吳麗雯，龍 瀾，袁名遠(yuǎn)，郭 陽(yáng)，羅 凱*，張 強(qiáng)#

(1.湖北民族大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715)

硒是生物體必需的微量元素之一[1]，它在生物體內(nèi)具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、防克山病和大骨節(jié)病等多種重要生理功能[2-8].硒攝入不足或過(guò)多都會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[9]，如硒缺乏會(huì)導(dǎo)致人體抗氧化功能障礙[10].科學(xué)膳食補(bǔ)硒是一種有效、安全的補(bǔ)硒形式，可通過(guò)植物轉(zhuǎn)化、動(dòng)物轉(zhuǎn)化、微生物轉(zhuǎn)化等途徑將有毒的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全的有機(jī)硒[11].硒蛋白是植物中有機(jī)硒的主要存在形態(tài)之一[12]，通常能以水、鹽、酸、堿、酶、醇等化學(xué)方法、物理方法和其他輔助方法提取[13].

四季豆(Kidney bean)是普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的中文別名；在分類學(xué)上屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoidae)菜豆族(Phaseoleae)菜豆屬(Phaseolus)菜豆種，是一種一年生草本植物[14].四季豆原產(chǎn)于中南美洲，15世紀(jì)后傳入中國(guó).由于其對(duì)土壤具有廣泛適應(yīng)性，在我國(guó)各地均有種植[15].四季豆既可作為有嫩莢的蔬菜食用，其干籽也可作為散裝食品食用，倍受大眾青睞；這是歸因于其嫩莢和干籽粒中均含有人體所必需的8種氨基酸以及其他豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[16-17].

四季豆葉片是一種潛在的蛋白質(zhì)資源，生物量大，品質(zhì)好.然而，收獲四季豆果實(shí)后，除小部分葉片可用作禽畜飼料外，其余大部分都被丟棄或者焚燒，因此造成了環(huán)境污染和資源浪費(fèi).目前，關(guān)于富硒四季豆葉蛋白(leaf protein of selenium-enriched kidney bean，SKP)的提取及其抗氧化活性研究的報(bào)道很少.本研究結(jié)合恩施州富硒的特點(diǎn)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了恩施地區(qū)SKP的堿提酸沉提取工藝，并研究了其體外抗氧化活性，以期為進(jìn)一步開發(fā)SKP、提高其生物價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供參考.

1 材料與方法

1.1 原料

選用恩施本地四季豆(自留種)葉片，由恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.采用葉面噴施硒肥的方法對(duì)四季豆葉片進(jìn)行富硒處理，噴施硒溶液的質(zhì)量濃度為0.048 g/m2(以硒計(jì))，從苗期到開花前噴施硒肥5次，每次間隔7天，均勻噴灑至葉片上.

1.2 主要試劑

包括考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，由上海源葉生物公司提供;硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,由國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供;鹽酸、硝酸為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 主要儀器與設(shè)備

包括粉碎機(jī)(德清拜杰電器有限公司，BJ-800A)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗公司，DHG-9243BS-Ⅲ)、分析天平(德國(guó)Sartorius公司，BS-124S)、pH計(jì)(梅特勒公司，F(xiàn)E20K)、離心機(jī)(湖南湘立公司，TG16-WS/CenLee20R)、真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝公司，S-18N)、凱氏定氮儀(海能公司，K9840)、紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司，UV-1900)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司，Spectra Max190)、雙道原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器公司，AFS-9760).

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[18]繪制牛血清蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=0.005 5x+0.001 2，R2=0.999 6.

1.4.2 SKP提取工藝流程 堿提酸沉法不僅是提取植物葉片粗蛋白應(yīng)用最多的方法[19]，也是適用于植物體內(nèi)硒蛋白提取的方法[20].參考李雪[21]的方法并改進(jìn)提取SKP：將富硒四季豆葉片采摘后于80 ℃烘箱中烘干，粉碎過(guò)80目篩；取一定量過(guò)篩后的富硒四季豆葉粉，溶于適量濃度的NaOH溶液，適當(dāng)溫度下加熱浸提2 h，再經(jīng)6 000 r/min離心處理20 min取上清液；之后采用最佳等電點(diǎn)法加入乙酸酸沉過(guò)夜，再經(jīng)8 000 r/min離心處理10 min取沉淀物；最后將沉淀物提前預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到SKP粉末.

