劉爽 姚佳妮 沈聰 代金霞

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

荒漠生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最為脆弱的系統(tǒng)之一，其物種組成和分布格局具有獨特性，且隨著生物土壤結(jié)皮、植被的不斷演變，微生物的群落結(jié)構(gòu)和群落功能也會隨之發(fā)生變化［1］?；哪参锔蹬c土壤微生物關(guān)系密切，植物根系及其分泌物為土壤微生物在荒漠化土壤中的定殖提供了源源不斷的植物源有機(jī)基質(zhì)，而根際微生物為植物富集生長所必需的元素［2］，在荒漠植物的生長和抗逆方面起到了重要的作用。生物固氮是荒漠生態(tài)系統(tǒng)中氮素補(bǔ)充的重要途徑［3］。固氮微生物作為驅(qū)動氮循環(huán)的媒介，正受到越來越廣泛的關(guān)注［4］。固氮菌通過體內(nèi)固氮酶催化生物固氮過程，編碼固氮酶的基因（包括nifH，nifK，nifD）在不同固氮生物中高度保守［5］，其中nifH 基因是最保守的，并且在系統(tǒng)發(fā)育分析中所產(chǎn)生的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與16S rRNA 基因非常相似［6-7］，故被選為研究固氮微生物系統(tǒng)發(fā)育、多樣性和豐度的首選標(biāo)記基因，以nifH 基因為靶基因的分子技術(shù)在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用也為研究氮循環(huán)微生物群落提供了新的途徑。

目前對荒漠土壤中固氮菌多樣性、豐度和群落組成的了解仍然有限，已有的研究主要采用克隆和PCR-DGGE 等方法，無法反映荒漠區(qū)不同地域固氮微生物群落的全貌。因此開展荒漠生境中土壤固氮微生物的群落組成和多樣性研究，不僅有助于發(fā)掘新的功能類群或功能潛力，以從微觀的角度理解生態(tài)環(huán)境的變化，而且對了解荒漠土壤中氮素循環(huán)調(diào)節(jié)具有重要意義。檸條（Caraganaspp.）是我國西北地區(qū)荒漠、半荒漠及干旱草原地帶防風(fēng)固沙的先鋒植物之一［8］，具備極強(qiáng)的抗旱性、抗寒性和耐鹽堿性，在維護(hù)干旱荒漠區(qū)的生態(tài)平衡和改善沙區(qū)環(huán)境中發(fā)揮著十分重要的生態(tài)學(xué)作用。本研究以寧夏荒漠區(qū)5 個檸條群落根際土壤為研究材料，以nifH基因為靶基因，采用熒光定量PCR 和高通量測序技術(shù)，分析荒漠生境下檸條根際土壤中nifH 基因豐度信息和固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)合分離培養(yǎng)方法對檸條根際固氮菌進(jìn)行分離篩選和多樣性研究，旨在為進(jìn)一步挖掘固氮菌資源、豐富荒漠區(qū)微生物資源庫提供基礎(chǔ)資料，也為深入探索荒漠化生境中植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 選取寧夏同心羅山（LS）、紅寺堡石炭溝（HSP）、沙坡頭固沙林場（SPT）、靈武棗泉煤礦（ZQ）和白芨灘甜水河林場（TSH）5 個荒漠檸條群落進(jìn)行土壤樣品采集，采樣信息見圖1。采用五點取樣法，將檸條根周圍的土挖開，待根暴露出來后，將根部附著的土壤用毛刷輕輕刷取到滅菌離心管中，混勻后編號放于冰盒中。每個樣地采集3 份，共采集15 份土樣，一部分用于土壤理化性質(zhì)測定，另一部分用于DNA 的提取。

圖1 檸條根際土壤采集地示意圖（審圖號：GS（2019）1822）Fig.1 Sampling sites of rhizosphere soil of Caragana spp.（Map inspection number：GS（2019）1822）

