顏琿璘 蘆光新 鄧曄 顧松松 顏程良 馬坤 趙陽安 張海娟王英成 周學(xué)麗 竇聲云

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 中國科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，北京 100085；3.青海省草原改良試驗站，海南州 813000）

近年來，由于人類活動和全球氣候變化等多因素影響，青藏高原高寒草地出現(xiàn)明顯的退化，使得牧草產(chǎn)量供不應(yīng)求，嚴(yán)重影響了人們的生產(chǎn)生活，且對青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能造成了威脅［1］。長期施用化肥不僅抑制牧草的生長，還破壞了土壤環(huán)境，為土地的可持續(xù)發(fā)展埋下隱患。這一問題目前已經(jīng)受到研究者們的廣泛關(guān)注。禾/豆混播是人工草地種植最常見的方式之一，具有提升產(chǎn)量、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境雙贏的效應(yīng)［2］。它可以通過改善草地生態(tài)系統(tǒng)氮元素的平衡利用、改善土壤肥力來提高草地的產(chǎn)量和品質(zhì)［3］，在促進(jìn)化肥減施增效、助力農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展上有重要的意義。

中國青海省青海湖西岸的鐵卜加草原改良站（99°35′E，37°05′N），海拔 3 270 m，年平均氣溫-0.7℃。最熱月（7月）平均氣溫17.5℃，最冷月（1月）平均氣溫-22.6℃，年降水量為1 495.3 mm。主要種植植物類群是環(huán)湖寒生羊茅（Festuca kryloviana Reverd）、青海草地早熟禾（Poa pratensis L.cv.Qinghai）、扁穗冰草（Agropyron cristat（L.）Gaertn）等。該地區(qū)屬于高原干旱大陸性氣候，具有青藏高原高寒草地生態(tài)環(huán)境的典型性、代表性特征。為了減少此地區(qū)肥料的使用，為牛羊供給足夠的牧草飼料，本試驗采用拌根瘤菌劑的方法使禾/豆混播的這種效應(yīng)得到更大的提升。根瘤菌作為常用拌種劑，是由根瘤菌生產(chǎn)菌制成的微生物制劑。大量的活體根瘤菌可以有效增加根部根瘤的數(shù)量，供應(yīng)牧草生長所需的氮素，進(jìn)而減少肥料的使用，節(jié)省生產(chǎn)成本［4-5］。

微生物作為土壤的活躍組成成分，其組成和生命活動與土壤地理化學(xué)性質(zhì)及土壤營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)息息相關(guān)。土壤微生物可以分解有機(jī)質(zhì)，通過將肥料以及落葉殘根內(nèi)有機(jī)質(zhì)分解成游離態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)以供植物吸收利用，促進(jìn)植物生長發(fā)育［6-8］。而根際微生物與植株根部營養(yǎng)具有密切的關(guān)系，與植株共生的根瘤菌、菌根真菌都能為其提供氮元素、磷素以及有機(jī)質(zhì)、維生素等營養(yǎng)。因此，根際微生物對促進(jìn)植株生長有重要意義［9］。拌根瘤菌會對土壤微生物的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響，研究拌種對根周與根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)以及對牧草生長促進(jìn)作用很有必要［10］。

高通量測序（high-throughput sequencing）已成為研究環(huán)境微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的重要方式［11-13］。本文采用高通量測序技術(shù)分析根瘤菌拌種在禾/豆混播方式下的土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，了解拌根瘤菌后對土壤微生物組分的具體影響，將不同處理對土壤微生物功能的變化進(jìn)行FAPROTAX預(yù)測，以及BugBase分析，比較不同處理下土壤微生物高水平表型的分類和變化，從而為拌根瘤菌對牧草生長的促進(jìn)作用提供土壤微生物方面的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣地以‘阿壩’垂穗披堿草（Elynus nutans Griseb.cv.‘Aba’）和‘川草2號’老芒麥（Elymus sibiricus L.cv.‘Chuancao No.2’）與苜?！绷?201’（Medicago sativa cv.‘Beilin201’）分別以 1∶1比例在2020年6月進(jìn)行播種，將苜蓿種子進(jìn)行苜蓿根瘤菌菌液（上海瑞楚生物科技有限公司，乳白色，活菌群落：1010CFU/mL）拌種，以條播形式混播。即‘阿壩’垂穗披堿草+苜蓿、‘阿壩’垂穗披堿草+苜蓿（拌根瘤菌）、‘川草2號’老芒麥+苜蓿、‘川草2號’老芒麥+苜蓿（拌根瘤菌）4種混播組合，每個處理重復(fù)3次，共12個小區(qū)（表1）。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental design