1.4.3 SKP提取率的測(cè)定 采用1.4.1中的Bradford法，測(cè)試堿提離心后的富硒四季豆葉片上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量，根據(jù)測(cè)得的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量.SKP的蛋白質(zhì)總含量按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(GB 5009.5-2016)中凱式定氮法測(cè)定[22]，其蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(53.46±0.09)%，SKP提取率計(jì)算公式為E=m1/m2×100%.式中：E為SKP提取率(%)；m1為上清液中SKP總量(mg)；m2為SKP總量(mg).

1.4.4 總硒含量的測(cè)定 參考《食品中硒含量的測(cè)定》(GB 5009.93-2017)，采用氫化物-原子熒光光譜法[23]測(cè)定富硒四季豆葉粉原料和堿提酸沉工藝最優(yōu)條件下蛋白質(zhì)中的總硒：C=m3/m4.式中：C為總硒含量(μg/g)；m3為樣品中硒的質(zhì)量(μg)；m4為樣品質(zhì)量(g).

1.4.5 SKP提取單因素試驗(yàn) 固定提取溫度為60 ℃、料液比為1∶30 g/mL、NaOH溶液濃度為0.1 mol/L，考察提取時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)對(duì)SKP提取率的影響；固定提取時(shí)間為120 min、料液比為1∶30 g/mL、NaOH溶液濃度為0.1 mol/L，考察提取溫度(50、55、60、65、70 ℃)對(duì)SKP提取率的影響；固定提取時(shí)間為120 min、提取溫度為60 ℃、NaOH溶液濃度為0.1 mol/L，考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)SKP提取率的影響；固定提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為120 min、料液比為1∶20 g/mL，考察NaOH溶液濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L)對(duì)SKP提取率的影響.

1.4.6 SKP提取響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 考慮到堿提酸沉法是先堿提后酸沉分步進(jìn)行的，所以在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取時(shí)間A(min)、提取溫度B(℃)、料液比C(g/mL)、NaOH濃度D(mol/L)為考察自變量，以SKP提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，得到優(yōu)化提取SKP工藝的最佳參數(shù)；在最佳提取工藝參數(shù)下再確定酸沉的最適宜pH值.

1.4.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)工藝，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)并重復(fù)3次，以驗(yàn)證工藝的可靠性和穩(wěn)定性.

1.4.8 SKP等電點(diǎn)的確定 參考文獻(xiàn)[24]并改進(jìn)，在SKP提取工藝的最佳條件下測(cè)試其等電點(diǎn)，分別取SKP堿提液5份，每份10 mL，用乙酸將pH值調(diào)整為4.2、4.3、4.4、4.5、4.6；靜置1 h后，通過(guò)離心處理(8 000 r/min，10 min)收集上清液，用Bradford法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的殘留量.

1.4.9 氨基酸組成分析 按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中氨基酸的測(cè)定》(GB 5009.124-2016)[25]測(cè)定SKP粉末中的氨基酸組成.

1.4.10 SKP體外抗氧化活性測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考倪慶圓[26]、Ahn等[27]的方法并加以改進(jìn).ABTS自由基清除能力的測(cè)定參考Perez等[28]的方法并加以改進(jìn)；羥基自由基清除能力的測(cè)定參考Mojica等[29]的方法并加以改進(jìn)；超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定參考金小乂等[30]的方法并加以改進(jìn).4種自由基的清除率計(jì)算公式為：A=[1-(A2-A0)/A1]×100%.式中：A為自由基清除率(%)；A2為樣品組吸光值；A1為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值.

1.5 數(shù)據(jù)處理

單次試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，使用Excel 2017處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 16.0進(jìn)行顯著性分析，使用OriginPro 9.1繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 總硒和蛋白質(zhì)的測(cè)定

結(jié)果表明，亞硒酸鈉溶液在0～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與熒光值有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=93.923x-5.395，R2=0.999 8.此條件下測(cè)得富硒四季豆葉片總硒和堿提酸沉工藝最優(yōu)條件下SKP的總硒含量分別為(1.40±0.10)μg/g、(2.29±0.06)μg/g，均達(dá)到《富硒含硒食品與相關(guān)產(chǎn)品硒含量標(biāo)準(zhǔn)》(DB61/T 556-2018)中規(guī)定.采用凱式定氮法測(cè)定富硒四季豆葉片、堿提酸沉工藝最優(yōu)條件下的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為(26.02±0.14)%、(53.46±0.09)%；說(shuō)明SKP是一種良好的植物蛋白資源，可進(jìn)一步開展分離純化研究.