1.1.2 培養(yǎng)基 采用YMA 培養(yǎng)基（KH2PO40.25 g、K2HPO40.25 g、NaCl 0.1 g、酵母提取物3 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、甘露醇10.0 g、Rh 微量元素液4 mL（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L、蒸餾水加至1 000 mL）、聯(lián)合固氮類培養(yǎng)基（KH2PO40.4 g、K2HPO40.1 g、D-葡萄糖酸鈉5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.02 g、FeCl30.01 g、酵母提取物 0.8 g、鉬酸鈉0.002 g、蒸餾水1 000 mL）、固氮類芽孢桿菌培養(yǎng)基（蔗糖10.0 g、蛋白胨1.0 g、酵母提取物0.8 g、NaCl 0.1 g、CaCO35.0 g、KH2PO40.2 g、K2HPO40.08 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL）和無氮培養(yǎng)基（甘露醇10.0 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.2 g、CaCO35.0 g、蒸餾水1 000 mL）進(jìn)行固氮菌的分離。采用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1nifH 基因?qū)崟r熒光定量PCR

1.2.1.1 土壤樣品總DNA 提取 使用試劑盒提取根際土壤基因組總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的抽提效果和完整性。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備 以提取的土壤DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增引物采用nifH-F（5′-AAAGGYGG WATCGGYAARTCCACCAC-3′）和nifH-R（5′-TTGTTS GCSGCRTACATSGCCATCAT-3′），獲得約458 bp 的基因片段。PCR 產(chǎn)物純化后連接到 T 載體，篩選陽性克隆體提取質(zhì)粒，10 倍梯度稀釋構(gòu)建好的質(zhì)粒樣本，選取標(biāo)準(zhǔn)品的10-3-10-8濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量 PCR 擴(kuò)增，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3nifH 基因熒光定量PCR 采用ABI7300 實時定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行檢測，通過SYBR Green I 染料法測定固氮菌nifH 基因的拷貝數(shù)。每個樣品設(shè)3 次重復(fù)，以不加模板的反應(yīng)管為陰性對照。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，擴(kuò)增35 個循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。以熒光強(qiáng)度達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct 值）與濃度梯度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將得到的樣品 Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算樣品中nifH 基因的拷貝數(shù)。

1.2.2nifH 基因的高通量測序 將回收的nifH 基因PCR 產(chǎn)物委托上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Illumina 高通量測序。將得到的序列根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，成對的reads 拼接成一條序列，同時對reads 的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。再將樣本中的有效序列在97%水平上進(jìn)行OTU 聚類，根據(jù)OTU 聚類結(jié)果，進(jìn)行多樣性指數(shù)分析及測序深度檢測；根據(jù)分類學(xué)信息，在各個分類水平上對樣本的群落組成進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 可培養(yǎng)固氮菌的分離及鑒定

1.2.3.1 固氮菌富集和初步篩選 取土壤10 g 加入裝有90 mL 分離培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩富集培養(yǎng)24 h，然后按照1%接種量轉(zhuǎn)接到新的分離培養(yǎng)基中進(jìn)一步富集培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接3-4 次，然后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（10-4-10-7），分別取200 μL 不同濃度梯度的土壤懸液涂布于對應(yīng)的分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至菌落長出后，挑取單菌落分別在分離平板上劃線純化3-4 次，對菌落進(jìn)行形態(tài)觀察與記錄，并在LB 培養(yǎng)基上對菌株進(jìn)行去重復(fù)和保存。

1.2.3.2nifH 基因復(fù)篩 采用引物nifH-F/nifH-R 對菌株的nifH 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，陰性對照使用ddH2O 作為模板。挑選能夠擴(kuò)增出目的片段為458 bp 左右的陽性菌株，經(jīng)測序驗證后確定為固氮菌。

1.2.3.3 生理生化特性分析 對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解、接觸酶和硝酸鹽還原等生理生化，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第8 版）對菌株進(jìn)行鑒定［10］。

