陳黎 盧茜 楊紅蘭 張鵬，2 何志旭，2，3

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴陽(yáng)550004；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，遵義 563000）

基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的位點(diǎn)特異性突變?cè)谏茖W(xué)領(lǐng)域越來(lái)越普遍［1］，該技術(shù)已應(yīng)用于基因治療、基因功能研究、動(dòng)物模型制作及農(nóng)作物品種改良等領(lǐng)域［2］。由于載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、靶向位點(diǎn)選擇靈活等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛用于各類細(xì)胞的基因編輯［3］。該技術(shù)利用人工設(shè)計(jì)的向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)外源表達(dá)的Cas9蛋白與基因組的靶位點(diǎn)特異性地結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA特異性地切割。靶位點(diǎn)被切割后，一般會(huì)通過(guò)DNA損傷修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，在此過(guò)程中多會(huì)引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因突變。目前，檢測(cè)細(xì)胞基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)為DNA測(cè)序法，但進(jìn)行測(cè)序的周期較長(zhǎng)，不利于CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物的快速及高通量篩選。因此，建立一種高效快速地檢測(cè)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變的方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）分析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用于突變掃描和基因分型的新技術(shù)。其原理為：熔解曲線與DNA的序列長(zhǎng)度、GC含量及雙鏈互補(bǔ)性相關(guān)［4］，堿基序列發(fā)生替換、缺失、插入等改變均可引起DNA熔解曲線的變化，通過(guò)高靈敏度熒光定量PCR儀檢測(cè)的熔解曲線變化，把野生型、純合突變型及雜合突變型予以鑒別［5］。不同與其他突變掃描方法，高分辨率熔解曲線技術(shù)進(jìn)行突變分析為閉管操作，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，減少了分析時(shí)間，不需要在PCR后進(jìn)行樣品處理或分離［6］。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、耐藥菌株基因分型、單核苷酸多態(tài)性分型、甲基化檢測(cè)等方面的研究［7-11］。

本研究建立的高分辨率熔解曲線法能夠鑒別野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用建立的高分辨率熔解曲線分析方法能對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的小鼠胚胎干細(xì)胞基因突變進(jìn)行快速檢測(cè)，是一種靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高通量的方法。該高分辨率熔解曲線方法將為細(xì)胞基因突變快速篩選及細(xì)胞基因功能研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

配制的細(xì)胞裂解液成分為：①Tris 50 mmol/L，②CaCl210 mmol/L，③蛋白酶K 250 ng/mL，④SDS 1.7 μmol/L， ⑤ 雙 蒸 水 ；KnockOut DMEM、KSR、NEAA、Glutamine及β-巰基乙醇均購(gòu)買于Thermo Scientific公司；雙抗購(gòu)買于Biological Industries公司；LIF購(gòu)買于Merck公司；PD0325901及CHIR99021購(gòu)買于MedChemExpress公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買于invitrogen公司；小鼠胚胎干細(xì)胞制備參考文獻(xiàn)［12］；甲基結(jié)合蛋白1基因的Cas9/sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建參考文獻(xiàn)［13］；TB Green Premix Ex Taq II為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；CFX96熒光定量PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在經(jīng)0.2%明膠包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液為KnockOut DMEM含15% KSR，1%NEAA，1% 雙 抗，1% Glutamine，0.1 mmol/L β-巰基 乙 醇，1 000 units/mL LIF，1 μmol/L PD0325901，3 μmol/L CHIR99021。將甲基結(jié)合蛋白1基因的Cas9/sgRNA表達(dá)載體使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染2 d后將培養(yǎng)液換為含有終濃度為1 mg/L的嘌呤霉素培養(yǎng)液，嘌呤霉素篩選2 d后消化細(xì)胞，然后重懸細(xì)胞，在不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.2.2 基因突變細(xì)胞的鑒定 使用10 μL槍頭在體視顯微鏡下挑取小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆，將胚胎干細(xì)胞單克隆消化后，分別將30%（板1）及70%（板2）的細(xì)胞培養(yǎng)在兩個(gè)不同的96孔板中。96 h后，板2中的小鼠胚胎干細(xì)胞融合度達(dá)70%-80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一遍，然后加入50 μL的細(xì)胞裂解液。用封板膜將96孔板封板后，按以下條件處理：-20℃，30 min；55℃，150 min；85℃，10 min。最終以細(xì)胞裂解液為DNA模板，進(jìn)行HRM分析及DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)甲基結(jié)合蛋白1基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游引物，敲除位點(diǎn)位于甲基結(jié)合蛋白1基因的第2號(hào)外顯子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近。

HRM1 上游引物為 ：5′-CGGGAGACGTTGGAAACTCA-3′，HRM1 下游引物為 ：5′-GAGCACACCCGTTACCTCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為394 bp。

