韓林

紫草素是傳統(tǒng)中藥紫草的主要活性成分之一，除了具有抗炎、抗菌和促進(jìn)傷口愈合等藥理活性外，還在結(jié)腸癌、食管癌和肺癌等腫瘤中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性［1-3］。微小RNAs（miRNAs）是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等細(xì)胞功能［4］。越來越多的研究顯示，miRNAs如miR-106b和miR-143等在紫草素抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要作用［5-6］。miR-34a是miR-34家族成員，位于11q23染色體上，被證實(shí)在肺癌組織中異常低表達(dá)，而上調(diào)其表達(dá)具有抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用［7］。近年來，有報道指出，miR-34a表達(dá)上調(diào)是紫草素抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖的重要機(jī)制，但miR-34a是否參與紫草素抗肺癌增殖和侵襲的過程尚不清楚［8］。因此，本研究于2019年9月至2020年3月，通過開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察miR-34a在紫草素抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲中的作用，并探討其可能的分子機(jī)制，以期在臨床上為紫草素治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司；Yin Yang-1（YY1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗均購于美國Abcam公司；pcDNA 3.1-YY1-GFP過表達(dá)質(zhì)粒及其對照pcDNA3.1-GFP空載體質(zhì)粒購于百奧邁科生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生化公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司；紫草素、胰蛋白酶和噻唑藍(lán)（MTT）試劑購于美國Sigma公司；Matrigel膠購于美國BD公司；miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應(yīng)對照購于上海吉瑪生物公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.1.2 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司，凝膠成像分析系統(tǒng)、轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司，倒置顯微鏡購于日本Nikon公司，Transwell小室購于美國Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和紫草素處理將來自中科院上海細(xì)胞庫的H1299細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，接種至含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)液中置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時按1∶3比例進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為對照組（0 μmol∕L），1 μmol∕L、2.5 μmol∕L和5 μmol∕L的紫草素處理組，分別加入終濃度為0、1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率將各組H1299細(xì)胞按照104個∕孔種植于96孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)48 h，另以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白組。待紫草素作用48 h后，棄培養(yǎng)液，加入20 μL 5 g∕L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT液后，每孔加入150 μL二甲基亞楓孵育20 min，采用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度值并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組吸光度值-空白組吸光度值）∕（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力各組H1299細(xì)胞經(jīng)紫草素處理48 h后制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以800個∕孔接種至6孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)10～12 d，待有肉眼可見集落形成時終止培養(yǎng)。棄上清，加入4%多聚甲醛固定15 min，應(yīng)用結(jié)晶紫染液染色20 min。洗去染液，通過倒置顯微鏡觀察并計數(shù)各組大于15個細(xì)胞的集落形成數(shù)量。

1.2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液按照1∶4比例混合后，取混合液25 μL平鋪于Transwell小室上室，并置于37℃培養(yǎng)箱中至充分融合。將不同濃度的紫草素處理48 h的H1299細(xì)胞制成濃度濃度為105個∕毫升，在Transwell小室上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，小室下室中加入500 μL含10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出小室，棄上室內(nèi)培養(yǎng)液后，使用棉簽拭去小室膜表面細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定15 min后，加入結(jié)晶紫染液染色20 min。于倒置顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個視野觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.5 RT-PCR檢測miR-34a表達(dá)水平收集紫草素處理48 h后的各組細(xì)胞，加胰酶消化后加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA（cDNA），以cDNA為模板，根據(jù)上海生工生物合成的PCR引物按照94℃、5 min預(yù)變性；94℃、30 s變性，60℃、30 s退火，72℃、30 s延伸，共循環(huán)38次的反應(yīng)條件以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-34a正向引物序列為5'-GTGCAGTGGCAGTGTCTTAGC-3'，反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，反向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'。采用2-ΔΔCt法檢測各組細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期H1299細(xì)胞按照105個∕孔的密度接種于6孔板，常規(guī)條件下孵育過夜。通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-34a抑制劑及其陰性對照或者pcDNA 3.1-YY1-GFP過表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA 3.1-GFP空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)至H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后給予濃度為5 μmol∕L紫草素處理48 h，并分別標(biāo)記為紫草素+anti-miR-34a組和紫草素+anitmiR-NC組或紫草素+pcDNA 3.1-YY1組和紫草素+pcDNA3.1組。另以正常培養(yǎng)的H1299細(xì)胞作為正常組，以不做轉(zhuǎn)染只給予5 μmol∕L紫草素處理的H1299細(xì)胞作為紫草素組。待處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，分別采用MTT法、平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的存活率、克隆形成和侵襲能力。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測YY1蛋白表達(dá)收集紫草素處理48 h的各組H1299細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白的濃度。將蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液以4∶1比例混合均勻，沸水浴變性。按照每孔60 μg將蛋白樣品電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)含5%脫脂奶粉的封閉液封膜處理1.5 h后，加入YY1抗體和GAPDH抗體（稀釋比1∶1 000）4℃下孵育24 h。次日加入二抗（稀釋比1∶2 000）工作液室溫孵育1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影。以GAPDH為管家基因，采用凝膠成像系統(tǒng)分析YY1蛋白的表達(dá)水平。