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)及牧草地上生物量測定 將所有采集土樣參照《土壤農(nóng)業(yè)分析學(xué)分析方法》進(jìn)行測定。在牧草生長期，采用五點法每隔10 d對株高進(jìn)行測量。隨機(jī)選擇各小區(qū)10株牧草進(jìn)行刈割，剪取地上部分，作為地上生物量指標(biāo)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）。

1.2.2 土樣采集及處理 由于進(jìn)入霜凍的氣象因素以及牧草進(jìn)入枯草期之前要完成采樣，土壤樣品于2020年9月采集，在12個小區(qū)中，根據(jù)草地樣方采集的隨機(jī)取樣方式挖出完整的根系，采取“抖根法”抖落植株根系周圍的土壤作為根周土壤。根周土壤不區(qū)分禾本科與豆科，拌根瘤菌（B）、不拌根瘤菌（N）；然后用刷子在PBS（0.1% Tween 80）中收集黏附根際土壤樣品，共12個土樣。攪拌5 min后，將得到的懸浮液倒入無菌離心管中，重復(fù)此過程2次。將懸浮液混合并離心，在提取DNA之前，將所得沉淀物顆粒儲存在-80℃。根際土區(qū)分禾本科與豆科，由測序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種禾本科牧草的土壤微生物沒有顯著差異（P＞0.05），因此將兩種禾本科牧草放在一起分析。根際土壤：禾本科拌種（HB：A1+A2），禾本科不拌種（HN：D1+D2），豆科拌種（DB：A1+A2），豆科不拌種（DN：D1+D2）。由于混播牧草長勢不均勻，導(dǎo)致根際土壤缺少4個樣本，共有32個土樣。

1.2.3 DNA測序 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增以及測序采用土壤DNA提取試劑盒（MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA，美國）操作方法對所有32個土壤樣本進(jìn)行DNA的提取。所有樣品濃度和純度使用Nanodrop2000進(jìn)行檢測，濃度均在20 ng/μL以上，A260/A280為1.8-2.0，說明土壤樣本DNA濃度及純度較好，可進(jìn)行PCR實驗。

對32個土壤樣本進(jìn)行16S rRNA的基因擴(kuò)增，上游引物為515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；下 游 引 物 為 806R ：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；引物序列包含簡并堿基，M：C或A，H：A、C、T，V：A、C、G，W：A或T。用帶有10 bp長的barcode序列的特異引物以50 μL 體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系包括 25 μL的 2×Phanta Max Buffer，1 μL 的 DNTP Mix（0 mmol/L each），2 μL 的上游引物和下游引物，1 μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1 μL的 DNA 模板，ddH2O 加至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性20 s，55℃退火25 s，72℃衍生45 s，共32個循環(huán)，最后72℃徹底延伸5 min。根據(jù)不同樣本標(biāo)簽，將32個土壤樣本回收后的DNA定量到20 ng/μL以上，采用KAPA HyperPrep Kit DNA文庫構(gòu)建試劑盒制備測序文庫。在Illumina Miseq平臺進(jìn)行測序。

序列預(yù)處理和生物信息學(xué)方法。將所有原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式以及樣本對應(yīng)的Barcode信息上傳到Galaxy分析平臺上（http://mem.rcees.ac.cn：8080）進(jìn)行分析［14］。使用Trim Primer將正反向引物去除。通過FLASH將正反向序列進(jìn)行拼接［15］。使用Btrim［16］步驟去除由FLASH拼接后序列中的低質(zhì)量區(qū)域。使用Trim N去除小于150 bp的序列以及模糊堿基（N）。通過Trim by sequence length對序列進(jìn)行篩選和修剪，保留長度在245-260 bp的目的序列。序列通過UPARSE方法按97%相似度進(jìn)行OTU歸類，生成原始OTU表，并對原始表進(jìn)行重抽，使每個樣品序列數(shù)相同，用重抽后OTU進(jìn)行后期統(tǒng)計分析［17-18］，并使用 FAPROTAX［19］進(jìn)行功能預(yù)測，根據(jù)其分類豐度，使用軟件包“heatmap package”繪制功能熱圖。同時使用BugBase［20］對不同處理的土壤微生物高水平表型的分類和變化進(jìn)行分析。