1.2.3.4 菌株16S rRNA 基因序列擴(kuò)增和測序 使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株基因組DNA 的16S rRNA 基因全長序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)回收驗證后送上海生工生物工程有限公司測序，將得到的序列在NCBI 網(wǎng)站比對，選取相似度高的菌株作為參考菌株，應(yīng)用MEGA 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 23.0 進(jìn)行單因素方差分析和Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同樣地檸條根際土壤固氮菌nifH基因的豐度分析

通過RT-qPCR 反應(yīng)對5 個檸條群落根際土壤樣品中的nifH 基因含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明（表1），各樣地中nifH 的拷貝數(shù)表現(xiàn)為LS＞TSH＞ZQ＞HSP＞SPT，其中LS 樣地的nifH 基因拷貝數(shù)顯著高于其它4 個樣地，而其它樣地間nifH 的拷貝數(shù)沒有顯著差異，SPT 樣地nifH 基因拷貝數(shù)最低，說明LS 樣地檸條根際土壤固氮菌含量顯著高于其他樣地，而SPT 樣地檸條根際土壤固氮菌含量最低。

表1 nifH 基因Ct 值和定量結(jié)果Table 1 Ct values and quantitative results of nifH gene

2.2 檸條根際土壤固氮菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 檸條根際土壤固氮菌群落OTU 聚類及Alpha多樣性分析 本研究通過對5 個檸條樣地根際土樣固氮菌菌群進(jìn)行Illumina Miseq 高通量測序，共獲得264 763 條有效序列，將序列相似性大于97%的有效序列進(jìn)行聚類，共獲得5 871 個OTUs，各樣地nifH 基因測序深度指數(shù)范圍為98.39%-98.86%，說明測序深度能夠反映檸條根際真實的固氮菌群落組成及多樣性信息。不同樣地檸條根際土壤中固氮菌群落豐富度和多樣性存在差異，由表2中群落多樣性指數(shù)結(jié)果可知，表征群落豐富度的Sobs、Chao1 和Ace 指數(shù)在各樣地間的表現(xiàn)均為LS＜TSH＜HSP＜SPT＜ZQ，說明LS 樣地檸條根際土壤固氮菌的豐富度最低，而ZQ 樣地中固氮菌的豐富度最高；表征群落多樣性的Shannon 指數(shù)在各樣地中的表現(xiàn)為LS＜TSH＜HSP＜ZQ＜SPT，Simpson 指數(shù)為LS ＞HSP ＞ZQ ＞TSH ＞SPT，說明固氮菌菌群的多樣性為LS 樣地中最低，SPT 樣地則高于其他樣地。

表2 不同樣地固氮菌OTUs 數(shù)目及 Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Number of OTUs and Alpha diversity index of nitrogen-fixing bacteria at different sample sites

2.2.2 檸條根際土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)組成分析 測序結(jié)果通過物種注釋，5 份檸條根際土壤共獲得7 門12 綱26 科30 屬固氮菌。從科水平的Venn 圖可以看出（圖2-A），5 個樣地共有固氮菌11 個科，LS、SPT 各有1 個特有科，TSH 有4 個特有科。圖2-B 顯示，未分類的固氮菌在檸條根際占有較大比重，相對豐度為14.57%-56.51%。在可定義的科中，除SPT 樣地外，其余4 個樣地均以紅螺菌科（Rhodospirillaceae）為優(yōu)勢菌群，相對豐度為23.71%-73.45%，在LS 樣地豐度最高；產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）為次優(yōu)勢科，相對豐度在3.84%-13.68%之間。而SPT 的固氮菌群落與其它樣地差別較大，以葉桿菌科（Phyllobacteriaceae）為優(yōu)勢科，相對豐度為22.77%，遠(yuǎn)高于其它樣地，紅螺菌科為次優(yōu)勢科，占17.43%；假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）和類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）也是5 個樣地的共有類群，它們的相對豐度在不同的樣地中差別較大。

