高惠惠 賈晨波 韓琴 蘇建宇 徐春燕

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

寧夏枸杞是當(dāng)?shù)氐奶厣е越?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，幾年來栽培面積迅速擴(kuò)大，傳統(tǒng)的種植方式及栽培連作致使枸杞病蟲害不斷發(fā)生，其中根腐病一旦發(fā)生，尤為嚴(yán)重［1］。根腐病是一種真菌性土傳病害，致病原因復(fù)雜多樣，病原菌被認(rèn)為是主要因素之一［2］。據(jù)報(bào)道，腐霉菌［3］、鏈格孢［4］、疫霉菌［5］和絲核菌［6］、鐮刀菌［7］等均能引起作物患根腐病。病原菌侵入根部引起腐爛，葉部逐漸脫落，直至全株枯死。根腐病在全國的枸杞種植區(qū)都有發(fā)生，目前從甘肅、青海、新疆等地枸杞發(fā)現(xiàn)的病原菌有尖孢鐮刀菌、單隔鐮刀菌、同色鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌、疫霉菌和絲核菌［7-9］，從寧夏枸杞中發(fā)現(xiàn)的病原菌有尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、同色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌和立枯絲核菌［10-12］。高通量測序技術(shù)為全面了解根腐病的發(fā)生機(jī)制提供了新的視角，從土壤微生物群落角度研究根腐病已被廣泛地應(yīng)用于多種作物中［13］。通過微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性獲取與根腐病發(fā)生相關(guān)的菌群信息將有助于深入了解根腐病的發(fā)生機(jī)制，但是，多數(shù)研究集中于作物的根際微生物上，鮮有研究關(guān)注到與根聯(lián)系最緊密的根表微生物。根表微生物主要是附著在根表面的真菌和細(xì)菌［1］，其中有益菌與有害菌的“博弈”對于維持健康的土壤生態(tài)系統(tǒng)有重要意義［14］。

本研究采集了寧夏中寧縣恩和鎮(zhèn)枸杞種植區(qū)的寧杞7 號枸杞健康株和根腐病患病株的根部樣品，擬從可培養(yǎng)真菌和不可培養(yǎng)真菌兩個層面研究寧杞7 號枸杞根腐病發(fā)生的機(jī)制。首先基于Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行ITS1 片段擴(kuò)增子的高通量測序，分析寧杞7 號枸杞健康株和根腐病患病株的根表微生物群落組成。其次采用組織分離法分離腐根上的真菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)特征確定所分離真菌的分類學(xué)地位；依據(jù)柯赫法則進(jìn)行進(jìn)行回接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證各類真菌的致病性，確定病原菌；最后本研究將從根表微生物群落結(jié)構(gòu)及病原菌兩個角度探究寧杞7 號枸杞罹患根腐病的微生物學(xué)機(jī)制，為枸杞根腐病的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣地為寧夏中寧恩和枸杞種植區(qū)（杞泰農(nóng)業(yè)科技有限公司，37°29′N，105°44′E）。選取3 株有明顯根腐病癥狀的寧杞7 號枸杞植株，剖去其根部周圍土壤，將病根全部挖出分別收集、編號，用于分離腐根真菌和制備根表樣品，3 株即為3 個生物學(xué)重復(fù)。在同一樣地采集3 株寧杞7 號枸杞健康植株的根部，用作對照。所采集的樣品及時放入低溫冰袋保藏箱，帶回實(shí)驗(yàn)室暫存于-20℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 根表樣品的制備 將枸杞健康根與腐根用無菌剪刀剪成小段，分別置于無菌PBS 溶液中，于4℃、180 r/min 振蕩20 min 后取出根組織，再置入新的無菌PBS 溶液中，相同條件下處理20 min。將兩次處理后的液體合并、混勻，于10 000 r/min、4℃離心10 min，棄去上清液，沉淀即為根表樣品。

1.2.2 根表樣品DNA 的提取與擴(kuò)增子測序 使用DNeasy Power Soil Pro Kit 試劑盒提取根表樣品的真菌群落總DNA。檢驗(yàn)合格的DNA 送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行擴(kuò)增子測序。擴(kuò)增片段為ITS1 區(qū)段，所使用引物為ITS1F 和ITS2R，測序平臺為Illumina 公司的Miseq PE300。

