劉浩，王磊，陳志遠，劉修恒

武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，武漢 430060

缺血再灌注損傷是指器官和組織血供暫時中斷或減少造成糖氧剝奪、營養(yǎng)物質(zhì)缺失，引起缺血損傷，在血流恢復(fù)灌注，組織損傷進一步加重的現(xiàn)象。導(dǎo)致腎臟缺血的原因主要有心血管系統(tǒng)循環(huán)障礙（卒中、心肌梗死等）、夾閉腎臟血管的外科操作（腎移植、腎部分切除等）［1］。腎缺血再灌注損傷是造成急性腎損傷、延遲性腎功能恢復(fù)、供體腎臟排斥反應(yīng)、慢性腎損傷等并發(fā)癥的主要病因之一，也是影響公眾健康問題的主要原因之一。然而，目前仍然缺乏有效的治療手段應(yīng)對缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷后由于機體抗氧化應(yīng)激調(diào)控系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致組織細胞內(nèi)蓄積大量活性氧（ROS），這是介導(dǎo)組織再灌注損傷加重的重要原因之一。目前大量的基礎(chǔ)和臨床前研究將氧化應(yīng)激損傷作為腎缺血再灌注損傷的重要機制進行藥物治療的探索［2］。

1 ROS的生成途徑

在腎移植等外科手術(shù)中，血流灌注突然中斷造成腎臟缺血性損傷，此階段稱之為熱缺血損傷期。當(dāng)氧供低于機體對氧氣需求的臨界值時，會造成三磷酸腺苷（ATP）生成低于維持細胞正常功能所需［3］。以上的病理基礎(chǔ)會促使細胞進行無氧代謝，抑制有氧代謝并破壞ATP的正常產(chǎn)生，生成大量的ROS，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷［4］。

O2生成H2O的過程被認為是機體細胞通過一系列酶類催化的氧化還原反應(yīng)，其本質(zhì)是電子傳遞的過程。在氧化還原反應(yīng)的過程中會產(chǎn)生初級自由基的中間還原代謝產(chǎn)物，如超氧陰離子、羥自由基以及非自由基的氧化衍生物，這些具有氧化活性的氧自由基和非自由基衍生物統(tǒng)稱為ROS。這些產(chǎn)物攜帶有一個負電子，這個特征使其極不穩(wěn)定，容易使氧自由基和非自由基衍生物易氧化其他大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA等發(fā)生相互作用［5］。ROS在細胞內(nèi)的清除和蓄積之間的平衡主要依賴于抗氧化系統(tǒng)：①螯合過渡金屬：包括鐵和銅等，這些物質(zhì)與H2O2發(fā)生反應(yīng)并生成羥自由基（芬頓反應(yīng)），因此可以通過螯合這些過渡的金屬物質(zhì)抑制羥自由基的產(chǎn)生；②抗氧化酶類：線粒體中的Mn-SOD和細胞質(zhì)中的Cu/Zn-SOD等超氧化物歧化酶能夠清除超氧陰離子，此外過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶能夠?qū)⑦^氧化氫催化水解成為H2O［6］

1.1 線粒體來源ROS的生成機制 細胞內(nèi)大約90%的ROS由線粒體產(chǎn)生。導(dǎo)致ROS細胞內(nèi)蓄積主要原因如下：①ROS大量產(chǎn)生：在機體衰老、動脈粥樣硬化、惡病質(zhì)、細胞氧供障礙等病理因素刺激時，大量的ROS蓄積超過了細胞自身的清除能力；②抗氧化能力下降：有研究表明，肥胖患者、長期大量抽煙人群其抗氧化能力普遍下降［7］?？寡趸到y(tǒng)功能異常時，ROS大量蓄積在細胞內(nèi)，造成生物大分子物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)等氧化損傷，最終引起細胞功能障礙和死亡。在眾多關(guān)于缺血再灌注損傷的機制研究中，線粒體作為ROS的主要來源細胞器，在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷中具有重要的作用。線粒體功能受損以及能量代謝異常也是造成腎缺血再灌注損傷的重要機制之一。在腎臟缺血階段，氧氣供應(yīng)不足可直接破壞線粒體偶聯(lián)，從而導(dǎo)致線粒體有氧代謝呼吸鏈中電子傳遞異常，引起ATP生成障礙，進一步加重ROS在細胞內(nèi)蓄積［2］。