圖2 檸條根際土壤固氮菌在科水平的Venn 圖（A）及群落組成柱形圖（B）Fig.2 Venn diagram（A）and column diagram（B）of community composition of nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere soil of Caragana spp.at family level

在屬水平上，5 個樣地共有屬12 個，SPT、LS和TSH 分別有特有屬1、2 和6 個。TSH 樣地分布有27 個屬，屬水平的多樣性顯著高于其他樣地（圖3-A）。群落組成結(jié)果顯示（圖3-B），5 個樣地中未分類的固氮菌相對豐度為16.89%-57.03%。在可定義的屬中，斯科曼氏球菌屬（Skermanella）是SPT以外4 個樣地共有的優(yōu)勢屬，相對豐度為23.19%-71.14%，在LS 樣地中占絕對優(yōu)勢，相對豐度高達(dá)71.14%；廣泛固氮氫自養(yǎng)單胞菌屬（Azohydromonas）是次優(yōu)勢屬，相對豐度3.84%-13.68%。SPT 樣地中以中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）為優(yōu)勢屬，相對豐度為22.77%，顯著高于其它4 個樣地（0.26%-5.83%），斯科曼氏球菌屬為次優(yōu)勢屬，占17.09%。固氮菌屬（Azotobacter）雖是共有屬，但其相對豐度在各樣地間有較大差異，占0.41%-5.89%，在TSH中豐度最高。

圖3 檸條根際土壤固氮菌在屬水平的Venn 圖（A）及群落組成柱形圖（B）Fig.3 Venn diagram（A）and column diagram（B）of community composition of nitrogen-fixing bacteria in rhizosphere soil of Caragana spp.at genus level

2.3 環(huán)境因子相關(guān)性分析

將檸條根際土壤nifH 基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果表明（表3），nifH基因拷貝數(shù)與土壤速效磷、有機(jī)質(zhì)和總氮（P＜0.005）呈顯著正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為0.924、0.965 和0.977。

表3 nifH 基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson 相關(guān)分析Table 3 Pearson correlation analysis between nifH gene copy number and soil physicochemical properties

相關(guān)性Heatmap 圖通過相關(guān)性數(shù)值可視化展示樣本中不同的物種與環(huán)境變量之間的關(guān)系，評估微生物分類與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。將30 個固氮菌類群和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，土壤總氮（total nitrogen，TN）、速效氮（availliable nitrogen，AN）、總磷（total phosphorus，TP）和有機(jī)質(zhì)（soil organic matter，SOM）顯著影響固氮菌群落組成。一些未分類的固氮菌如Unclassified_o__Rhizobiales和Unclassified_p__Proteobacteria等與SOM 和TN 極顯著負(fù)相關(guān)，而Unclassified_o_Burkholderiales與速效磷（availliable phosphorus，AP）、速效鉀（availliable kalium，AK）、SOM 和TN 極顯著正相關(guān)。慢生根瘤菌屬和弗蘭克氏菌屬（Frankia）受多種土壤因子影響，與AN 和pH 極顯著正相關(guān)，與SOM 和TN 顯著正相關(guān)；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）與AK 和TK 顯著負(fù)相關(guān)，與AN 極顯著正相關(guān)。固氮菌屬與TN 和TP 顯著正相關(guān)。

2.4 檸條根際土壤可培養(yǎng)固氮菌的多樣性分析

2.4.1 固氮菌的生理生化特征測定結(jié)果 采用4 種分離培養(yǎng)基從5 個檸條群落根際土壤中分離出固氮菌株53 株，通過nifH 基因的擴(kuò)增與測序，其中有26個菌株擴(kuò)增出了450 bp 左右的目的片段（GenBank序列登錄號為OL799110-OL799133）。菌株的生理生化特征測定結(jié)果表明，有19 株為革蘭氏陰性菌，僅有7 株為革蘭氏陽性菌。大部分菌株H2O2酶反應(yīng)呈陽性，而只有一株菌株淀粉水解為陽性，且V.P、甲基紅和吲哚反應(yīng)中呈陽性的菌株也較少，分別為4 株、5 株和4 株，具體結(jié)果見表4。