HRM2 上游引物為 ：5′-CTTGCAGGCTTCTGTTCTGT-3′，HRM2 下游引物為 ：5′-ACTCTCGGCGTTTCCAGCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為91 bp。

DNA測(cè)序引物同HRM1引物。

1.2.4 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：0.8 μL細(xì)胞裂解液、0.8 μL上游引物（HRM1、HRM2）、0.8 μL下 游 引 物（HRM1、HRM2）、TB Green Premix Ex Taq II：10 μL、無(wú)酶無(wú)菌水補(bǔ)足至總體積20 μL。

采用HRM1引物時(shí)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min；39個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s）；95℃ 3 min；95℃ 30 s；40℃1 min；熔解溫度60-94.5℃，0.3℃/步，增加0.3℃/10 s。

采用HRM2引物時(shí)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min；39個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s）；95℃ 3 min；95℃ 30 s；40℃1 min；熔解溫度60-94.5℃，0.3℃/步，增加0.3℃/10 s。

1.2.5 HRM分析結(jié)果驗(yàn)證甲基結(jié)合蛋白1基因突變 對(duì)30個(gè)測(cè)序結(jié)果已知的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過(guò)的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆進(jìn)行HRM檢測(cè)，根據(jù)熔解溫度與熔解曲線的差異區(qū)分野生型、純合突變型和雜合突變型，以驗(yàn)證建立的HRM方法的可行性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 HRM檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

根據(jù)甲基結(jié)合蛋白1基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行HRM分析的上下游引物，分別以野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞裂解液為DNA模板進(jìn)行PCR，PCR結(jié)束后直接進(jìn)行HRM分析。結(jié)果表明，野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為394 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型的模板所產(chǎn)生的熔解曲線差異較小，另外熔解溫度與溫度變化梯度（導(dǎo)數(shù)）結(jié)果顯示，394 bp擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)兩個(gè)峰值（圖1）。為了提高HRM檢測(cè)的靈敏度，縮短了進(jìn)行HRM分析的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。當(dāng)野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為91 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型的熔解曲線具有明顯差異，并且導(dǎo)數(shù)圖峰值只有一個(gè)（圖2）。表明優(yōu)化后的HRM檢測(cè)方法能準(zhǔn)確地鑒別野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細(xì)胞。測(cè)序結(jié)果見圖3。

圖1 野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為394 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型高分辨率熔解曲線分析圖Fig.1 Analysis of high-resolution melting of wild-type mESCs，homozygous mutation mESCs and heterozygous mutation mESCs when the PCR product of wild-type mESCs is 394 bp

圖2 野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為91 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型高分辨率熔解曲線分析圖Fig.2 Analysis of high-resolution melting of wild-type mESCs，homozygous mutation mESCs and heterozygous mutation mESCs when the PCR product of wild-type mESCs is 91 bp

圖3 野生型、雜合突變型和純合突變型的測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of wild-type mESCs，heterozygous mutation mESCs and homozygous mutation mESCs

2.2 HRM分析結(jié)果驗(yàn)證甲基結(jié)合蛋白1基因突變

用本研究建立的HRM方法對(duì)30個(gè)測(cè)序結(jié)果已知的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過(guò)的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆進(jìn)行檢測(cè)和分析。測(cè)序結(jié)果表明，14個(gè)小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆為野生型，未發(fā)生基因突變。16個(gè)突變的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆中，14個(gè)單克隆為雜合突變型，2個(gè)單克隆為純合突變型。代表性測(cè)序結(jié)果見圖4。HRM結(jié)果顯示，14個(gè)雜合突變型、2個(gè)純合突變型與14個(gè)野生型小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆的熔解溫度有明顯區(qū)別（圖5）。此外，通過(guò)高分辨率熔解曲線圖可以明顯區(qū)分出野生型、雜合突變型和純合突變型（圖6）。表明該HRM分析法準(zhǔn)確地鑒別出甲基結(jié)合蛋白1基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆，并且與測(cè)序結(jié)果一致，靈敏度與特異性均為100%。

圖4 代表性野生型、雜合突變型和純合突變型的測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of typical wild-type mESCs，heterozygous mutation mESCs and homozygous mutation mESCs

圖5 30例CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過(guò)的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆熔解溫度結(jié)果Fig.5 Results of melting temperature of 30 monoclones of mESCs edited by CRISPR/Cas9 techniqe

圖6 30例CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過(guò)的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆高分辨率熔解曲線圖Fig.6 High-resolution melting curve of 30 monoclones of mESCs edited by CRISPR/Cas9 technique

