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        G-三鏈體可視化核酸傳感器用于四環(huán)素的檢測

        2023-01-05 08:45:34劉寧寧王鑫昕蘭欣悅褚華碩陳旭常世敏李騰飛許文濤
        生物技術(shù)通報 2022年10期
        關(guān)鍵詞:膠體金靶標孵育

        劉寧寧 王鑫昕 蘭欣悅 褚華碩 陳旭 常世敏 李騰飛 許文濤

        (1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,邯鄲 056038;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系 食品精準營養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點實驗室,北京 100083;3.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,邯鄲 056005)

        四環(huán)素(TET)屬于四環(huán)素類抗生素,是20世紀中期發(fā)現(xiàn)的一組廣譜抗生素。四環(huán)素因其廣譜活性和低成本,在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用于預(yù)防細菌感染[1],四環(huán)素還被用作生長促進劑,以提高動物的生長速度[2]。然而,由于四環(huán)素在獸藥中的過度和不當(dāng)使用,導(dǎo)致肉類、牛奶、蜂蜜、魚、蛋和蝦等制品中的抗生素殘留[3],嚴重威脅人類健康,如造成過敏反應(yīng)、細菌耐藥性、肝臟損傷和胃腸功能紊亂等[4]。因此,對動物產(chǎn)品中四環(huán)素的殘留制定了嚴格的規(guī)定。例如,歐洲聯(lián)盟(EU)將牛奶中四環(huán)素的最高殘留限量定為225 nmol/L,其他一些動物產(chǎn)品,如美國對肝臟、腎臟和肌肉組織也設(shè)定了最高殘留限量(MRL)值[5]。常用的檢測方法有儀器分析:高效液相色譜、毛細管電泳和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[6-8]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[9]和微生物抑制[10]。儀器分析是抗生素檢測中最常用和最靈敏的方法。然而,高效液相色譜、毛細管電泳法和氣相色譜-質(zhì)譜法都需要使用一些大型儀器和有機溶劑,這需要耗費很高的成本并且對人體健康和環(huán)境都有巨大的危害。此外,提取過程非常耗時。酶聯(lián)免疫吸附試驗可能獲得假陽性結(jié)果,因為它可能與具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)[11]。

        G-三鏈體是由Chua等[12]在2013年探究G-四鏈體TBA(凝血酶適配體)時首次發(fā)現(xiàn)的一種不同于之前發(fā)現(xiàn)的DNA二級結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)是將TBA序列[d(GGTTGGTGTGGTTGG)]3′端適當(dāng)截短,而折疊形成的。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)G-三鏈體結(jié)構(gòu)受分子擁擠、金屬離子濃度等影響,并證明金屬離子對G-三鏈體的穩(wěn)定順序為Ca2+>K+>Mg2+>Na+。2018年Jung等[14]假設(shè)G-三鏈體具有G-四鏈體相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的G-三鏈體可以結(jié)合硫代黃素T(ThT)作為高效的熒光探針。到目前為止,功能研究和應(yīng)用方面的報道非常有限。因此,G-三鏈體在生物傳感中的應(yīng)用研究還處于初級階段。

        適配體是通過指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化,從隨機序列核酸文庫中篩選出來的單鏈DNA/RNA寡核苷酸,是對靶分子表現(xiàn)出良好親和力和特異性的生物識別元件[15]。適配體已經(jīng)成為傳統(tǒng)識別元件的有力競爭者,并在疾病診斷和治療、農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測和食品安全檢查領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注[16]。DNA鏈可以折疊成典型的結(jié)構(gòu),包括莖、環(huán)、發(fā)夾、假結(jié)和G-四鏈體[17]。基于核酸適配體/熒光色素體系的熒光策略因其操作簡單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點而備受青睞。2014年Liu等[18]基于人端粒G-四鏈序列TEL22(人端粒G-四鏈序列)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,以硫代黃素T(ThT)為熒光探針,研制了一種一步開啟的K+熒光傳感器。在100 mmol/L Na+的干擾下,檢出限為1 mmol/L。

        硫代黃素T(ThT)是一種市售的水溶性苯并噻唑熒光色素,在游離態(tài)下表現(xiàn)出微弱的熒光發(fā)射。然而,ThT可以通過插層、溝槽結(jié)合和末端堆積識別G-四鏈體的結(jié)構(gòu),從而顯著增強其熒光強度[19]。ThT以其低成本、可商業(yè)化和G-四鏈體的選擇性鑒定而被廣泛用于設(shè)計無標記熒光適配體傳感器[20]。

