別報告了200多個曲霉臨床分離株的分析結果。在TRANSNET研究中，通過DNA序列鑒定，從美國移植受者中分離出208株曲霉，其中11%被鑒定為罕見曲霉菌屬[15]。FILPOP研究顯示，從深部組織、血液培養(yǎng)和呼吸器官中分離的323個菌株中，大約15%是Aspergilluslentulus、Aspergillustubingensis、Aspergilluscalidoustus、Aspergillusalliaceus等罕見菌種[16]。美國德克薩斯大學實驗室分離了37株曲霉，對臨床上相對少見的屬部分進行初步鑒定。其中13個種為罕見菌種[17]。從韓國9所大學醫(yī)院分離334株曲霉臨床株，通過ITS區(qū)和D1/D2區(qū)序列測定[18]，僅β-微管蛋白測序就可鑒定出77株(23.1%)罕見曲霉臨床分離株。這些菌種真實流行率尚不清楚，需要進一步擴大人群數(shù)量。過去幾十年，因為鑒別水平有限且分子檢測尙不能作為常規(guī)檢測方法，造成實驗室中的分離株被錯誤鑒定。罕見曲霉病的發(fā)生率往往比實際數(shù)據要高得多。

2 罕見曲霉的發(fā)現(xiàn)

罕見曲霉的故事始于A.lentulus[19]。Balajee及其同事調查了7株非典型煙曲霉臨床分離株，它們產孢速度緩慢，對幾種抗真菌藥物的體外敏感性較低。通過多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，發(fā)現(xiàn)其中4個菌株屬于一個新的真菌種，命名為A.lentulus[19]。2013年的一則文獻[19]報告了1例腎移植患者在移植4個月后感染肺炎，接受伏立康唑治療后痊愈(MIC為0.5 μg/mL)，并從他的痰液中收集到A.lentulus。文獻還提到了另外5例A.lentulus[20]的病例，但抗真菌治療的實驗室數(shù)據和臨床信息有限。A.lentulus發(fā)現(xiàn)后不久，煙曲霉屬部分出現(xiàn)了一個新菌種Neosartoryapseudofischeri(N.pseudofischeri)[20]。根據“一種真菌，一個名字”的倡議，現(xiàn)在被稱為A.theromutatus[1]。實際上Balajee等[21]通過研究3株產孢量較差的煙曲霉分離株尋找A.lentulus。但在其中2例患有囊性纖維化患者的痰液中分離出A.theromutatus。自1929年以來，只有7例IA與A.theromutatus有關，其中3例沒有抗真菌治療的信息[21]。隨著A.lentulus和A.theromutatus的出現(xiàn)，罕見曲霉屬菌種呈指數(shù)增加。

3 曲霉的鑒定

重癥監(jiān)護室IA患者的死亡率可高達90%，但如果診斷及時，IA的總死亡率可下降至50%[22]。真菌培養(yǎng)是菌種診斷的“黃金標準”。但其根據形態(tài)診斷的敏感度和特異度有限，僅憑組織病理學很難做出物種水平的鑒定[23]。此外，真菌培養(yǎng)的生長周期較長，需要幾天到幾周的時間。這可能導致抗真菌治療的延遲和選擇不適合的藥物。曲霉臨床分離株在形態(tài)上有時容易混淆且專業(yè)性強，錯誤鑒定菌種的情況時常發(fā)生[9]。因此，迫切需要開發(fā)快速、無創(chuàng)和準確的鑒定技術，從形態(tài)、生長溫度、藥物敏感性和分子表型等幾個方面[24]進行菌種鑒定。

3.1 DNA測序

rDNA內部轉錄間隔區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)的序列分析是真菌中最常見的測序標記，一直被認為真菌的官方DNA條形碼[25]，所涉及的引物幾乎可以與任何真菌DNA雜交。國際人與動物真菌病協(xié)會為臨床真菌鑒定，提供了一個ITS序列數(shù)據庫[26]。但曲霉屬的ITS區(qū)域沒有足夠的多態(tài)性，需要一個二級識別標記鑒定給定的菌種。鈣調蛋白、β-微管蛋白和肌動蛋白都是曲霉分類中的關鍵基因，與ITS結合可準確鑒定曲霉屬[27]。該方法關于真菌測序的有限數(shù)據不到1%、數(shù)據庫中的注釋錯誤以及廣泛用于擴增β-微管蛋白基因的引物對benA基因沒有特異性，存在一定的局限性，進而導致不一致分類樹的產生[28]。測序既昂貴又耗時，因此很少有臨床實驗室常規(guī)開展。