1.2.8 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34a與YY1靶向關(guān)系運(yùn)用生物信息學(xué)軟件TargetScan（https：∕∕www.targetscan.org）、miRBase（https：∕∕microrna.sanger.ac.uk）和MiRanda（https：∕∕www.microrna.org）對miR-34a潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測，最終將YY1作為研究對象。將YY1 3’UTR片段克隆并重組于psiCHECK2質(zhì)粒上，構(gòu)建psiCHECK2-YY1野生型（YY1-WT）報告基因質(zhì)粒；同時，利用Takara點(diǎn)突變 試 劑 盒 將YY1 3’UTR與miR-34a結(jié) 合 位 點(diǎn)“ACUGCCA”進(jìn)行突變?yōu)椤癠GACGGU”后，克隆到psiCHECK2質(zhì) 粒 上，構(gòu)建psiCHECK2-YY1野生 型（YY1-MUT）報告基因質(zhì)粒。將質(zhì)粒分別與miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其陰性對照參照脂質(zhì)體2000說明書步驟共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中，48 h后根據(jù)雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞螢光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素以濃度依賴性抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲以1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后發(fā)現(xiàn)，肺癌H1299細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性降低，且與對照（0 μmol∕L）組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1，表1。

表1 不同濃度紫草素對H1299細(xì)胞增殖、侵襲的影響

表1 不同濃度紫草素對H1299細(xì)胞增殖、侵襲的影響

注：①與0 μmol∕L比較，P＜0.05。②與1 μmol∕L比較，P＜0.05。③與2.5 μmol∕L比較，P＜0.05。

濃度0 μmol∕L 1 μmol∕L 2.5 μmol∕L 5 μmol∕L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3細(xì)胞存活率∕%100 82.15±5.02①71.64±4.28①②58.37±2.53①②③33.93＜0.001克隆細(xì)胞數(shù)156.55±9.06 127.63±7.38①108.85±6.34①②91.72±6.15①②③43.11＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)116.00±7.85 93.12±5.56①75.25±4.68①②59.85±3.20①②③56.15＜0.001

2.2 紫草素以濃度依賴性上調(diào)肺癌H1299細(xì)胞中miR-34a表達(dá)0、1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后H1299細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平分別為1.03±0.08、1.65±0.12、1.65±0.12、5.12±0.50，組間比較差異有 統(tǒng)計學(xué) 意義（F=99.27，P＜0.001）。與對照（0 μmol∕L）組比較，1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后H1299細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

2.3 miR-34a與YY1靶向關(guān)系驗(yàn)證生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，YY1與miR-34a之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見表2。同時，miR-34a與YY1 3'UTR野生型質(zhì)粒（YY1-WT）共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的螢光素酶活性較對照miR-NC明顯降低（P＜0.05），而anti-miR-34a與YY1-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的螢光素酶活性較對照antimiR-NC明顯升高（P＜0.05）。但是，miR-34a或者anti-miR-34a與YY1 3'UTR突變型質(zhì)粒（YY1-MUT）共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的螢光素酶活性與相應(yīng)對照比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 YY1 3'UTR與miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)

表3 各組細(xì)胞螢光素酶活性的對比

表3 各組細(xì)胞螢光素酶活性的對比

注：YY1-WT為psiCHECK2-YY1野生型報告基因質(zhì)粒，YY1-MUT為psiCHECK2-YY1突變型報告基因質(zhì)粒。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-34a anti-miR-NC anti-miR-34a F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3螢光素酶活性YY1-WT 0.96±0.05 0.32±0.03①1.01±0.07 3.56±0.21②470.39＜0.001 YY1-MUT 1.02±0.07 0.97±0.06 0.96±0.06 1.00±0.08 0.49 0.698

2.4 下調(diào)miR-34a逆轉(zhuǎn)紫草素對肺癌H1299細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用并促進(jìn)YY1蛋白表達(dá)與正常組比較，紫草素處理后H1299細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平明顯升高，而YY1蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與紫草素組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-34a后紫草素對H1299細(xì)胞的上述作用得到部分逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染anti-miR-NC后紫草素對H1299細(xì)胞的上述作用未有顯著改變（P＞0.05）。見圖2，表4。

表4 下調(diào)miR-34a對肺癌H1299細(xì)胞中Yin Yang-1（YY1）蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、侵襲的影響

表4 下調(diào)miR-34a對肺癌H1299細(xì)胞中Yin Yang-1（YY1）蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、侵襲的影響

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與紫草素組比較，P＜0.05。

組別正常組紫草素組紫草素+anti-miR-NC組紫草素+anti-miR-34a組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 miR-34a 1.00±0.06 4.68±0.35①4.56±0.37①1.25±0.13①②175.11＜0.001 YY1蛋白1.32±0.13 0.35±0.03①0.38±0.03①0.76±0.05①②115.64＜0.001細(xì)胞存活率∕%100 60.15±3.23①61.08±3.35①82.42±5.21①②41.43＜0.001克隆細(xì)胞數(shù)161.35±11.26 82.48±5.35①80.72±5.28①126.51±9.36①②66.35＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)123.48±8.21 57.82±3.52①55.65±3.17①90.35±4.05①②115.55＜0.001