1.2.3 腐根真菌的分離純化 將腐根用無菌剪刀剪成小段（0.5 cm左右）后完全浸入75%乙醇中處理5 s，而后置于次氯酸鈉溶液中處理30 s，最后用無菌水沖洗3 遍，處理后的根段用無菌濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)接在PDA 培養(yǎng)基中。于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置，每天觀察，待長出菌落后挑取尖端菌絲進(jìn)行純化，多次純化直至獲得純培養(yǎng)物，所分離的菌株于4℃保存于PDA 斜面上。

1.2.4 形態(tài)學(xué)鑒定 參照《真菌鑒定手冊》，根據(jù)菌落的顏色、菌絲形態(tài)、生長速率（第5 天時測量直徑）、孢子形狀等特征進(jìn)行分類鑒定。

1.2.5 分子鑒定 采用OMEGA 試劑盒進(jìn)行基因組DNA 的提取，使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［15］擴(kuò)增菌株的ITS 序列進(jìn)行鑒定，使用鐮刀菌屬特異性引物EF1（5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′）和EF2（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）［15］對初步鑒定為鐮刀菌屬的菌株（ITS 序列經(jīng)BLAST 比對相似度不足100%的鐮刀菌）進(jìn)行TEF 序列擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所獲取的序列使用NCBI 進(jìn)行比對，下載參比序列，采用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 病原菌的致病性鑒定 采用傷根法和灌根法相結(jié)合的方法對目標(biāo)菌株進(jìn)行致病性驗(yàn)證。使用滅菌混合土壤（沙土∶營養(yǎng)土∶椰糠=1∶1∶1）于室溫移栽寧杞7 號枸杞的一年生植株至直徑為30 cm的花盆中，待幼苗生長穩(wěn)定后接種目標(biāo)菌株。除去盆栽枸杞根部周圍土壤使根部暴露，用滅菌刀片輕輕劃傷根皮，將目標(biāo)菌株的菌懸液澆灌于枸杞根部，每個菌種接種5 盆，接種量為100 mL/盆，用作對照的5 株枸杞采用同樣的方法傷根后接入等量的PDB 培養(yǎng)基。保持適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸葘ζ溥M(jìn)行常規(guī)管理，觀察并記錄各植株的表型。待植株發(fā)病后，挖出腐根用1.2.3 所述組織分離法再次分離并純化腐根真菌，若再次分離得到所接種的菌株，即確定該菌為寧杞7 號枸杞的病原菌。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，使用FLASH 軟件將成對的reads 拼接（merge）成一條序列，同時通過fastp 軟件對reads 的質(zhì)量和merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到有效序列。使用UPARSE 軟件根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類，用RDP classifier 進(jìn)行序列分類注釋，Mothur 軟件進(jìn)行Alpha 多樣性分析。數(shù)據(jù)分析用Excel2016 處理，SPSS17 進(jìn)行顯著性分析，所有分析都基于抽平后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 健康株與患病株根表真菌OTU分類及多樣性分析

采用高通量測序獲得根表樣品的原始序列數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)控后得到了6 個樣品共350 292 條真菌有效序列，聚類為823 個OTUs，分屬于3 門11 綱61 科125 屬。對OTU 進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，患病株和健康株的根表真菌分別分為371 和734 個OTU（圖1），其中共有的OTU 數(shù)目為261 個，健康株根表真菌特有的OTU 數(shù)目是患病株的4.38 倍，提示健康株根表具有更多的真菌種類。

圖1 健康株與患病株根表真菌的OTU 韋恩圖Fig.1 Venn diagram of rhizoplane fungi in the healthy and diseased plants based on OTU analysis

Alpha 多樣性分析表明（表1），所有樣品的測序覆蓋率均達(dá)99%以上，說明所測得的OTU 數(shù)量基本能反映樣品的真實(shí)情況。與患病株相比，健康株根表真菌的Simpson 指數(shù)較低，Shannon 指數(shù)較高（Simpson 指數(shù)值越小，Shannon 指數(shù)值越大，群落多樣性越高），表明患病株根表真菌群落的多樣性水平低于健康株。健康株根表樣品的Sobs 和ACE 指數(shù)均顯著高于患病株（P＜0.05），表明患病株根表真菌群落的豐富度水平也顯著低于健康株。