2.2 SKP提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響 如圖1(a)所示，隨著浸提時(shí)間的增加，SKP的提取率先增加后降低，說(shuō)明浸提時(shí)間對(duì)SKP的提取率有一定的影響.當(dāng)浸提時(shí)間為120 min時(shí)，蛋白提取率最高，為(32.02±1.71)%；但在提取時(shí)間120 min后，隨著提取時(shí)間的增加提取率反而下降，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與堿液反應(yīng)飽和后導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶出量較少、且反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致SKP發(fā)生部分變性或者降解[31]；因此，選擇120 min為合適的提取時(shí)間.

2.2.2 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響 如圖1(b)所示，隨著提取溫度的不斷升高，SKP的提取率首先呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能是由于蛋白質(zhì)和堿液中的水分子、鹽離子等其他物質(zhì)的相互作用隨著溫度升高而加強(qiáng)[32]，促使蛋白質(zhì)在60 ℃時(shí)達(dá)到最大溶出量.但當(dāng)提取溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率下降，可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、水解，或因氨基酸的外消旋作用而影響了蛋白質(zhì)的溶出[33].因此，適宜的提取溫度應(yīng)控制在60 ℃.

2.2.3 料液比對(duì)蛋白提取率的影響 如圖1(c)所示，首先蛋白提取率隨著料液比增加而迅速上升，這可能是由于初始反應(yīng)階段富硒四季豆葉粉末在溶液體系中更易分散，蛋白質(zhì)更好溶出.但隨著料液比的逐漸增大，一方面蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和黏度逐漸降低，另一方面蛋白質(zhì)的溶解度可能達(dá)到了飽和狀態(tài)[34]，因此提取率趨于平緩.考慮到料液比過(guò)大會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取對(duì)工業(yè)資源消耗增加，因此，選擇合適的提取料液比應(yīng)是1∶20 g/mL左右.

2.2.4 NaOH溶液濃度對(duì)蛋白提取率的影響 如圖1(d)所示，SKP提取率隨著NaOH溶液濃度的增加而增加，當(dāng)NaOH濃度增加到0.2 mol/L之后，蛋白質(zhì)提取率提高幅度不大.這說(shuō)明大部分蛋白質(zhì)在NaOH溶液濃度為0.2 mol/L前就能夠溶出，這是因?yàn)閴A液濃度逐漸增加時(shí)蛋白質(zhì)之間的作用大于蛋白質(zhì)和水之間的作用所致[35].一般來(lái)說(shuō)，由于高堿度環(huán)境有助于通過(guò)破壞氫鍵、破壞葉組織和提高蛋白質(zhì)溶解度來(lái)提取植物葉蛋白，因此強(qiáng)堿性溶液能促進(jìn)葉蛋白的溶解和提取[36].因此，選擇提取SKP的堿液濃度應(yīng)控制在0.2 mol/L左右較適宜.但是，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)堿液提取后的SKP顏色為深褐色，影響感官；這可能是因?yàn)楦邏A度條件下美拉德反應(yīng)迅速發(fā)生，產(chǎn)生了黑褐色物質(zhì)，導(dǎo)致了提取液中非蛋白質(zhì)含量的增加，分離效果下降[37].若將其開發(fā)為產(chǎn)品可考慮增加后續(xù)的脫色和純化處理.

(a) 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響 (b) 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

(c) 料液比對(duì)蛋白提取率的影響 (d) NaOH濃度對(duì)提取率的影響圖1 SKP提取單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results of SKP extraction rate

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Tab.1 Experimental factor leveland coding table of response surface design

2.3 SKP提取響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼見表1.根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、NaOH溶液濃度(D)4個(gè)影響因素作自變量，采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)對(duì)SKP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示.

2.3.2 響應(yīng)面模型的建立與分析 根據(jù)Design-expert 12.0對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行多元回歸擬合分析，獲得了以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=29.26+0.25A+0.046B-0.23C+0.011D+0.098AB-0.66AC-0.25AD+

0.28BC+0.31BD+0.20CD-1.96A2-0.50B2-1.16C2-0.71D2，

由回歸方程可知，A、B、C、D4個(gè)因素一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值依次可排列為A>C>B>D，確定了各因素對(duì)富硒蛋白提取率的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>料液比>提取溫度>NaOH溶液濃度.