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一類廣泛存在于細(xì)菌和古生物菌體內(nèi)的免疫防御系統(tǒng)，可以用來(lái)抵御外源核酸的入侵［14-15］，CRISPR/Cas9技術(shù)基于這一系統(tǒng)改造而來(lái)。近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成為科研領(lǐng)域一項(xiàng)很熱門的技術(shù)，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便，成本低、效率高且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)編輯等優(yōu)勢(shì)［16］，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種模式生物及細(xì)胞的基因編輯［17-19］。因此，對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變進(jìn)行快速檢測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景及重要的實(shí)踐意義。本研究?jī)?yōu)化并建立了篩選細(xì)胞基因突變的方法，為CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變檢測(cè)提供了一種操作簡(jiǎn)便、分析周期短的新選擇。

目前，常采用酶錯(cuò)配切割方法和DNA測(cè)序法對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)切割產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。酶錯(cuò)配切割方法是一種低成本、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)基因突變的方法［20］，但該方法靈敏度較低，且產(chǎn)物進(jìn)行電泳后需肉眼觀察，可能會(huì)引入人為的誤差，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差［21］。DNA測(cè)序法是檢測(cè)細(xì)胞基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但樣本進(jìn)行DNA測(cè)序前實(shí)驗(yàn)操作流程繁瑣，需進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的DNA條帶、瓊脂糖凝膠電泳及PCR純化等步驟。樣本送檢后，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，需幾天才能得到測(cè)序結(jié)果。因此，采用DNA測(cè)序法檢測(cè)細(xì)胞基因突變，需較長(zhǎng)的時(shí)間完成突變篩選，不能對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)。且DNA測(cè)序的成本較高，不利于大規(guī)模的基因突變篩選。有研究報(bào)道，在DNA測(cè)序前應(yīng)用高分辨率熔解曲線進(jìn)行突變掃描是一種有效、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)基因突變和減少測(cè)序工作的方法［22］。本研究建立的高分辨率熔解曲線法可以快速高效地檢測(cè)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變，實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單，無(wú)需提取基因組DNA，無(wú)需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，無(wú)需序列特異性探針。只需設(shè)計(jì)特異性引物，以細(xì)胞裂解液為DNA模板，熒光定量PCR完成后，直接進(jìn)行熔解曲線分析即可。與酶錯(cuò)配切割方法和DNA測(cè)序法相比，該高分辨率熔解曲線法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，詳見表1。

表1 3種檢測(cè)CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物方法比較Table 1 Comparison of three methods of detecting gene products edited by CRISPR/Cas9 technique

本研究采用的高分辨率熔解曲線技術(shù)是通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與擴(kuò)增產(chǎn)物之間的結(jié)合情況而完成，堿基序列發(fā)生替換、缺失、插入等均可引起DNA熔解曲線的變化，進(jìn)而能有效區(qū)分出野生型、純合突變型及雜合突變型。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度是影響高分辨率熔解曲線關(guān)鍵問(wèn)題之一，有研究表明，進(jìn)行HRM分析的擴(kuò)增產(chǎn)物較短時(shí)，能夠提高HRM檢測(cè)的靈敏度［23］。本研究中，野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為394 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型的模板所產(chǎn)生的熔解曲線差異較小。而縮短了進(jìn)行熔解曲線分析的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)?1 bp時(shí)，野生型、純合突變型及雜合突變型的熔解曲線具有明顯差異，熔解曲線辨識(shí)度非常好，能清晰辨別基因型。表明優(yōu)化后的HRM分析方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，能夠準(zhǔn)確地鑒別野生型、純合突變型及雜合突變型。應(yīng)用本研究建立的HRM方法對(duì)30個(gè)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過(guò)的小鼠胚胎干細(xì)胞單克隆進(jìn)行分析，檢測(cè)出14個(gè)雜合突變型、2個(gè)純合突變型及14個(gè)野生型，靈敏度和特異性均為100%，純合突變型及雜合突變型可以根據(jù)熔解溫度與熔解曲線的差異有效地與野生型進(jìn)行區(qū)分。提示該HRM法能對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變進(jìn)行快速篩選，是一種高效、準(zhǔn)確的分子診斷方法。

本研究建立了細(xì)胞基因突變的高分辨率熔解曲線檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、可靠、重復(fù)性好，可用于大規(guī)模的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變分析，為細(xì)胞基因突變快速篩選及細(xì)胞基因功能研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變?nèi)狈`敏、快速的檢測(cè)方法問(wèn)題，建立了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量的高分辨率熔解曲線分析方法。經(jīng)過(guò)條件的優(yōu)化，該高分辨率熔解曲線法能明顯區(qū)分出野生型、純合突變型及雜合突變型，同時(shí)應(yīng)用建立的高分辨率熔解曲線分析方法能對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞基因突變進(jìn)行高效快速地檢測(cè)。