表1 根表真菌的Alpha 多樣性Table 1 Alpha diversity of rhizoplane fungi of the healthy and diseased plants

2.2 健康株與患病株根表真菌的群落組成

門水平上（圖2-A），患病株與健康株根表真菌群落組成基本一致，但相對豐度差異較大。與健康株相比，患病株根表真菌中子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度較高，占比達(dá)97.81%，而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）的豐度則較低。

屬水平上（圖2-B），將兩組樣品中相對豐度大于1%的真菌群落剔除unclassified 后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患病株根表真菌群落中的5 個優(yōu)勢屬（豐度＞1%）占比高達(dá)82.83%，分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、粘帚霉屬（Clonostachys）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）和被孢霉屬（Mortierella）；健康株根表真菌群落中的優(yōu)勢屬（豐度＞1%）也有5 個，總占比僅為31.10%，分別是被孢霉屬、鐮刀菌屬、地絲霉屬（Geomyces）、鏈格孢屬（Alternaria）和土赤殼屬（Ilyonectria）。可以看出，健康株與患病株根表真菌的群落結(jié)構(gòu)差異很大，其中差異最大的是Clonostachys，在健康株根表的豐度只有0.14%，而在患病株根表的豐度卻高達(dá)31.24%。差異較大的類群還有Fusarium（10.38%和38.81%）、Mortierella（14.09% 和1.86%）、Plectosphaerella（0.90% 和6.24%）、Pseudogymnoascus（0.23% 和4.11%）以及Geomyces（4.37%和0.06%）。患病株根表Fusarium、Plectosphaerella、Pseudogymnoascus的豐度分別比健康株根表高2.74 倍、5.93 倍和16.87倍，而Mortierella和Geomyces豐度分別低86.80%和98.63%。相較而言，Ilyonectria和Alternaria在兩組樣品中的豐度差異較小。

圖2 健康株和患病株門水平（A）和屬水平（B）上根表真菌的組成與相對豐度Fig.2 Composition and relative abundance of rhizoplane fungi at the phylum（A）and genus（B）levels of healthy and diseased plants

2.3 腐根真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

從3 個腐根樣品中共分離純化到33 株真菌，據(jù)形態(tài)學(xué)觀察初步分為四大類。第一類（QT116和QT320）：菌落墨綠色，菌絲呈從狀著生，梗頂端多次分枝，分生孢子圓形，初步鑒定為青霉屬（Penicilliumsp.）；第二類（QT201 和QT207）：菌落白色厚絨花瓣?duì)?，產(chǎn)明黃色色素，生長緩慢，培養(yǎng)5 d 后直徑為2.7 cm 和3.0 cm，分生孢子梗分枝較多，分生孢子梭形，未確定種屬；第三類（QT209、QT311、QT312 和QT317）：菌落紅褐色，無大孢子，小孢子桿狀或卵圓形，未確定種屬；第四類：菌落和孢子形態(tài)特征與鐮刀屬較為一致，初步鑒定為Fusariumsp.。

對Fusariumsp.進(jìn)一步形態(tài)分類鑒定發(fā)現(xiàn)：QT104、QT107、QT109、QT115、QT119、QT126、QT302、QT303、QT321 和QT324 菌落白里透紫，絨毛狀較厚，大孢子纖細(xì)，兩端較尖，小孢子卵圓形，與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）形態(tài)一致；QT106、QT108、QT120、QT121、QT123、QT125、QT127、QT128、QT130、QT204、QT307、QT310、QT316、QT318 和QT322 菌落白色，氈狀較稀疏或菌落土黃色，卷羊毛狀，大孢子鐮刀狀，兩端鈍圓，小孢子橢圓形，和腐皮鐮刀菌（F.solani）形態(tài)一致。各類代表性菌株的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)如圖3。

圖3 代表性菌株的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.3 Colony morphologies and microscopic morphologies of representative strains