對(duì)響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示，回歸模型F值為25.92，模型P值<0.000 1，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著，試驗(yàn)方法可靠；失擬項(xiàng)P=0.884 0(>0.05)，表明失擬項(xiàng)不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)影響不大.相關(guān)系數(shù)R2=0.962 9，模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)試驗(yàn)值在試驗(yàn)范圍內(nèi)有較好的擬合度.A2、B2、C2、D2對(duì)蛋白提取率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，提取時(shí)間、料液比對(duì)葉蛋白提取率的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05).

表2 SKP提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Response surface optimization experimental results extracted by SKP

表3 回歸模型方差分析Tab.3 ANOVA of regression model

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 圖2為提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、NaOH溶液濃度(D)4因素的交互作用響應(yīng)面圖.在響應(yīng)面圖中，若由頂點(diǎn)向下的曲面坡度越大，則說(shuō)明圖中的單因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大.在二維等高線圖中，等高線線圈的橢圓程度體現(xiàn)不同的意義：若圖中兩個(gè)單因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用越顯著則線圈越橢圓，相反不顯著則線圈越圓.提取時(shí)間和料液比兩因素交互作用的響應(yīng)面曲面較陡峭，說(shuō)明這兩項(xiàng)交互作用顯著；而提取溫度和NaOH溶液濃度交互作用的響應(yīng)面曲面則較平緩，對(duì)應(yīng)的等高線圈也較圓，說(shuō)明這兩項(xiàng)交互作用不顯著；這與方差分析結(jié)果一致.

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化后得到SKP的堿提工藝條件為：提取時(shí)間為122.29min、提取溫度為60.92 ℃、料液比為1∶18.95g/mL、NaOH溶液濃度為0.22mol/L；此條件下葉蛋白提取率為30.06%.綜合考慮實(shí)際情況，對(duì)SKP的提取工藝最優(yōu)條件進(jìn)行了修正：提取時(shí)間為120min、提取溫度為60 ℃、料液比為1∶20g/mL、NaOH溶液濃度為0.2mol/L；此條件對(duì)富硒四季豆葉片進(jìn)行提取，實(shí)際提取率為(29.92±1.28)%，與提取率理論值30.06%相差不大，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)SKP的提取.

2.4SKP等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果分析

在最優(yōu)提取工藝條件下，采用等電點(diǎn)沉淀法將蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，用Bradford法測(cè)得上清液在波長(zhǎng)595nm處的吸光度大小與葉蛋白含量呈正相關(guān)[38]；因此，上清液中葉蛋白含量最低時(shí)的pH值即是沉淀SKP的最佳pH值.如圖3所示，吸光度隨著pH值的升高先降低后增加，當(dāng)pH值為4.4時(shí)吸光度最低，即蛋白質(zhì)接近完全沉淀.因此，SKP沉淀的最適pH值為4.4.

圖2 各因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface three-dimensional map of the effect of the interaction of various factors on the protein extraction rate

圖3 SKP等電點(diǎn)測(cè)試Fig.3 Determination ofisoelectric point of SKP

2.5氨基酸組成分析

SKP中各氨基酸含量及占總氨基酸比例見表4.對(duì)SKP進(jìn)行氨基酸檢測(cè)，結(jié)果表明其含有16種氨基酸，但由于色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和胱氨酸在酸性條件下已水解，色氨酸被破壞，其他氨基酸側(cè)鏈酰胺基水解為羧基導(dǎo)致未被檢測(cè)到[28].SKP中含有8種人體必需氨基酸中的7種(色氨酸除外)，占總氨基酸比例為35.96%；含量從高到低依次為：亮氨酸(Leu)>苯丙氨酸(Phe)>纈氨酸(Val)>賴氨酸(Lys)>酪氨酸(Tyr)>異亮氨酸(Ile)>蛋氨酸(Met).此外，SKP的非必需氨基酸中谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的含量較高.疏水氨基酸約占44.86%，高含量的疏水氨基酸為制備抗氧化活性蛋白、肽提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[38].

表4 SKP氨基酸組成含量及占總氨基酸比例Tab.4 Analysis of SKP amino acid composition content and proportion of total amino acids

2.6最優(yōu)條件下SKP體外抗氧化活性分析

使用SPSS16.0軟件來(lái)計(jì)算半抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50).IC50值可表示不同抗氧化劑的抗氧化性強(qiáng)弱：值越低表明其自由基清除能力越強(qiáng)[39].