線粒體內(nèi)膜主要完成ATP合成以及氧化磷酸化過程，通過復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ、電子轉(zhuǎn)運蛋白如輔酶Q和細胞色素C組成的電子傳遞鏈主要定位于線粒體內(nèi)膜，其功能是介導(dǎo)有氧代謝完成。電子從復(fù)合物Ⅰ傳遞到復(fù)合物Ⅳ并伴隨著線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)間形成電子梯度層［8］。在這個傳遞過程中，1%～5%的電子會脫離正常的電子傳遞鏈形成ROS，這部分脫離電子傳遞鏈產(chǎn)生的ROS在細胞內(nèi)會被抗氧化和解毒系統(tǒng)清除［9］。

腎臟缺血期間，復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ由于組織缺氧導(dǎo)致其功能和活性發(fā)生改變，大量電子在傳遞的過程中逃逸，促使過量的ROS生成并蓄積在細胞內(nèi)［10］。其中，復(fù)合物Ⅰ功能異常產(chǎn)生的超氧陰離子可以通過還原型/氧化型輔酶Ⅰ（NADH/NAD+）清除或高線粒體膜電位進行中和。較高的線粒體膜電位使運輸電子的載體減少并且促使電子進入氧化呼吸鏈中，但在缺氧時線粒體膜電位也會相應(yīng)地下降，間接促進超氧陰離子產(chǎn)生。復(fù)合物Ⅲ功能異常時，醌的氧化-還原循環(huán)會衍生出極其不穩(wěn)定的半醌中間體，隨著電子傳遞鏈自由移動，促進電子結(jié)合氧氣分子，生成超氧陰離子［11］。當(dāng)腎臟恢復(fù)高灌注后，細胞有氧代謝和過度氧合會造成線粒體復(fù)合物I和III功能損傷，反而進一步增加ROS在細胞中蓄積［4］。

1.2 非線粒體來源ROS生成的關(guān)鍵酶

1.2.1 黃嘌呤氧化酶 黃嘌呤氧化酶有兩種亞型，即黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶，分別可以利用NAD+和氧氣作為電子受體發(fā)揮作用。黃嘌呤脫氫酶可以通過次黃嘌呤氧化生成NDAH，黃嘌呤則在尿酸中被黃嘌呤氧化酶氧化并伴隨過氧陰離子的產(chǎn)生。腎臟缺血引起細胞ATP生成下降并促使黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化。恢復(fù)血供后，氧氣和黃嘌呤氧化酶發(fā)生作用促使ROS產(chǎn)生并蓄積在細胞內(nèi)［2］。

1.2.2 NADPH氧化酶 NADPH氧化酶（NOX）家族包括7種亞型，即NOX1-5、DUOX1和DUOX2，作用是將電子進行跨細胞膜運輸。缺血再灌注損傷時，NADPH氧化酶促進ROS（主要是超氧陰離子）的生成［12］。超氧陰離子作為生成過氧化氫的原材料，在NAPDH氧化酶的催化下與其他底物發(fā)生反應(yīng)最終生成具有細胞毒性的過氧化氫。NADPH氧化酶在腎組織的表達具有組織特異性，即腎組織優(yōu)先表達NOX1、NOX2以及NOX4［12］。研究表明，在腎缺血再灌注損傷時，NOX4表達會顯著增加并促使大量ROS的生成［13］。除了在缺血再灌注損傷發(fā)揮相應(yīng)的作用，NOX4也參與調(diào)節(jié)腎慢性纖維化中ROS的生成，抑制NOX4后也能明顯減緩腎梗阻性腎纖維化的進程［14］。