1.2.4 qPCR實驗方法 針對nifH基因核酸序列設(shè)計擴(kuò)增nifH基因的引物對，上游引物nifHF：5′-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′， 下 游 引 物Cy55Nh428R ：5′-CCRCCRCANACMACGTC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。取10 μL質(zhì)粒稀釋10倍作為模板，設(shè)置 2.0×109copies/μL-2.0×103copies/μL每個梯度各設(shè)3個平行進(jìn)行重復(fù)試驗，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢驗方法靈敏度。反應(yīng)采用20 μL體系：模板 1 μL，上下游引物各 0.4 μL，10 μL 2×Phanta Max Buffer，8.2 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火25 s，72℃延伸45 s，39個循環(huán)；熒光信號采集設(shè)在72℃。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)55-95℃的溶解曲線，溫度以0.5℃/5 s遞增。統(tǒng)計方法用CFX96TM實時PCR檢測儀進(jìn)行ΔCt分析，計算每組基因拷貝數(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差值（x±SD），各進(jìn)行3個平行。

1.2.5 生態(tài)分析 通過RDP分類數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行注釋。計算樣本間的Bary Curtis距離，再進(jìn)行非度量多維尺度NMDS（non-metric multidimensional scaling）分析，為了驗證根周與根際土壤微生物群落之間群落結(jié)構(gòu)是否有顯著差異，通過相似性分析（ANOSIM）、多響應(yīng)置換過程分析（MRPP）以及置換多元方差分析（PERMANOVA）3種方法進(jìn)行了不相似性檢驗（dissimilarity test）。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)及牧草地上生物量分析

如表2所示，拌根瘤菌對土壤養(yǎng)分產(chǎn)生了不同的影響。與不拌種相比，根瘤菌拌種對土壤硝態(tài)氮、有機(jī)碳均有所增加，但無顯著差異（P＞0.05）。此外，對牧草植株生長曲線和植株鮮重進(jìn)行了測量分析，如圖1-a所示，發(fā)現(xiàn)通過拌種后，對禾本科牧草（‘阿壩’垂穗披堿草、‘川草2號’老芒麥）影響并不顯著。而苜蓿經(jīng)過拌種后，株高高于不拌種，但效果也不顯著（P＞0.05）。根瘤菌拌種后，豆科植物的鮮重增加，與不拌種相比，無顯著差異（圖1-b）。由以上結(jié)果可知，根瘤菌拌種改變了土壤理化性質(zhì)以及苗期的牧草生長情況。

圖1 牧草地上生物量Fig.1 Biomass on pasture

表2 土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil physical and chemical properties

2.2 根周和根際土壤原核微生物群落多樣性分析

通過高通量測序分析，從32個樣本中共獲得4 624 690個有效序列，并從這些序列中識別出8 814個OTU。圖2-a稀釋曲線所示，OTU數(shù)隨著序列數(shù)的增加達(dá)到平臺期，說明測序深度已基本滿足下游分析。由圖2-b維恩圖，對32個土壤樣品的共有和獨有OTU行了可視化，結(jié)果顯示根周土壤與根際土壤共有2 328個OTU，占全部OTU的26.4%；根周不拌種土壤（N）擁有最多的獨有OTU（551個），占全部OTU的6.2%；根周拌種（B）獨有542個OTU，占全部OTU的6.1%；根際豆科拌種（DB）獨有的OTU數(shù)最少為103個，占0.1%。根際豆科不拌種（DN）獨有224個OTU，占全部OTU的2.5%；根際禾本科拌種（HB）獨有326個OTU，占全部OTU的3.7%；根際禾本科不拌種（HN）獨有172個，占全部OTUs的2.0%（圖2）。這些結(jié)果說明，拌種減少了根周土壤原核生物群落物種數(shù)以及豆科根際土壤原核生物群落的物種數(shù)。

圖2 土壤原核生物微生物群落稀釋曲線和共有和獨有OTUs 的韋恩Fig.2 Rarefaction curves for soil prokaryotic microbial communities and Venn diagram showing the unique and shared OTUs