2.6.1DPPH自由基清除活性 如圖4(a)所示，在樣品質(zhì)量濃度為0.5～3.0mg/mL范圍內(nèi)，Vc比SKP對(duì)DPPH自由基有更明顯的清除作用.隨著SKP質(zhì)量濃度的增加，其DPPH自由基清除能力從(72.05±0.1)%不斷增大到(90.91±0.31)%，在樣品濃度0.5～2.0mg/mL范圍內(nèi)變化較為明顯，在樣品濃度2.0～3.0mg/mL范圍內(nèi)變化平緩，IC50=0.167mg/mL.金小乂等[30]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低硒(37.81μg/g)還是高硒(64.78μg/g)的花生秧蛋白，在濃度0.25～2.0mg/mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率均能達(dá)到了70%，之后趨于穩(wěn)定；表明硒與蛋白在清除自由基方面有協(xié)同作用.

(a) DPPH自由基清除率 (b) ABTS自由基清除率

(c) 羥基自由基清除率 (d) 超氧陰離子自由基清除率圖4 SKP體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 SKP in vitro antioxidant test results

2.6.2ABTS自由基清除活性 如圖4(b)所示，在樣品濃度為0.5～3.0mg/mL范圍內(nèi)，Vc隨著濃度的增加對(duì)ABTS自由基的清除效果變化不大；但SKP隨著質(zhì)量濃度的增加其對(duì)ABTS自由基的清除能力增加幅度較大，從(36.73±0.74)%不斷增大到(98.30±0.23)%，IC50=0.892mg/mL，且當(dāng)濃度為3.0mg/mL時(shí)與Vc的自由基清除率接近.

2.6.3 羥基自由基清除活性 如圖4(c)所示，在樣品濃度為0.5～3.0mg/mL范圍內(nèi)，相對(duì)于SKP而言，Vc對(duì)羥基自由基清除效果更明顯；隨著SKP質(zhì)量濃度的增加其羥基自由基清除能力從(23.89±0.56)%不斷增大到(71.67±0.57)%，IC50=1.51mg/mL，但與Vc的自由基清除率始終有差距.張瑞等[40]的研究表明低、中、高硒含量的核桃蛋白在濃度為0.2～1.0mg/mL范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除能力均會(huì)隨著樣品濃度增加而增大，且高硒含量的核桃蛋白清除羥基自由基的能力優(yōu)于低、中硒含量的核桃蛋白.

2.6.4 超氧陰離子自由基清除活性 如圖4(d)所示，在樣品濃度為0.5～3.0mg/mL范圍內(nèi)，Vc對(duì)超氧陰離子自由基清除能力更明顯；而隨著SKP質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)超氧陰離子自由基清除能力從(41.70±0.16)%增大到(53.55±0.41)%，IC50=2.00mg/mL，但同濃度下清除率遠(yuǎn)低于Vc.馬玲等[41]發(fā)現(xiàn)富硒平菇水溶性蛋白在濃度為1.0mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大值51.9%.成華等[42]研究發(fā)現(xiàn)海水鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)C-藻藍(lán)蛋白富硒后會(huì)體現(xiàn)出較高的超氧陰離子自由基清除能力.不同來(lái)源的硒蛋白對(duì)自由基的清除能力有所差異，可能是因?yàn)楦黝愇鞍捉Y(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致其功能高低也有差距[43].

3 結(jié)論

以恩施富硒四季豆葉片為材料，采用堿提酸沉法提取SKP；通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定了SKP的最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間為120min、提取溫度為60 ℃、料液比為1：20g/mL、NaOH溶液濃度為0.2mol/L；在此條件下葉蛋白的提取率為(29.92±1.28)%.氨基酸分析表明，該蛋白有人體必需的7種氨基酸，占總氨基酸比例為35.96%；疏水氨基酸占比約44.86%，為制備抗氧化活性蛋白、肽提供了物質(zhì)基礎(chǔ).SKP對(duì)自由基的清除能力在濃度0.5～3.0mg/mL范圍內(nèi)隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大，表明SKP的添加量與自由基的清除率具有一定的協(xié)同效應(yīng)；而且SKP對(duì)自由基的清除能力存在差異，這可能是由于SKP的硒蛋白結(jié)構(gòu)不同所致.但制備的SKP樣品顏色較深，若計(jì)劃在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，可考慮脫色和純化處理.