2.4.2 菌株分子鑒定結(jié)果 對26 個菌株進(jìn)行16S rRNA 基因序列分析，并與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，同源性在 99%-100%之間，結(jié)合重建的系統(tǒng)發(fā)育樹信息（圖5），結(jié)果表明，這些菌株隸屬于15 個屬，在屬水平上多樣性豐富，有常見的假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）和腸桿菌屬（Enterobacter）等，分離的假單胞菌屬占代表菌株的23.08%，是根際優(yōu)勢菌屬。還包括一些不常見報道的固氮類群如微桿菌屬（Microbacterium）、貪噬菌屬（Variovorax）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）等。將所測菌株的16S rDNA 序列提交至GenBank，獲得序列登陸號為OL757766-OL757791。

圖5 基于 16S rRNA 基因序列構(gòu)建的檸條根際固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere soil of Caragana spp.based on the 16S rRNA gene sequences

3 討論

實時熒光定量技術(shù)是檢測環(huán)境樣品中特定基因的有效手段，通常采用絕對定量對環(huán)境中的基因豐度進(jìn)行測定［11-12］。nifH 基因作為衡量土壤氮循環(huán)的有效指標(biāo)，其豐度的變化受到多個環(huán)境因子的調(diào)控［13］。已有研究表明，nifH 基因豐度與土壤磷和速效鉀等土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)［14］。張萌等［4］的研究結(jié)果表明，在內(nèi)蒙古3 種草原類型土壤中nifH 基因的豐度與土壤氨態(tài)氮和總氮含量顯著正相關(guān)；類似地，Chen 等［15］分析了秸稈覆蓋和施氮處理后固氮菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系，結(jié)果顯示nifH 基因豐度與SOM、AK、AP 和AN 含量呈正相關(guān)。在本研究中，5 個檸條群落根際土壤固氮基因nifH 的拷貝數(shù)與AP、SOM 和TN 呈顯著正相關(guān)，與前人的結(jié)果一致，表明固氮菌豐度和分布受到不同生境中非生物和生物因素共同影響，其通過強(qiáng)大的適應(yīng)能力來順應(yīng)環(huán)境的變化并發(fā)揮固氮功能。

基于nifH 擴(kuò)增子測序?qū)幭幕哪畢^(qū)5 個檸條群落根際土壤中固氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：屬水平上的斯科曼氏球菌屬和未分類的Proteobacteria 是5 個樣地的優(yōu)勢菌群，這與唐凱等［16］對渾善達(dá)克沙地下層土壤固氮細(xì)菌群落優(yōu)勢菌屬的研究結(jié)果類似，同樣鄭超等［17］的研究結(jié)果表明戈壁荒漠土壤固氮菌優(yōu)勢類群也與本文一致。也有研究通過nifH 高通量測序發(fā)現(xiàn)斯科曼氏菌屬是黃瓜間作所有樣品中的優(yōu)勢菌屬［18］。類似地，Zou等［19］的研究結(jié)果表明隨著黑土中連續(xù)種植玉米的年數(shù)增加，斯科曼氏菌屬的相對豐度增加，但土壤氮素并沒有累積，因為該屬含有nifH 基因但不能固定N2［20］，有關(guān)斯科曼氏菌屬的生態(tài)功能有待進(jìn)一步驗證。此外，還檢測到中慢生根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、念珠藻屬和弗蘭克氏菌屬等共生固氮菌類群，以及固氮菌屬和類芽孢桿菌屬等聯(lián)合固氮菌，這些固氮菌多樣性豐富具有多種促生及抗逆的生態(tài)功能，能與荒漠植物在逆境脅迫下相互選擇、共同進(jìn)化，形成了獨特的抗逆抗旱系統(tǒng)，有效保障了物種生態(tài)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮［21］。已有的研究表明，pH、總氮、總碳、總鉀和速效氮都會顯著影響固氮微生物群落的多樣性與結(jié)構(gòu)［5，22］。本研究中，土壤總氮、速效氮、總磷和有機(jī)質(zhì)顯著影響固氮微生物群落，與劉璐等［23］的研究結(jié)果一致。蔡樹美等［24］對灘涂土壤固氮菌群落的研究同樣表明影響較大的主要環(huán)境因子為有機(jī)質(zhì)和速效磷等，說明土壤理化性質(zhì)是影響固氮微生物群落的重要因素之一。