如圖3-a-c所示，對所有土壤樣本的原核微生物α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，Shannon、Observed_richness、Inverse Simpson指數(shù)結(jié)果表明，拌種處理后，α多樣性在根周和根際中，均顯著（P＜0.05）低于不拌種。使用Chao值對所有根周和根際土壤原核微生物群落的物種進(jìn)行估計，圖3-d表明，DB處理的Chao值最低（P＜0.05）。根周土壤B和N比較，拌根瘤菌處理的Chao顯著低于不拌種，推測拌根瘤菌會減少原核生物的繁殖。根際土壤中，拌種處理的Chao顯著低于不拌種，說明拌根瘤菌減少了根際土壤原核微生物多樣性。

圖3 α多樣性分析Fig.3 α diversity analysis

2.3 根周和根際土壤原核微生物群落物種組成

在門水平分類上，如圖4-a所示，將OTU分為36門。根周和根際土壤細(xì)菌群落核心菌門（＞1%）分別是放線菌門（Actinobacteria，26.11%-46.20%）、變形菌門（Proteobacteria，20.61%-32.91%）、酸桿菌門（Acidobaeteria5，0.64%-8.15%）、厚壁菌門（Firmicutes，1.74%-9.51%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，3.58%-6.21%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.01%-4.96%）、浮霉菌門（Planctomycetes，1.57%-4.97%）、綠彎菌門（Chloroflexi，1.18%-3.66%）、奇古菌門（Thaumarchaeota，1.02%-4.56%）。在根周土壤原核微生物群落中，拌種（B：27.11%）處理的放線菌門高于不拌種（N：26.55%）的相對豐度，根際土壤微生物群落呈相同規(guī)律，HB、HN、DB、DN的相對豐度分別是41.26%、39.45%、46.20%、39.02%，表明拌種顯著增加土壤放線菌的相對豐度。

對根周與根際土壤原核微生物進(jìn)一步在屬水平上進(jìn)行群落組成成分的變化，不同處理經(jīng)高通量測序共得577屬。結(jié)果（圖4-b）表明，在屬水平上具有豐富的多樣性，假桿菌屬（Pseudarthrobacter，0.38%-20.28%）、芽球菌屬（Blastococcus，5.57%-13.65%）、微小桿菌屬（Exiguobacterium，0.07%-8.59%）、芽孢桿菌屬（Gemmatimonas，2.13%-5.45%）、Gp6（2.70%-3.20%）、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera，1.02%-4.56%）、嗜 酸 硫桿 菌 屬（Aciditerrimonas，0.21%-3.69%）、泛菌屬（Pantoea，0.73%-4.40%）、Gaiella（1.29%-3.05%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，1.45%-2.57%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，0.52%-2.99%）為優(yōu)勢屬，在不同的處理中相對豐度有所不同。在根瘤菌拌種后的處理中，假桿菌屬（Pseudarthrobacter）無論在根際還是根周土壤，其相對豐度在拌種后均顯著增加（P ＜ 0.05）。在根周土壤B和N中，相對豐度為1.28%、0.38%，在根際土壤DB、DN、HB、HN中，相對豐度分別是20.28%、13.21%、12.16%、8.19%。芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）在根周和根際土壤原核微生物中，拌根瘤菌后的處理B（2.22%）、HB（3.21%）、HN（5.45%）都有所增加，且豆科根際的芽孢桿菌數(shù)量顯著增加，不拌根瘤菌的N、HN、DN芽孢桿菌分別是2.10%、2.98%、3.36%。同時亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）也在拌根瘤菌處理后的土壤中增加，在根周B、N分別是1.38%、1.28%，在根際土壤HB、HN、DB、DN分別是2.43%、1.02%、4.56%、4.05%。嗜酸硫桿菌（Aciditerrimonas）其相對豐度在拌根瘤菌后也顯著升高。在根周土壤B、N中，相對豐度為0.38%、0.21%，在根際土壤DB、DN、HB、HN中，相對豐度分別是3.69%、2.88%、3.50%、2.00%（P＜0.05）。

圖4 土壤原核生物群落豐度比例Fig.4 Percentage of soil prokaryotic microbial community abundance

2.4 根周與根際土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)