2.4 基于ITS和TEF序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示：QT201 和QT207 與粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）聚為一支，置信度為100%；QT116 和QT320 與Penicilliumsp.聚為一類；QT209、QT311、QT312 和QT317 與紅貝俄氏孔菌（Earliella scabrosa）聚為一支，親緣關(guān)系近，置信度為99%；QT104、QT107、QT109、QT115、QT119、QT126、QT302、QT303、QT321、QT324 與Fusarium oxysporum聚為一支，置信度為100%；其余15 個菌分別與F.solani聚為一類，置信度均大于98%。

圖4 基于ITS 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS gene sequences

基于TEF 序列構(gòu)建的鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）共分兩大支，分屬為F.oxysporum和F.solani，其鑒定結(jié)果與ITS 序列的鑒定結(jié)果一致。測序所得菌株序列已全部上傳至GenBank，ITS 序列登錄號為OL744574-OL744604 和OL744606-OL744607；TEF序列登錄號為OL799141、OL799143-OL799147、OL799149-OL799159。

圖5 基于TEF 基因序列構(gòu)建的鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Fusarium based on TEF gene sequences

綜上，共從寧杞7 號腐根樣品中分離到33 株真菌，經(jīng)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定，分屬于鐮刀菌屬、青霉屬、多孔菌屬和粘帚霉屬4 個屬，從中選擇菌株F.oxysporumQT104、F.solaniQT204、Penicilliumsp.QT116 和QT320、E.scabrosaQT312、C.roseaQT201 六個代表性菌株進(jìn)行回接實(shí)驗(yàn)，用于致病性驗(yàn)證。

2.5 致病性鑒定

回接實(shí)驗(yàn)顯示，菌株QT104、QT204 和QT201接入后寧杞7 號枸杞植株出現(xiàn)根腐病類似癥狀，而菌株QT116、QT320 和QT312 接入后均未使枸杞患病。接入F.oxysporumQT104 和F.solaniQT204 25 d后，植株葉尖變黃、卷曲，隨著時間推移，葉片從失綠變褐到葉片少量變枯，最后枯萎或大量葉片脫落。將全部根從盆栽中刨出后發(fā)現(xiàn)其根部變黑腐爛，皮層脫落，只剩木質(zhì)部，側(cè)根處有少量白色菌絲附著。接入C.roseaQT201 的植株病害程度相對較輕，但延長時間后也出現(xiàn)上述癥狀（圖6）。采用組織分離法將發(fā)病植株的腐根進(jìn)行再次分離純化（圖7），并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)水平的鑒定，鑒定結(jié)果均與所接入的F.oxysporum、F.solani一致，符合柯赫法則，故將F.oxysporum、F.solani確定為寧杞7 號枸杞的根腐病病原菌。而接入C.roseaQT201 的枸杞植株，雖出現(xiàn)根腐病癥狀，但未能從腐根上再次分離出C.rosea，故尚無法完全確定C.rosea是否為寧杞7 號枸杞的根腐病病原菌。

圖6 接種3 種菌株25 d 后枸杞根腐病的發(fā)病癥狀Fig.6 Symptoms of L.barbarum root rot 25 d after inoculation with 3 strains

圖7 接種3 種菌株25 d 后發(fā)病枸杞的腐根真菌再分離Fig.7 Re-isolation of root-rot fungi from L.barbarum 25 d after inoculation with 3 strains