1.2.3 一氧化氮合成酶（NOS）NOS除了參與一氧化氮的生成外，還參與調(diào)節(jié)ROS的生成。值得注意的是，在一些特殊情況下如四氫葉酸蝶呤輔助因子缺乏、NOS單體化等，NOS活性會發(fā)生改變，可促進生成超氧陰離子［15］。有文獻報道，在缺血再灌注損傷時NOS能夠促進ROS的生成［4］。

2 ROS在腎缺血再灌注損傷治療中的作用

2.1 拮抗ROS的相關(guān)通路 目前在腎缺血再灌注損傷中研究最多的拮抗ROS的信號通路包括缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）與核樣因子2/kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（NRF2/KEAP1）信號通路，兩者在細胞應(yīng)對ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷時發(fā)揮重要作用。

2.1.1 HIF 細胞內(nèi)大量蓄積的ROS能夠激活HIF，后者使細胞內(nèi)下游抗氧化應(yīng)激基因激活，從而促進細胞抵抗外環(huán)境的應(yīng)激損傷。

2.1.1.1 HIF的調(diào)控機制及分類 HIF是缺氧轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下可以調(diào)節(jié)紅細胞生成素、代謝速率、新生血管形成等生理活動［16］。在哺乳動物細胞內(nèi)，HIF分為兩個亞基，即氧敏感亞基HIF-α和細胞內(nèi)可持續(xù)表達的HIF-β亞基。在機體細胞正常情況下，由于氧供充足HIF-α亞基被氧和鐵依賴性脯氨酰羥化酶羥化，羥基化后的HIF-α能夠被von Hippel-Lindau-E3泛素連接酶復(fù)合物識別并降解，因此細胞常氧情況下HIF-α保持低豐度［17］。當(dāng)細胞應(yīng)激如缺氧，脯氨酰羥化酶活性降低，不能催化HIF-α亞基羥基化，抑制von Hippel-Lindau-E3泛素連接酶復(fù)合物與HIF-α結(jié)合，HIF-α蛋白穩(wěn)定性增加。缺氧時，核轉(zhuǎn)位序列引導(dǎo)HIF-α進入細胞核內(nèi)并與相應(yīng)的β亞基二聚化，二聚體結(jié)構(gòu)有利于結(jié)合到缺氧反應(yīng)原件上，激活下游基因。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIF-α有三種不同的亞型，包括HIF-1α、HIF-2α以及HIF-3α。這三種不同的亞型的表達具有細胞特異性和氧氣依賴性：HIF-1α幾乎在一切有核細胞中表達，可能參與急性應(yīng)激反應(yīng)；HIF-2α在腦組織、血管內(nèi)皮和Ⅱ型肺細胞中表達，主要與一些慢性反應(yīng)有關(guān)；HIF-3α主要在腦、肺、心臟、肝臟以及腎臟等血供十分豐富的臟器組織表達。

2.1.1.2 HIF對ROS的調(diào)控作用 上述提到HIF信號通路在缺氧時被激活并在缺氧條件下進入細胞核內(nèi)與缺氧反應(yīng)元件相關(guān)的基因結(jié)合，因此有利于代謝適應(yīng)和細胞生存，在腎缺血再灌注損傷過程中具有重要的意義［18］。在腎臟組織中，HIF-1α主要在上皮細胞發(fā)揮作用，HIF-2α在間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用［19］。缺氧持續(xù)存在的情況下，HIF-α還可以拮抗炎癥反應(yīng)相關(guān)通路和氧化還原通路［20］。