為了研究根周和根際土壤原核微生物群落的β-多樣性，基于Bary-Curtis距離，通過非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）對根周和根際土壤原核微生物群落進(jìn)行分析，并進(jìn)行不相似檢驗（dissimilarity test）分析驗證。如圖5和表3所示，根周土壤B、N和根際土壤HB、HN、DB、DN之間的細(xì)菌群落之間的Bary-Curtis距離具有明顯的空間分布，存在顯著差異。根周土壤與根際土壤，不管是禾本科根際還是豆科根際在圖中的距離都較遠(yuǎn)，說明根周土壤與根際土壤原核生物群落差異較大。從Bary-Curtis距離矩陣的不相似檢驗結(jié)果看，B和N具有顯著差異（P＜0.05），HB和HN也具有顯著差異（P＜0.05），表明拌種處理對根周和根際禾本科土壤原核生物群落β-多樣性（Bary-Curtis距離）都有影響。

表3 基于原核微生物群落Bary-Curtis距離的不相似檢驗Table 3 Dissimilarity test based on Bary-Curtis distance of soil prokaryotic communities

圖5 根周與根際原核微生物群落結(jié)構(gòu)非度量多維尺度分析（NMDS）Fig.5 NMDS of bulk and rhizosphere soil prokaryotic community structure

2.5 功能預(yù)測

FAPROTAX是適合分析環(huán)境樣本的化學(xué)循環(huán)過程，尤其是氮、磷、碳等元素進(jìn)行功能注釋的預(yù)測。為了研究不同處理根周與根際土壤原核微生物關(guān)于固氮的功能，采用FAPROTAX進(jìn)行了細(xì)菌的功能預(yù)測。通過功能預(yù)測，共得出55種生態(tài)功能類群，根瘤菌的主要作用是通過與苜蓿根瘤共生而固氮，進(jìn)而促進(jìn)牧草的生長，因此本試驗挑選了關(guān)于氮循環(huán)的13種生態(tài)功能，分別是好氧氨氧化（aerobic_ammonia_oxidation）、亞硝酸鹽氧化（aerobic_nitrite_oxidation）、硝化作用（nitrification）、厭氧氨氧化（anammox）、硝酸鹽反硝化（nitrate_denitrification）、亞硝酸鹽反硝化（nitrite_denitrification）、氧化亞氮反硝化（nitrous_oxide_denitrification）、反硝化（denitrification）、固氮（nitrogen_fixation）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite_respiration）、硝酸鹽呼吸（nitrate_respiration）、硝酸鹽還原（nitrate_reduction）、氮氣呼吸（nitrogen_respiration）。根據(jù)功能注釋相對豐度，繪制功能多樣性熱圖，如圖6所示，在根周土壤B（10.9%）和N（9.9%）中，硝化作用豐度最高。根際土壤中，硝酸鹽還原作用豐度最高，分別是HB（7.8%）、HN（4.5%）、DB（13.8%）和DN（11.3%）。根周與根際土壤最低為反硝化作用種群。拌種與不拌種相比，拌種處理下硝酸鹽還原作用（nitrate_reduction）的豐度顯著提高了1.5%-3.3%（P＜0.05）。

圖6 不同處理根周和根際土壤原核微生物功能多樣性熱圖Fig.6 Heat map of prokaryotic functional diversity in bulk and rhizosphere soil under different treatments

BugBase是用于微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行高水平表型（high-level phenotypes）的分類工具。根瘤菌是需氧型的革蘭氏陰性菌，為了探究拌根瘤菌后，其對根周和根際土壤原核微生物的影響，通過BugBase對不同處理樣品中微生物的表型進(jìn)行了預(yù)測。如表4所示，根周土壤中，拌種與不拌種相比，拌種后需氧、厭氧、革蘭氏陽性菌的個數(shù)減少，分別是99、48、39，不拌種處理的需氧、厭氧、革蘭氏陽性菌的個數(shù)分別是117、50、48。拌種處理后，兼性厭氧、革蘭氏陰性增加，分別是25、233，不拌種的兼性厭氧、革蘭氏陰性菌的個數(shù)是18、232。根際土壤原核微生物，禾本科拌種（HB）的需氧、厭氧、革蘭氏陽性、兼性厭氧、革蘭氏陰性菌個數(shù)都比不拌根瘤菌（HN）的個數(shù)多，分別是51、30、14、116、21，而不拌根瘤菌的個數(shù)分別是19、24、9、84、15。豆科根際拌根瘤菌后，DB處理組需氧、厭氧、革蘭氏陽性、兼性厭氧、革蘭氏陰性都比不拌根瘤菌的DN處理少，菌的個數(shù)分別是13、13、3、39、6，DN中菌的個數(shù)分別是36、30、10、103、14。以上結(jié)果說明，拌根瘤菌對禾本科和豆科牧草土壤原核微生物群落的響應(yīng)不同。