3.2 MLST

MLST依賴管家基因編碼區(qū)內的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以確保給定菌種的每個分離株都得到正確的擴增[29]。一些進化限制有望限制這類必需基因的突變，但管家基因的核苷酸變化率預計足以區(qū)分不同的菌株。MLST的初步步驟是在側翼非可變區(qū)的測試位點外設計引物，經PCR擴增和Sanger測序后，點突變分別確定單倍體或二倍體微生物序列類型(ST)或二倍體序列類型(DST)。該方法具有實用性，前提是序列具有足夠的質量。在處理從培養(yǎng)中獲得的純菌落時，MLST沒有技術上的限制。但Sanger測序直接從臨床樣本中進行基因分型，MLST分型對混合物的檢出率很低，無法檢測到20%～30%以下的少數(shù)等位基因[30]。

3.3 MALDI-TOF MS質譜鑒定

物種水平鑒定需要對ITS序列以及β-微管蛋白或鈣調蛋白基因進行核酸擴增和測序分析，大多數(shù)實驗室不具備以上條件[31]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)在快速準確地區(qū)分煙曲霉和其他曲霉方面結果可觀[32]。MALDI-TOF MS能獲得高精度的絲狀真菌鑒定結果，這在以前僅限于少數(shù)幾個參考實驗室。Alanio等[33]描述了MALDI-TOF MS對罕見曲霉的鑒定，開發(fā)了一個參考光譜數(shù)據庫，包括來自7個曲霉切片的28個臨床相關菌種，其中有5個常見菌種和23個新菌種。同時，Normand等[34]描述了一種標準化的方法識別任一類型的絲狀真菌，通過增加參考譜庫中的參考文獻數(shù)量，成功地解決了從混合絲狀真菌培養(yǎng)物中獲得異質MALDI-TOF光譜的關鍵問題。該步驟顯著提高了MALDI-TOF MS鑒定臨床絲狀真菌的有效性。經過對大量絲狀真菌分類群的進一步研究，驗證了標準化的MALDI-TOF MS程序在物種水平上準確識別臨床相關曲霉的能力，包括罕見曲霉菌種[35-37]。臨床實驗室的MALDI-TOF MS網絡代表了該領域最近的重大發(fā)展。這一進展對于沒有配備MALDI-TOF MS系統(tǒng)的實驗室特別有用。這類實驗室可以準備MALDI-TOF MS靶板，并將其發(fā)送到MALDI-TOF鑒定平臺，之后通過專用軟件接收結果[38]。鑒定質量直接取決于所用數(shù)據庫的范圍。Bruker的第一個商業(yè)模型數(shù)據庫是絲狀真菌庫1.0[39]，一些作者[16，35]曾試圖使用這個商業(yè)數(shù)據庫來鑒定曲霉屬，但由于引進的種和菌株數(shù)量較少，結果并不令人滿意。西班牙的學者，花了兩年的時間，為絲狀真菌庫1.0補充了一個內部參考數(shù)據庫(HUVr)，并通過對固體培養(yǎng)基上生長的曲霉臨床分離株進行鑒定來驗證有效性[40]。研究結果顯示：HUVr數(shù)據庫增加了23個菌種的53個條目，可以收錄12個新型罕見菌種，并增加已經收錄的11個菌種的條目數(shù)量。而絲狀真菌庫1.0只提供了7個罕見菌種，分別占每個文庫所含菌種總數(shù)的69.6%和38.9%。最后，補充的文庫有142個條目，可以從11個部分鑒定出30種不同的曲霉：11個非罕見種和19個罕見種。通過前瞻性研究表明，無論介質類型(即固體或液體)，MALDI-TOF MS中HUVr數(shù)據庫的使用具有較高的可靠性。95.5%的菌株在種水平上進行了鑒定，其余4.5%的菌株在屬水平上進行了鑒定。如果Schulthess等[41]在沒有增加錯誤識別的情況下進行標準評分，物種水平上的鑒定就會達到100%。法國作者通過一個獨立的、可自由訪問的在線質譜數(shù)據庫，前瞻性地評估不同實驗室中罕見曲霉菌種的鑒定準確性。鑒定結果與序列鑒定結果進行對比：在物種水平上，罕見曲霉菌種的整體準確率為66.1%，非罕見菌種的準確率為92.2%[42]。在MALDI-TOF MS中創(chuàng)建數(shù)據庫是一個緩慢而昂貴的過程，但如果想要獲得更好的鑒別能力，就有必要這樣做。以上學者的研究，提高了實驗室曲霉菌種的鑒定水平。這些研究成果可作為真菌實驗室的常規(guī)絲狀真菌鑒定，以提高臨床相關曲霉菌種鑒定的準確性，并顯著縮短反應時間。然而，這種技術價格昂貴，不能廣泛使用，而且需要訓練有素的人員才能操作。