3 討論

本研究從根表微生物群落結(jié)構(gòu)及病原菌兩個角度出發(fā)，探究寧杞7 號枸杞罹患根腐病的微生物學(xué)機(jī)制。在枸杞腐根組織中共分離出15 株F.solani、10 株F.oxysporum、4 株E.scabrosa、2 株C.rosea以及2 株P(guān)enicillium，除E.scabrosa外均屬于子囊菌。子囊菌是患病株根表的絕對優(yōu)勢門，相對豐度為97.81%，它的營養(yǎng)方式為腐生、寄生和共生，含有許多有害菌屬，能引起植物患?。?6］。其中Fusarium是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中危害最重的病害真菌類群之一，是報(bào)道次數(shù)最多的病原菌，常引起植物患根腐?。?-12］。Fusarium也是患病株根表的最優(yōu)勢屬，相對豐度為38.81%，在可培養(yǎng)真菌中Fusarium的分離頻率也是最高的。所有菌株經(jīng)柯赫法則驗(yàn)證后，確定枸杞根腐病病原菌為F.solani和F.oxysporum。尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）被列為世界上第五大植物病原真菌[17]，其寄主范圍廣泛；腐皮鐮刀菌（F.solani）也是世界上最具破壞性的土傳病原菌之一［18］。F.solani和F.oxysporum對枸杞的致病性在1994年王國珍［10］對根腐病病原菌的研究中已被證實(shí)，2021年陳思杰等［12］再次證實(shí)了F.oxysporum能使枸杞患根腐病但未分離到F.solani，且F.oxysporum在兩個報(bào)道中均為最優(yōu)勢的類群（分離頻率最高）。在前人的研究中，F(xiàn).oxysporum對枸杞的危害甚于F.solani，而本研究發(fā)現(xiàn)兩種病原菌中F.solani的分離頻率（45.45%）遠(yuǎn)高于F.oxysporum（30.30%），與王國珍和陳思杰的研究有所不同。本研究中所選用的枸杞為寧杞7 號栽培種，該品種是2010年選育出的無性系新品種，隨后被逐漸推廣［19］，其栽培歷史較短，研究結(jié)果所呈現(xiàn)出的差異是否因枸杞品種不同所致，值得深入探究。Clonostachys在患病株根表的相對豐度位列第二，為31.24%，但在健康株根表中的相對豐度僅有0.14%，推測它可能是與根腐病發(fā)生相關(guān)的真菌類群。關(guān)于Clonostachys是否會引起植物患病并沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，Haque［20］和Afshari［21］研究發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致甜菜和蠶豆發(fā)生根腐病，而吳海霞、Mudassir 等［22-23］發(fā)現(xiàn)它是一種真菌寄生真菌，能夠抑制產(chǎn)生真菌毒素的鐮刀菌，可作為生防菌開發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)菌株C.roseaQT201 和QT207 在進(jìn)行致病性驗(yàn)證時不符合柯赫法則，暫不能被確定為枸杞病原菌，后續(xù)的相關(guān)研究還在進(jìn)行中。

在健康株根表真菌群落中發(fā)現(xiàn)Ascomycota 也是最優(yōu)勢門，比例超過50%，F(xiàn)usarium的相對豐度也達(dá)10%。為什么健康株根表存在大量鐮刀菌卻未患??？這可能與枸杞根表的微生物群落結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。比較患病株與健康株的根表真菌群落Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)，患病株根表真菌群落多樣性和豐富度水平均低于健康株，與謝玉清［16］和Tan 等［24］對作物土傳病害植株根區(qū)土壤真菌群落的研究結(jié)果一致，這可能是發(fā)生根腐病的一個重要標(biāo)志。另外，患病株根表富集著大量的Fusarium和Clonostachys，二者豐度和占比達(dá)70.05%，可見菌群比例嚴(yán)重失衡，破壞了原有健康的群落結(jié)構(gòu)。相較患病株而言，健康株根表真菌群落組成更為豐富，雖然存在鐮刀菌，但其益生菌Mortierella作為最優(yōu)勢屬，與病原菌平衡對峙，使微生態(tài)環(huán)境趨于穩(wěn)定。而Mortierella在患病株根表中的相對豐度只有1.06%，在生態(tài)位、資源競爭中處于劣勢，被Fusarium以絕對優(yōu)勢壓制。因此，微生物菌群比例的失衡以及多樣性的改變也是引起根腐病的主要因素，平衡健康的微生物群落結(jié)構(gòu)可能是其抵御病原菌的策略之一。

4 結(jié)論

寧杞7 號枸杞根腐病患病株根表的真菌群落豐富度及多樣性均低于健康株，微生物群落組成已嚴(yán)重失衡。從患病株腐根上分離的33 株真菌歸 為Fusariumsp.、Penicilliumsp.、Earliellasp.和Clonostachyssp.四個屬。經(jīng)柯赫法則驗(yàn)證后，確定了寧杞7 號枸杞根腐病的2 種病原菌F.solani和F.oxysporum。本研究從根表微生物群落結(jié)構(gòu)與病原菌兩個角度揭示了寧杞7 號枸杞根腐病的發(fā)生不僅與病原菌有關(guān)，也與群落結(jié)構(gòu)失衡密切相關(guān)。