表4 微生物表型預(yù)測結(jié)果Table 4 Bugbase results

2.6 qPCR定量分析

（2.0×109-2.0×103）copies/μL 7 個梯度，每個梯度3個平行進(jìn)行重復(fù)試驗的nifH基因qPCR擴(kuò)增結(jié)果呈指數(shù)增長期的曲線平行擴(kuò)增，基本符合BIORAD公司提供的實時熒光定量PCR國際化標(biāo)準(zhǔn)。本試驗對根際土壤原核微生物群落中nifH基因進(jìn)行了定量分析，如圖7所示，在拌種處理后，豆科根際原核微生物的nifH基因顯著高于不拌種的豐度，同時禾本科根際原核微生物的nifH基因也呈增長趨勢，無顯著差異。

圖7 不同處理nifH-qPCR定量Fig.7 Different treatments of nifH-qPCR quantification

3 討論

3.1 拌根瘤菌改變了土壤理化性質(zhì)及牧草地上生物量

拌根瘤菌會改變土壤理化性質(zhì)和牧草的生物量，但是改變無顯著差異。根瘤菌劑是一種微生物肥料，首先改變微生物群落，經(jīng)過微生物群落影響土壤和植物，這個過程需要一定的時間。本苜蓿品種首次于青藏高原高寒地區(qū)種植，牧草對生長環(huán)境也未適應(yīng)，從而導(dǎo)致牧草的生物量增加不顯著，其效果后期還需要繼續(xù)進(jìn)行研究。

3.2 拌根瘤菌降低了根周和根際土壤原核微生物群落多樣性

在根周土壤中，拌種和不拌種相比，拌種后的α多樣性（Chao）顯著低于不拌根瘤菌，表明拌根瘤菌后群落物種豐富度發(fā)生了變化。對于根際土壤，拌種后的α多樣性顯著低于不拌種，說明拌根瘤菌對土壤根際原核微生物多樣性有顯著影響。綜上，拌根瘤菌會降低根周和根際原核微生物豐富度。

3.3 拌根瘤菌改變了根周和根際土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)

通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在拌根瘤菌后根周土壤和根際土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)有所不同。在門水平上放線菌門、變形菌門、酸桿菌門相對豐度較高（＞5%），在根周土壤中，變形菌門為優(yōu)勢菌群，在根際土壤中放線菌門為優(yōu)勢菌群。變形菌是細(xì)菌中最大的一個門，是革蘭氏陰性菌，它在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，尤其是在氮的促進(jìn)利用、防治植物病害、土壤修復(fù)中起到重要作用［21］。研究表明高寒地區(qū)土壤細(xì)菌優(yōu)勢門包括變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門、綠彎菌門和厚壁菌門［22-24］，與本研究的結(jié)果相同。放線菌門是根際土壤中占比較大的門，屬于革蘭氏陽性菌，它能夠拮抗病原菌，還能產(chǎn)生抗生素，分泌細(xì)胞分裂素從而促進(jìn)作物的生長［25-27］。并且可以分解纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)物，促進(jìn)土壤形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，改善土壤品質(zhì)［28］。拌根瘤菌后，禾本科和豆科的根際土壤原核生物群落中，放線菌的數(shù)量有效提高。說明拌根瘤菌后可以提高‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草、苜?！绷?01’的根際氮素利用，還可以提高牧草的抗病性。