        本文開發(fā)了一種基于G-三鏈體雙鏈競爭內(nèi)劈裂的新型方法,在四環(huán)素適配體5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C,與G-三鏈體序列5′-GGGCACCAAGGGTTAGGG-3′互補配對,使 G-三鏈體發(fā)生內(nèi)劈裂,靶標四環(huán)素與G-三鏈體競爭與適配體結(jié)合,靶標與適配體結(jié)合后,G-三鏈體序列斷開與適配體的互補,重新折疊為G-三鏈體,從而增強ThT熒光強度,通過測定ThT激發(fā)波長為450 nm,發(fā)射波長為490 nm處熒光強度,來確定與適配體結(jié)合的四環(huán)素的量,實現(xiàn)了四環(huán)素的檢測。適配體的引入提高了檢測的特異性,ThT作為信號輸出,增強了輸出信號,降低了檢測成本,本方法可以在25 min內(nèi)完成,且靈敏度高。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 材料與試劑 硫代黃素T(ThT)、四環(huán)素、KCl、NaCl、MgCl2、Tris、核酸序列(表1)、甲醇、蒸餾水;本實驗所有序列均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

        表1 適配體及G-三鏈體序列表Table 1 Sequence list of aptamers and G-triplex

        1.1.2 主要設(shè)備 熒光分光光度計(型號:G9800A),美國安捷倫科技有限公司;基因擴增儀(型號:A300),杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 實驗原理 本實驗原理圖如圖1所示,依據(jù)G-三鏈體可以增強ThT熒光強度,在適配體存在情況下,適配體與G-三鏈體互補配對,形成復(fù)雜的雙鏈結(jié)構(gòu),此時不能增強ThT的熒光強度,加入四環(huán)素以后,四環(huán)素與適配體結(jié)合,破壞了互補雙鏈結(jié)構(gòu),使富G序列可自由折疊形成G-三鏈體結(jié)構(gòu),從而增強ThT熒光強度,依據(jù)ThT熒光強度的增強程度對四環(huán)素進行靈敏檢測。

        圖1 G3-Apt1檢測四環(huán)素原理圖Fig.1 Schematic diagram of detecting tetracycline by G3-Apt1

        1.2.2 序列的設(shè)計 在四環(huán)素適配體5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C,得到新的四環(huán)素適配體序列 Apt1:5′-CGGTGGTGCCC-3′;將 G-四鏈 體 序 列 5′-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′[21]去掉3′端的“TTAGGG”得到一條G-三鏈體序列5′-GGGTTAGGGTTAGGG-3′,在 5′端 3 個鳥嘌呤 G之后加入與適配體互補配對堿基并分別對其進行裁短,得到G01-G07,詳細名稱、序列、堿基數(shù)見表1。

        1.2.3 適配體親和能力表征 取10 μL濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液,加入8 μL水,混勻后加入到100 μL 膠體金中 ;取 5 μL 濃度為 2 μmol/L 的適配體和 5 μL水,然后加入 100 μL膠體金 ;取 5 μL 濃度為2 μL的適配體和5 μL濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L的四環(huán)素于不同離心管(37℃孵育20 min),然后加入100 μL膠體金;室溫孵育60 min;最后各加入10 μL濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液。重復(fù)3次實驗。

        1.2.4 G-三鏈體序列的優(yōu)化 分別取10 μL濃度為20 μmol/L的G01-G07序列與適配體混勻,30℃退火后,一組加入10 μL濃度為100 μmol/L的四環(huán)素溶液;另一組加入10 μL水,然后各加入60 μL濃度為100 μmol/L的氯化鉀溶液,37℃孵育20 min后,加入10 μL濃度為100 μmol/L的ThT以激發(fā)波長為450 nm測定其490 nm處熒光強度。以F0的大小作為G01-G07序列選取依據(jù)。重復(fù)3次實驗。公式為:F0=Fa/Fb(其中Fa為加入靶標后ThT熒光強度,F(xiàn)b為不加靶標時ThT熒光強度)。

        1.2.5 傳感器的制備 取10 μL濃度為20 μmol/L的適配體序列與10 μL濃度為20 μmol/L的G-三鏈體序列混勻,95℃變性5 min,30℃退火15 min,得到傳感器記為G3-Apt1。