圖2 下調(diào)miR-34a對紫草素處理的肺癌H1299細(xì)胞中YY1蛋白表達(dá)的影響

2.5 上調(diào)YY1表達(dá)逆轉(zhuǎn)紫草素對肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用與正常組比較，紫草素處理后H1299細(xì)胞中YY1蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與紫草素組比較，轉(zhuǎn)染YY1-pcDNA3.1過表達(dá)質(zhì)粒后紫草素對H1299細(xì)胞的上述作用明顯減弱（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒后顯著未影響紫草素對H1299細(xì)胞的上述作用（P＞0.05）。見圖3，表5。

表5 上調(diào)Yin Yang-1（YY1）表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲的影響

表5 上調(diào)Yin Yang-1（YY1）表達(dá)對肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲的影響

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與紫草素組比較，P＜0.05。

組別正常組紫草素組紫草素+pcDNA3.1組紫草素+pcDNA3.1-YY1組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 YY1蛋白1.41±0.22 0.32±0.03①0.36±0.03①0.88±0.06①②58.68＜0.001細(xì)胞存活率∕%100 62.38±3.16①64.15±3.32①79.46±5.85①②31.40＜0.001克隆細(xì)胞數(shù)158.46±10.35 81.72±6.18①83.05±5.96①118.54±8.05①②64.27＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)118.85±7.62 56.46±3.28①58.23±3.36①85.26±5.02①②97.41＜0.001

圖3 上調(diào)YYI對紫草素處理的肺癌H1299細(xì)胞中YY1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，也是導(dǎo)致人類癌癥相關(guān)死亡的首因。目前手術(shù)切除和化療是肺癌的主要治療手段，但治療效果并不理想。隨著中藥抗腫瘤熱度的增加，越來越多的抗腫瘤藥物被發(fā)現(xiàn)。紫草素是一種從中草藥紫草中提取的萘醌類化合物，主要用于靜脈炎、肝炎、燒傷和血管性紫癜等疾病的治療［9］，此外，紫草素還在多種腫瘤中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用。Guo等［10］報道，紫草素可通過CD147抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，被認(rèn)為是一種很有前途的腫瘤治療藥物。Zhang等［11］研究證實(shí)，紫草素可通過下調(diào)DNMT1表達(dá)抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞侵襲和遷移。Shilnikova等［12］研究指出，紫草素可通過誘導(dǎo)耐藥的人卵巢癌A2780-CR細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡和減弱上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。本研究1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后發(fā)現(xiàn)，紫草素可呈濃度依賴性抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲。該結(jié)果與王媛等［13］得到的紫草素抑制肺腺癌H1975細(xì)胞增殖以及Hsieh等［14］得到的紫草素可抑制肺癌HCC827細(xì)胞侵襲的結(jié)果相吻合。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)紫草素可呈劑量依賴性上調(diào)miR-34a的表達(dá)。這提示，miR-34a可能在紫草素抗肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用。miR-34a屬于miR-34a家族，最早是在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)的；其上游區(qū)域中含有能夠與抑癌因子p53結(jié)合的位點(diǎn)，受p53的直接調(diào)控［15］。多個研究顯示，miR-34a異常低表達(dá)于肝癌、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲［16-18］。Wang等［7］研究得出miR-34a具有抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑成功下調(diào)miR-34a表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-34a低表達(dá)可通過促進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲，逆轉(zhuǎn)紫草素抗H1299細(xì)胞增殖和侵襲的作用。結(jié)果提示，紫草素可通過上調(diào)miR-34a表達(dá)抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲。

為了進(jìn)一步探討miR-34a參與紫草素抗肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對miR-34a的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)在YY1與miR-34a之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，最終選用YY1作為研究對象。YY1是鋅指類轉(zhuǎn)錄因子GLl-Kruppel家族成員，定位于人類14號染色體端粒區(qū)，可通過調(diào)控不同的蛋白輔助因子影響腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［19］。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-34a可靶向結(jié)合YY1降低細(xì)胞的螢光素酶活性；同時，下調(diào)miR-34a表達(dá)可促進(jìn)YY1蛋白的表達(dá)。這一系列結(jié)果顯示，YY1是miR-34a的靶基因。Huang等［20］研究證實(shí)，YY1異常高表達(dá)于肺癌組織和細(xì)胞中，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-YY1-GFP過表達(dá)質(zhì)粒成功上調(diào)YY1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，紫草素對肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用明顯減弱。結(jié)果提示，紫草素可能通過介導(dǎo)miR-34a靶向調(diào)控YY1抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，miR-34a在紫草素抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著積極作用，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控YY1表達(dá)有關(guān)。

（本文圖1見插圖1-4）

圖1 紫草素對H1299細(xì)胞克隆形成和侵襲的影響:A為平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色×200）