從寧夏5 個不同荒漠區(qū)檸條群落根際土壤中分離出15 個固氮菌屬，在屬水平上多樣性豐富，包括共生固氮菌如根瘤菌屬和中華根瘤菌屬，聯(lián)合固氮菌如假單胞菌屬和腸桿菌屬。其中假單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬，占代表菌株的23.08%，與楊鴻儒［25］和雷海英［26］的研究結(jié)果一致?；诩賳伟敝晨臁⒍ㄖ衬芰?qiáng)、營養(yǎng)要求簡單，且能夠抑制多種植物病害和促進(jìn)植物生長的特點，因而在環(huán)境中分布范圍廣且對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)［27］。5 個荒漠土壤生境還分離出一些不常見的固氮類群如不動桿菌屬（Acinetobacter）、勒克氏菌屬（Leclercia）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、微桿菌屬、貪噬菌屬和短波單胞菌屬。已有研究發(fā)現(xiàn)，這些菌屬都具有固氮和溶磷能力，有些還具有多種PGP（plant growth promoting）功能和拮抗病原菌活性［28-32］。此外還分離出布丘氏菌屬和Pseudescherichia，目前還未見有這兩個類群固氮功能的報道，但兩者都能在篩選培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接正常生長，也能擴(kuò)增出nifH 基因并得到測序驗證。由于環(huán)境、植物以及根系分泌物的不同會招募不同的固氮類群，而本研究樣地也分離出了一些特異的固氮類群，充分反映了寧夏荒漠區(qū)檸條根際可培養(yǎng)固氮菌的多樣性。

高通量測序結(jié)果分析表明5 個樣地中并沒有檢測到可培養(yǎng)固氮菌如假單胞菌屬、勒克氏菌屬和根瘤菌屬等，可能是由于引物對nifH-F/nifH-R 有一定的偏好性，無法全面覆蓋nifH 基因的多樣性［33］；此外基于特征性分子標(biāo)靶基因片段擴(kuò)增子得到的OTU 不足以代表含有該特征片段的所有微生物，特別是稀有物種，其標(biāo)靶基因序列可能與已知菌株具有較大差異而無法被現(xiàn)有方法檢測［34］。而高通量測序中的一些優(yōu)勢菌屬如斯科曼氏菌屬沒有被分離出來，可能由于培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件的限制，缺少一些固氮菌需要的營養(yǎng)物質(zhì)，如鈷胺素、生物素等［35-37］，而導(dǎo)致其無法生存。但本研究將高通量測序和純培養(yǎng)的方法相結(jié)合，更全面地分析了檸條根際土壤固氮菌的結(jié)構(gòu)組成和多樣性特征，為深入了解荒漠生境中固氮微生物群落構(gòu)成及固氮菌資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

寧夏荒漠檸條林地土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，其中LS 固氮菌含量高但多樣性最低，而SPT固氮菌含量最低但多樣性高。紅螺菌科、產(chǎn)堿菌科、葉桿菌科等為主要固氮類群。土壤總氮、速效氮和有機(jī)質(zhì)等顯著影響固氮微生物的群落組成。檸條根際土壤中可培養(yǎng)固氮菌多樣性十分豐富，對于荒漠生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和恢復(fù)具有重要意義。