        1.2.6 G3-Apt1體系的優(yōu)化 本實驗中ThT熒光強度為信號來源,影響ThT熒光強度的因素有體系中離子的種類及濃度、ThT的濃度及ThT熒光強度的測定時間;同時靶標的孵育時間會影響靶標與適配體的結(jié)合,從而影響ThT的信號輸出。所以需要對體系中離子種類及濃度、ThT濃度及測定時間、靶標孵育時間進行優(yōu)化。本實驗離子體系使用NaCl、KCl、MgCl2、Tris-HCl這 4種物質(zhì)進行優(yōu)化,濃度梯度設(shè)定為 :1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L,時間設(shè)定為:0、5、10、20和30 min。重復(fù)3次實驗。

        1.2.7 靈敏度檢測及標準曲線的繪制 為了檢測G3-Apt1用于四環(huán)素的檢測能力,在優(yōu)化得到的最佳條件下,配制濃度為10 mmol/L的四環(huán)素溶液,稀釋10 000倍后得到濃度為1 μmol/L的四環(huán)素溶液,然后分別稀釋得到濃度500、100、50、10、5和1 nmol/L的四環(huán)素溶液,并加入到制備好的G3-Apt1傳感器中,加入 10 μL 濃度為 100 μmol/L 的 ThT,測定以450 nm為激發(fā)波長490 nm處ThT的熒光強度,通過測定加入不同濃度四環(huán)素后ThT熒光強度,得到四環(huán)素檢測限及定量限,來驗證G3-Apt1傳感器的靈敏度,根據(jù)加入不同濃度的四環(huán)素測定的ThT熒光強度值繪制標準曲線。重復(fù)3次實驗。

        1.2.8 特異性檢測 為了檢測G3-Apt1傳感器的特異性,選取了鹽酸四環(huán)素、土霉素(四環(huán)素類)、氯霉素(酰胺醇類)、鏈霉素(氨基糖苷類)、林可霉素(林可胺類)在內(nèi)的5種常見抗生素進行了G3-Apt1方法的特異性分析,采用與四環(huán)素溶解相同的方法溶解,并稀釋至1 μmol/L,取10 μL與G3-Apt1傳感器反應(yīng)。重復(fù)3次實驗。

        1.2.9 實際樣品中檢測 為了評價該方法在實際樣品中的檢測性能,首先將原料奶2 mL放入15 mL離心管中,用水稀釋至5 mL,然后加入1 mL的10%三氯乙酸和1 mL的氯仿,在旋渦下混合1 min,沉淀蛋白質(zhì),溶解樣品基質(zhì)中的脂肪和其他有機物。混合物在20℃下超聲處理15 min,在13 000 r/min下離心10 min以分離沉淀物,取上清液。分別測定加入四環(huán)素濃度為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L牛奶樣品與G3-Apt1反應(yīng)后ThT的熒光強度,進行 3次重復(fù)檢測,通過計算ThT激發(fā)波長為450 nm、發(fā)射波長為490 nm處的熒光強度,來計算四環(huán)素的回收率,通過回收率來確定方法用于實際樣品檢測的性能。

        2 結(jié)果

        2.1 適配體親和能力表征

        為了驗證在適配體序列5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C,得到新的四環(huán)素適配體序列Apt1:5′-CGGTGGTGCCC-3′與四環(huán)素親和能力,利用膠體金進行測定。從圖2-A中可以看出,加入四環(huán)素以后,膠體金由紅色變?yōu)樽仙?,說明由于靶標與適配體的結(jié)合,而缺少單鏈對膠體金的穩(wěn)定作用,使膠體金易發(fā)生聚沉,同時隨著靶標濃度的增大膠體金聚沉程度更高,并且1 μmol/L靶標與2 μmol/L適配體即可發(fā)生膠體金的沉淀,因此適配體Apt1對四環(huán)素具有較好親和力。

        圖2 適配體及序列優(yōu)化圖Fig.2 Aptamer and sequence optimization diagram

        2.2 G-三鏈體序列的優(yōu)化

        根據(jù)1.2.4中的方法,為了便于明顯比較加入靶標后ThT熒光強度的變化,以及不同序列加入靶標后ThT熒光強度變化,以F0值作為判斷G-三鏈體序列性能的依據(jù)。得到G01-G07加入靶標前后ThT熒光強度的比值F0,結(jié)果如圖2-B所示,G03序列的F0值要明顯高于其他序列,這可能是由于四環(huán)素適配體序列與G-三鏈體序列在至少互補8對堿基時,已經(jīng)完全將富G序列封閉為雙鏈結(jié)構(gòu),但是封閉9對堿基的G02和封閉10對堿基G01序列,卻由于封閉過于嚴密而在加入靶標四環(huán)素以后不能將雙鏈打開釋放富G序列,導(dǎo)致F0值要比G03序列低。因此,G03序列為傳感器制備的最佳序列。