進(jìn)一步對土壤原核微生物的屬水平進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在不同處理條件下各組的豐度存在差異。在根周土壤中，拌根瘤菌（B）中，芽球菌屬、Gp6、泛菌屬的豐度較高（＞3%），在不拌根瘤菌（N）中，Gaiella的豐度較大（＞3%），而芽球菌屬的豐度顯著降低。在根際土壤中，禾本科拌根瘤菌（HB）處理，假桿菌屬、芽球菌屬的豐度很大（＞10%），與不拌根瘤菌（HN）相比，HN中假桿菌屬顯著降低了4.01%，芽單胞菌屬、亞硝化球菌屬、嗜酸硫桿菌屬都低于拌根瘤菌的豐度。豆科根際土壤拌根瘤菌（DB）處理，假桿菌屬、芽球菌屬的豐度較大（＞10%），而與不拌根瘤菌（DN）比較，芽球菌屬在DN中顯著降低了7.06%。在根周和根際土壤微生物中，芽孢桿菌屬在拌根瘤菌后數(shù)量有效提高。研究表明芽孢桿菌屬可以促進(jìn)牧草對氮的吸收，有一定的固氮作用，可以有效減少化肥的使用［29］。亞硝化球菌屬則是對酸性土壤的硝化作用的重要驅(qū)動者，在氮循環(huán)中扮演者重要的角色，有效促進(jìn)了土壤中氮的使用［30-31］。

在拌根瘤菌后，根周和根際土壤的原核微生物群落發(fā)生了改變，微生物所處環(huán)境也發(fā)生了相應(yīng)改變，其群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了區(qū)別，拌根瘤菌后，對土壤中有益菌產(chǎn)生了影響。而且氮素循環(huán)增強(qiáng)，也引起了群落結(jié)構(gòu)上的區(qū)別。從β-多樣性結(jié)果看出，拌根瘤菌對細(xì)菌群落有一定的影響，根周和根際群落差異較大，可能是部位引起的差異或者拌根瘤菌對根周和根際的作用不同。具體原因還需后續(xù)試驗驗證。

3.4 拌根瘤菌對根周和根際土壤原核生物功能的影響

FAPROTAX能對氮、磷、氫元素循環(huán)進(jìn)行功能注釋的預(yù)測，其預(yù)測性準(zhǔn)確度較高。FARPOTAX功能預(yù)測結(jié)果表明，在根周土壤原核微生物中，拌根瘤菌導(dǎo)致了13種有氮循環(huán)的功能菌都有所增加，這可能是拌根瘤菌和根周和根際土壤原核微生物群落有益功能菌的數(shù)量有增加有關(guān)，拌根瘤菌有利于氮循環(huán)功能的加強(qiáng)。本研究利用BugBase對根周和根際土壤原核微生物群落表型進(jìn)行分析，拌根瘤菌處理，不管是在根周土壤還是根際原核微生物群落，需氧、厭氧、兼性厭氧、革蘭氏陰性、革蘭氏陽性菌的數(shù)量都發(fā)生了變化，說明拌根瘤菌會引起菌落表型的改變。之前很少有研究利用BugBase對高寒草地環(huán)青海湖地區(qū)禾/豆混播草地的根周和根際土壤原核生物群落表型進(jìn)行分析，我們的結(jié)果可以為禾/豆混播加根瘤菌拌種栽培方式的理論基礎(chǔ)提供一些新的認(rèn)識。

3.5 拌根瘤菌增加了根際土壤原核微生物nifH的豐度

研 究 結(jié) 果 顯 示，nifH定量在（1.2×107）-（16.6×107）拷貝/g土之間。拌根瘤菌與不拌種相比，豆科根際的固氮基因豐度顯著高于不拌種，說明拌種增加了固氮基因的豐度，它能夠改變微生物群落中的相對豐度，進(jìn)而影響生物固氮，提高牧草生產(chǎn)力。在青海高寒草地禾/豆混播拌根瘤菌nifH基因的定量未見報道，我們的研究認(rèn)為拌根瘤菌處理是促進(jìn)牧草生長的有效方法。

4 結(jié)論

拌根瘤菌處理改變高寒地區(qū)禾/豆混播草地土壤原核微生物的群落結(jié)構(gòu)，降低豐富度和多樣性，改變土壤理化性質(zhì)，提高牧草地上生物量。拌根瘤菌后，根周和根際土壤的變形菌、放線菌、芽孢桿菌屬、亞硝化球菌屬等有益菌的豐度顯著增加。土壤硝態(tài)氮都有所上升，且提高了nifH基因的豐度，對微生物-植株-環(huán)境的氮循環(huán)得到了有效提高。拌根瘤能夠促進(jìn)形成更穩(wěn)定且提高牧草產(chǎn)量的原核微生物群落結(jié)構(gòu)。