尹卓然 軒棟棟 李晨依 李長(zhǎng) 柴哲，2 王錕瑤 趙孟琦 彭靖媛 董杰 賈宏昉

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2.陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，西安 710000）

鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一種微量元素，可以通過(guò)活化葉綠素合成相關(guān)酶、呼吸作用相關(guān)酶進(jìn)而影響植物光合作用、呼吸等生理活動(dòng)，最終影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［1］。煙草是一種重要的葉用模式植物和經(jīng)濟(jì)作物。煙草缺鐵時(shí)會(huì)出現(xiàn)葉片黃化［2］，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)［3-4］。研究煙草對(duì)鐵的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)可以有針對(duì)性的阻止缺鐵環(huán)境對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的危害，提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究表明，廣泛存在于植物中的NRAMP 家族主要參與植物對(duì)鐵（Fe）、錳（Mn）和鎘（Cd）等金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。擬南芥（Arabidopsis thaliala）中已有6 個(gè)NRAMP 家族基因的功能被證實(shí)［6-10］，其中AtNRAMP1參與Mn 和Fe 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［11］，AtNRAMP3和AtNRAMP4參與Mn 和Fe 的再利用［12］，且編碼蛋白位于液泡膜上。水稻（Oryza sativa）中有7 種NRAMP 家族基因已被報(bào)道［13-17］，其中OsNRAMP1負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 和Fe［18］，OsNRAMP2參與Fe 從液泡到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［19］，楊猛［20］研究表明OsNRAMP3 主要參與Mn 的再利用，OsNRAMP5是Fe、Mn 和Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，OsNRAMP6 為Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

關(guān)于煙草NRAMP 家族成員的功能鮮見(jiàn)報(bào)道，陳邦蘭等［21］推測(cè)有10 個(gè)成員屬于NRAMP 家族，其中Tang 等［22］研究表明NtNRAMP5編碼的蛋白定位于質(zhì)膜，有轉(zhuǎn)運(yùn)Mn 和Cd 的能力。Jia 等［23］研究證實(shí)NtNRAMP3編碼的蛋白定位于液泡膜，有轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 的能力，但關(guān)于NRAMP 基因家族成員在煙草中對(duì)Fe 的功能尚未明晰。

本研究從煙草中克隆獲得一個(gè)NRAMP 家族基因，通過(guò)鑒定該基因與其他物種基因的同源性，命名為NtNRAMP3b，進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR 和轉(zhuǎn)基因技術(shù)系統(tǒng)探究了NtNRAMP3b在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能，為明晰NtNRAMP3b在煙草轉(zhuǎn)運(yùn)鐵中的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草品種K326（Nicotiana tabacumcv，K326）作為供試材料，將煙草種子置于黑暗培養(yǎng)室（溫度28℃）中生長(zhǎng)，培養(yǎng)3 d，然后將發(fā)芽的幼苗置于光照培養(yǎng)箱（光16 h 28℃/暗8 h 22℃，光強(qiáng)為300 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度60%）中。采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液水培法，營(yíng)養(yǎng)液pH 調(diào)至7.0［24］。在種子露白后使用1/4 正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，之后更換為1/2正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，最后更換為正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)K326 進(jìn)行正常處理（CK：霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液）和缺鐵處理（-Fe：0 μmol/L FeSO4·7H2O與Na2-EDTA 螯合物），處理7 d 后取樣將收集的植物用去離子水洗滌，樣品的根、莖、幼葉和老葉（幼葉為完全展開(kāi)的葉片從上往下數(shù)第2 片，老葉為完全展開(kāi)的葉片從上往下數(shù)第7 片）用于測(cè)定基因的瞬時(shí)表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 參考煙草在GenBank 收錄的煙草NtNRAMP3b基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank 登錄號(hào)：XM_016614857.1）中已發(fā)表的序列數(shù)據(jù)，利用煙草K326 的基因特異性引物（F：5′-ATGCCTCCACACGATGACGA-3′；R：5′-TCAATTCTCTATGCTGGTGA-3′），以煙草cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。送Invitrogen 生物公司測(cè)序驗(yàn)證，獲得全長(zhǎng)cDNA 序列信息。

1.2.2 序列分析方法 利用NCBI 軟件的Open Reading Frame Viewer（ORF）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行基因序列的蛋白翻譯，利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）和PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）分析NtNRAMP3b 的蛋白結(jié)構(gòu)，利用在線網(wǎng)站NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測(cè)NtNRAMP3b 的磷酸化位點(diǎn)，利用TMHMM-2.0（https://services.hea lthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)NtNRAMP3b 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用DNAMAN 進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)、分析同源性，利用MEGA6.0 制作鄰接樹(shù)（neighbor-joining tree，NJ），分析NtNRAMP3b與NRAMP 家族成員的親緣關(guān)系，在線網(wǎng)站MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析序列基序（motif），利用TBtools［25］將NJ-tree 和motif 組合，對(duì)NtNRAMP3b 與煙草、擬南芥中已經(jīng)研究的NRAMP 家族進(jìn)行序列分析。