        2.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化

        為了探究反應(yīng)的最佳體系,分別在不同環(huán)境中進行反應(yīng),得到結(jié)果如圖3-A所示,ThT熒光強度為本實驗的信號輸出源,反應(yīng)體系對ThT熒光強度的增強程度越高,表示反應(yīng)體系越有利于靶標與適配體的結(jié)合,氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀3種溶液加入Tris-HCl后(圖3-A,1-3),均較不加入(圖3-A,5-7)時對ThT熒光強度增強效果較低,可能是因為Tris-HCl的加入會對靶標與適配體的結(jié)合產(chǎn)生影響;在不加入Tris-HCl的3種溶液對比中,KCl溶液(圖3-A,7)對ThT熒光強度增強效果最好。然后又對KCl濃度進行了優(yōu)化,如圖3-B所示,KCl最佳濃度為100 μmol/L。所以最佳反應(yīng)體系為100 μmol/L的KCl溶液。

        圖3 不同條件下ThT熒光強度Fig.3 ThT fluorescence intensities under different conditions

        2.4 適配體孵育時間

        靶標與適配體的孵育時間會影響靶標與適配體的結(jié)合程度,從而影響到G-三鏈體的形成,進而影響ThT的信號輸出。為了優(yōu)化適配體的孵育時間,本實驗通過測定靶標與適配體孵育不同時間時ThT的熒光強度,來選擇適配體與靶標孵育的最佳時間。從圖4-A中可以看出,隨著孵育時間的變化,ThT的熒光強度逐漸增強,直到20 min時達到最強,所以選定20 min為靶標與適配體的孵育時間。

        圖4 時間的優(yōu)化圖Fig.4 Time optimization

        2.5 ThT熒光強度測定時間

        作為熒光素,在不同溶液條件下,ThT熒光衰減均非常迅速,甚至可達ps、ns級別,因此,ThT熒光強度會發(fā)生快速淬滅。為了探究ThT熒光強度測定的最佳時間,本實驗探究了ThT熒光強度隨時間變化關(guān)系。從圖4-B中可以看出隨著時間的變化,ThT熒光強度逐漸降低,在2-3 min時有一個短暫的穩(wěn)定狀態(tài),可能是由于ThT的加入,誘導(dǎo)更多的G07序列折疊為G-三鏈體結(jié)構(gòu),從而在2-3 min時,ThT熒光強度形成了一個短暫的平衡狀態(tài),所以ThT熒光強度會在2-3 min時出現(xiàn)一個穩(wěn)定期。所以測定ThT熒光強度時一定要把握住時間,在加入ThT后2-3 min內(nèi)完成熒光強度的測定。

        2.6 G3-Apt1反應(yīng)體系靈敏的測定及標準曲線的繪制

        應(yīng)用基于G3-Apt1傳感器獲得的ThT熒光強度值如圖5-A所示,隨著四環(huán)素濃度的增加ThT熒光強度逐漸增強,并在1 nmol/L-1 μmol/L之間有良好的線性關(guān)系。標準曲線如圖5-B所示,ThT熒光強度與四環(huán)素濃度之間的線性關(guān)系方程為Y=36.67lgX+61.02,R2為0.99,線性關(guān)系良好,通過測定加入不同濃度四環(huán)素后ThT熒光強度,得到四環(huán)素的檢測限(LOD)為0.07 nmol/L。

        圖5 G3-Apt1傳感器的建立圖Fig.5 Establishment of G3-Apt1 sensor

        2.7 特異性檢測

        從圖6中可以看出,四環(huán)素和鹽酸四環(huán)素的熒光差異不大,可能是因為鹽酸與四環(huán)素反應(yīng)生成鹽酸四環(huán)素以后并未破壞四環(huán)素與適配體的識別位點,說明該傳感器還具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力;土霉素、氯霉素、鏈霉素、林可霉素?zé)晒鈴姸然緸楸尘爸?,明顯低于四環(huán)素?zé)晒鈴姸龋f明傳感器具有很好的特異性。