2.1.2 NRF2/KEAP1信號通路 NRF2主要表達和定位于細胞核內(nèi)，是缺氧時被激活的主要調(diào)節(jié)基因之一，其作用是調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)，調(diào)控與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因，包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、參與NADPH產(chǎn)生和血紅素代謝的酶［21］。目前研究最多的關(guān)于NRF2執(zhí)行其相關(guān)抗氧化應(yīng)激功能的機制主要著重于NRF2/KEAP1調(diào)節(jié)系統(tǒng)的功能。NRF2/KEAP1信號通路在細胞受到內(nèi)外環(huán)境的應(yīng)激刺激如缺氧時起到增強細胞適應(yīng)生存的能力，因此是組織缺氧時抵抗氧化應(yīng)激損傷主要的反應(yīng)元件之一。與HIF表達相似，NRF2在真核生物細胞內(nèi)也持續(xù)表達，但由于細胞內(nèi)具有NRF2特異性的泛素降解酶系統(tǒng)，保證了在細胞正常情況下只存在低水平豐度。KEAP1含有半胱氨酸硫醇，后者可感知細胞內(nèi)在氧化應(yīng)激時所產(chǎn)生的生物活性自由基，如氧自由基、羥自由基等［22］。NRF2在腎缺血再灌注損傷的灌注期間被激活，而這種應(yīng)激性激活還不足以減輕氧化應(yīng)激損傷，因此將NRF2作為基因治療靶點進一步激活并上調(diào)其表達可能有助于減輕損傷。應(yīng)激性的激活NRF2芮然不足以減輕缺血再灌注損時導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，但失活或者抑制NRF2能夠明顯加重腎臟缺血再灌注損傷［23］。

2.2 相關(guān)藥物

2.2.1 HIF信號通路激活劑 研究表明，缺血預(yù)處理可以提前激活HIF信號通路，有利于預(yù)防和治療腎缺血再灌注損傷［24］。此外，針對HIF研發(fā)的相關(guān)激活劑有望成為有效的治療手段，如通過鐵螯合劑、鐵競爭物或其他脯氨酰羥化酶抑制劑抑制鐵依賴性脯氨酰羥化酶活性，能夠減少HIF泛素化降解增加其蛋白穩(wěn)定性。去鐵胺是一種特異性的鐵螯合抑制劑，常用于治療鐵過載以及β-地中海貧血，在實驗動物模型中注射去鐵胺能夠有效地減輕缺血再灌注損傷［25］。此外，氯化鈷是公認的缺氧模擬劑，主要在脯氨酰羥化酶的活性位點內(nèi)與鐵競爭或在膜轉(zhuǎn)運蛋白水平上抑制脯氨酰羥化酶活性，從而限制鐵流入。

2.2.2 NRF2信號通路激活劑 NRF2信號通路激活劑CDDO-咪唑啉、CDDO-甲酯都是三萜類化合物，能夠與KEAP1的半胱氨酸殘基共價結(jié)合，從而促進KEAP1與NRF2的結(jié)合。有研究證實，從腎臟缺血前24 h到腎臟缺血后24 h，CDDO-咪唑每天治療可有效減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷，而在缺血后1 d進行1次治療，則對小鼠腎臟損傷無顯著治療左右，其具體原因不詳［26］。

ROS是缺血和再灌注期間產(chǎn)生的活性物質(zhì)，其中線粒體作為其主要來源，在腎缺血再灌注損傷時具有重要的靶向治療作用。同時，催化非線粒體來源ROS的關(guān)鍵酶如黃嘌呤氧化酶等也具有重要的藥理學(xué)意義。在眾多調(diào)控機制中，拮抗ROS的信號通路或者分子（HIF和NRF2/KEAP1等），無論是在動物實驗水平還是在臨床運用上都已做了相關(guān)研究，但由于其作用機制還不明確，因此還需要進一步的基礎(chǔ)研究加以驗證。以上研究主要集中在ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷以及細胞功能障礙的理論研究，為臨床實踐提供了新的治療思路。