1.2.3 啟動(dòng)子分析 以煙草NtNRAMP3b全長(zhǎng)序列為探針，利用Sol Genomics Network 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索基因全長(zhǎng)，在ATG 上游取一段長(zhǎng)2 000 bp 的啟動(dòng)子序列，利用PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具分析啟動(dòng)子序列的順式元件。

1.2.4 基因表達(dá)分析 運(yùn)用Primer Premier6.0 軟件設(shè)計(jì)NtNRAMP3b基因擴(kuò)增引物序列（F：5′-GATGACGAACAGCAACAAT-3′；R：5′-AATGACAACACCAGACCAA-3′），按照Invitrogen 公司的RealMaster-Mix（SYBR Green）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以煙草組成型表達(dá)基因NtL25（GenBank：L18908.1，引物序列為F：5′-CCGTCCAAAAAATCTGACCC-3′；R：5′-TCTTCAAAGTCTTAGGTCGG-3′）為內(nèi)參基因，3 次重復(fù)試驗(yàn)，采用2-ΔΔCT算法進(jìn)行分析，ΔΔCT=Treat（樣品-L25）-CK（樣品-L25）［26］。

1.2.5 載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 對(duì)測(cè)序正確的NtNRAMP3bcDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到基因全長(zhǎng)序列，并設(shè)計(jì)引物（NtNRAMP3b-OE）與pCAMBIA1305 載體連接，該載體由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S 啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶終止子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)菌液 PCR 檢測(cè)對(duì)比后，得到過(guò)表達(dá)載體 pCAMBIA1305-NtNRAMP3b。利用電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性菌液侵染野生型煙草K326［27］，室內(nèi)繁種，收取轉(zhuǎn)基因植株T0種子，繁種獲得T2純合植株用于接下來(lái)的研究。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草株系對(duì)鐵的耐受性鑒定

1.2.6.1 觀察煙草表型并記錄生物量 將WT 和NtNRAMP3b-OE株系OE1、OE2 用上述水培法培養(yǎng)約35 d，用缺鐵營(yíng)養(yǎng)液（-Fe：0 μmol/L）脅迫處理7 d，各材料取3 株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，測(cè)定生物量。

1.2.6.2 葉綠素濃度和鐵濃度的測(cè)定 取正常處理和缺鐵處理7 d 的WT 和NtNRAMP3b-OE幼苗，利用無(wú)水乙醇提取法測(cè)定葉片中葉綠素濃度，利用鄰菲啰啉比色法測(cè)量各處理中不同材料的Fe 濃度。

1.2.6.3 相關(guān)基因瞬時(shí)表達(dá)的測(cè)定 鐵還原酶基因（ferric reduction oxidase，F(xiàn)RO）與鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron-regulated transporter，IRT）已證實(shí)參與亞鐵離子的吸收［28］，以NtL25為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR測(cè)定鐵脅迫處理后NtIRT1（AB263746.F：5′-TGGCTATTGACTCCATGGCT-3′；R：5′-AGTAGTTTCGCGCCATCAAC-3′）和NtFRO2（XM_016644133.F：5′-TATTGGGCTGCCACTCATCA-3′；R：5′-CCAGCATAAGAGACGCCAAC-3′）的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用DPS 7.5 進(jìn)行單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用LSD 法進(jìn)行多重比較，分析1%極顯著水平并使用字母標(biāo)記表示結(jié)果，利用Origin2018 和TBtools 作基因相對(duì)表達(dá)圖。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆及序列分析

克隆獲得NtNRAMP3b，全長(zhǎng)為1 530 bp，可編碼509 個(gè)氨基酸。編碼蛋白的分子式為C2621H4078N634O698S16，原子總數(shù)為8 047，相對(duì)分子質(zhì)量為56.15 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.77。帶負(fù)電荷的殘基的總數(shù)為42 個(gè)，帶正電荷的殘基有35 個(gè)，不穩(wěn)定性指數(shù)為32.06，屬于穩(wěn)定蛋白。

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析

NtNRAMP3b 的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α 螺旋占比51.47%，β- 轉(zhuǎn)角占比9.04%，無(wú)規(guī)卷曲占比19.84%，延伸鏈占比19.65%；含有24 個(gè)絲氨酸、10 個(gè)蘇氨酸和3 個(gè)酪氨酸，推測(cè)在這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化。NtNRAMP3b 具有11 個(gè)疏水的跨膜區(qū)域（圖1）。