        圖6 特異性驗證圖Fig.6 Specificity verification chart

        2.8 實際樣品檢測

        通過G3-Apt1傳感器得到的四環(huán)素在牛奶樣品中的回收率表,如表2所示,回收率均低于108%,符合規(guī)定,表明G3-Apt1傳感器可用于牛奶樣品的檢測。

        表2 牛奶樣品中四環(huán)素添加回收表Table 2 Addition and recovery table of tetracycline in milk samples

        3 討論

        在不同溶液條件下,ThT熒光衰減均非常迅速,甚至可達ps、ns級別,因此,ThT熒光強度會發(fā)生快速淬滅。K+的存在會誘導(dǎo)G07序列折疊為G-三鏈體結(jié)構(gòu),ThT會嵌入到G-三鏈體從而增強ThT的熒光強度[22],但由于ThT熒光強度會自發(fā)進行衰減,G-三鏈體只能減緩這種衰減,而不能停止ThT熒光強度衰減。但由于ThT的加入,誘導(dǎo)更多的G07序列折疊為G-三鏈體結(jié)構(gòu),從而在2-3 min時,ThT熒光強度形成了一個短暫的平衡狀態(tài),所以ThT熒光強度會在2-3 min時出現(xiàn)一個穩(wěn)定期。加入ThT以后,要在2-3 min內(nèi)完成ThT熒光測定,以確保避免同時測量多個孔時,因ThT熒光強度快速衰減造成的誤差。

        熒光生物傳感器最近經(jīng)常被用于四環(huán)素的檢測,其中 5-羧基熒光素(fluorescein amidite,F(xiàn)AM)[23]、Cy3[24]、Cy5[25]等作為熒光基團,通常被用于標記型生物傳感器的開發(fā),來作為熒光信號的輸出,但標記型熒光傳感器在標記過程中通常都特別繁瑣,而且標記過程也非常耗時耗力,不利于目標物質(zhì)的快速檢測。本方法以熒光素ThT作為熒光信號輸出,無需復(fù)雜的標記過程,應(yīng)用于試劑盒以后在25 min內(nèi)即可對四環(huán)素的檢測。

        Khaled 等[26]建立了全自動固相微萃取法用于四環(huán)素的檢測,但此方法檢測限為 10 μg/kg;De Faria等[27]建立了一種使用鹽酸沉降蛋白后分離上清液,注入柱交換系統(tǒng),上清液流經(jīng)含限制性碳納米管的萃取柱,借助六通閥實現(xiàn)轉(zhuǎn)換管路,并使用梯度流動相凈化萃取柱后洗脫檢測的方法,此方法檢測限為 9.22-13.20 μg/L ;Zhao 等[28]合成了新型HLB 柱填料 CTPCC-TP,這種方法檢測限為8.0-16.8 μg/kg。噻唑橙(TO)熒光探針能夠與四環(huán)素G-四鏈體適配體結(jié)合,嵌入到四環(huán)素適配體中,2018年 Sun 等[29]利用TO建立了一種靈敏、快速、無標記的四環(huán)素?zé)晒膺m配體傳感器,此方法檢測限為29 μg/L。2020年 Dai等[30]基于四環(huán)素適配體的 G-四鏈結(jié)構(gòu)和ThT,研制了一種用于四環(huán)素快速檢測的無標記熒光適配體傳感器,此方法檢測限為0.44 μg/L。本文開發(fā)的以ThT熒光強度為信號輸出,通過G-三鏈體與四環(huán)素適配體競爭結(jié)合實現(xiàn)G-三鏈體內(nèi)劈裂的方法用于四環(huán)素的檢測,檢測限低至0.03 μg/L。

        G3-Apt1方法的檢測無需大型儀器,操作簡便,并且引物無需任何修飾,成本低廉,符合快速檢測以及商業(yè)化的應(yīng)用,有望推廣于其他藥物及生物分子的檢測,對鹽酸四環(huán)素有很好的特異性,具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力。

        4 結(jié)論

        成功構(gòu)建了基于G- 三鏈體的雙鏈競爭內(nèi)劈裂可視化核酸傳感器定量檢測四環(huán)素。檢測范圍為1 nmol/L-1 μmol/L,R2達到0.99以上,檢測限低至0.07 nmol/L,并且在25 min內(nèi)可以完成檢測,選擇了鹽酸四環(huán)素、土霉素、氯霉素、鏈霉親和素、林可霉素與傳感器反應(yīng),發(fā)現(xiàn)該方案特異性良好,并且還具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力。

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