4 藥敏情況

就目前曲霉病管理指南所述，伏立康唑(VCZ)被推薦為IA的一線用藥，兩性霉素B(AMB)或異伍康唑(ISA)用于替代治療。近年來唑類耐藥菌株數(shù)量逐漸增加，其臨床治療效果并不理想。Pinto等[43]對190個煙曲霉分離株進行耐藥觀察，氮唑類對煙曲霉的MIC較高。AMB對黃曲霉和土曲霉有較高的MIC，81%的黃曲霉MIC≥2 mg/L[44]。而伊曲康唑(ITZ)對黑曲霉有較高的MIC(4 mg/L)，對AMB未顯示出抗藥性，這在以前的文獻中也有描述[45]。

隨著分子技術的革新，許多新的罕見曲霉被發(fā)現(xiàn)。如前文所述，其流行率為10%～15%，對唑類和AMB的敏感性很低[46]。但罕見曲霉的各研究數(shù)據存在異質性或不完整性，應該謹慎評估其抗真菌敏感性表型。有文獻指出[23,47]，A.lentulus對唑類、AMB和棘球菌素類藥物的敏感性降低；A.tubingensis對ITZ的抗藥性比黑曲霉高，但與其他唑類化合物的交叉抗藥性或對其他抗真菌藥物的抗藥性似乎很少見；A.Calidoustus對阿尼芬凈、米卡芬凈、AMB和特比萘芬的敏感度較低，但VCZ的MIC往往較高，而A.Ustus處于較低水平；AMB和卡泊芬凈對A.alliaceus有較高的MIC，而VCZ和ITZ對該菌種的MIC通常較低。因此，正確鑒定臨床分離株是使用最佳抗真菌藥物的關鍵。

5 總 結

臨床罕見曲霉菌屬報告的增加和特殊人群(如危重患者)IA感染的報道，讓醫(yī)生們認識到種水平上準確鑒定真菌的必要性。MLST和MALDI-TOF MS提供了準確鑒定常見和罕見曲霉的方法。其中一些未知的曲霉對抗真菌藥物有特殊的耐藥性，識別錯誤會導致治療不佳和預后不良。它們表現(xiàn)出很高(高達40%)的抗真菌耐藥性，其標準化管理有特殊的臨床意義。常見曲霉感染與罕見曲霉感染，兩者治療結果是否有差別，有待臨床進一步驗證。但罕見曲霉較高的抗真菌耐藥性和死亡率頻繁被報道[32,47,48]，有必要對臨床分離的真菌進行正確的菌種鑒定和藥敏試驗。形態(tài)學的鑒定大多僅限于物種復合水平，新的鑒定技術將會更好更規(guī)范的進入到常規(guī)臨床實驗室?，F(xiàn)今關于罕見曲霉治療的臨床數(shù)據非常有限，在治療上是一個挑戰(zhàn)，但也不要過度恐慌，早預防、早診斷結合體外藥敏試驗和分子技術，可更科學地治療，提高患者生存率。