圖1 NtNRAMP3b 跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Cross-membrane domain analysis of NtNRAMP3b

2.3 同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

NCBI 中查詢煙草、擬南芥與水稻的NRAMP 家族基因的蛋白質(zhì)序列，運(yùn)用DNAMAN 進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)。結(jié)果（圖2）表明，NtNRAMP3b 與NtNRAMP2 的同源性為67.28%，與AtNRAMP3 的同源性為74.85%，與水稻OsNRAMP6 的同源性為61.86%，推測(cè)NtNRAMP3b 與AtNRAMP3 具有相似的功能。

圖2 同源性分析Fig.2 Homology analysis

運(yùn)用MEGA6.0 制作鄰接樹(shù)，分析NtNRAMP3b與其余家族成員的親緣關(guān)系，并驗(yàn)證NtNRAMP3b的潛在功能。在線網(wǎng)站MEME 分析序列基序（motif，圖3），NtNRAMP3b 與擬南芥AtNRAMP3、AtNRAMP4 的親緣關(guān)系較近，同時(shí)，NtNRAMP3b 與擬南芥AtNRAMP3 含有相似的motif 類型，表明他們可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和motif 分析Fig.3 Phylogenetic tree and motif analysis

2.4 啟動(dòng)子分析

如圖4所示，啟動(dòng)子中除含有所必須的TATABOX 和CAAT-BOX 外，還含有植物激素響應(yīng)元件（如1 個(gè)赤霉素反應(yīng)元件（P-box），2 個(gè)脫落酸反應(yīng)性涉及的順式元件（ABRE）和1 個(gè)與水楊酸反應(yīng)順式作用元件（TCA-element））、組織特異性調(diào)控元件（如2 個(gè)與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件（CAT-box））和防御與脅迫響應(yīng)元件（如2 個(gè)低溫響應(yīng)順式元件（LTR）和5 個(gè)厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE））。其中，植物激素響應(yīng)元件（如ABRE）可以促進(jìn)或抑制植物激素（如脫落酸）誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出加速或減緩植株衰老過(guò)程；防御與脅迫響應(yīng)元件（如LTR）在脅迫（如低溫）下誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而表現(xiàn)出相關(guān)基因的瞬時(shí)表達(dá)增強(qiáng)。

圖4 啟動(dòng)子順式元件分析Fig.4 Promoter cis-element analysis

2.5 基因表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)NtNRAMP3b進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果（圖5）顯示，NtNRAMP3b在葉片中表達(dá)量極高，其中，老葉是根部的8.07 倍，幼葉是根部的2.28 倍。通過(guò)對(duì)煙草植株進(jìn)行缺鐵處理后發(fā)現(xiàn)，NtNRAMP3b在各部位的相對(duì)表達(dá)量增加，其中，老葉是正常處理的3.39 倍。因此，該基因主要在葉片中表達(dá)，尤其是老葉，且受Fe 誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 NtNRAMP3b 相對(duì)表達(dá)量Fig.5 NtNRAMP3b relative expression

2.6 缺鐵處理對(duì)NtNRAMP3b-OE煙草的影響

測(cè)定OE1 與OE2 植株NtNRAMP3b的瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果（圖6-A）顯示，OE1 中相對(duì)表達(dá)水平高。觀察煙株長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)量生物量。結(jié)果（圖6-B）顯示，正常處理下（CK）生長(zhǎng)的煙株生物量不存在差異。在缺鐵處理后，煙株的整體生物量降低，相較之下，NtNRAMP3b-OE較WT 長(zhǎng)勢(shì)較好，且OE1 的生物量顯著高于WT。葉綠素濃度結(jié)果（圖6-C）顯示，NtNRAMP3b-OE在缺鐵處理下葉綠素濃度極顯著的高于WT，表明NtNRAMP3b-OE煙株在缺鐵環(huán)境中促進(jìn)葉綠素合成，從而影響煙株光合作用，提高了煙株的生物量積累。

圖6 不同鐵濃度處理下的生物量Fig.6 Biomass under treatment with different cadmium concentrations

鐵濃度測(cè)定結(jié)果（圖6-D）顯示，正常處理下，NtNRAMP3b-OE植株鐵含量顯著高于WT，可能參與煙草對(duì)鐵的吸收。在缺鐵條件下，NtNRAMP3b-OE葉片中的鐵濃度低于WT，且OE1 與WT 間存在顯著差異，說(shuō)明缺鐵處理后，NtNRAMP3b-OE植株的Fe2+被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡外，從而提高葉綠素合成途徑相關(guān)酶活性和光敏素的合成，增加了葉綠素濃度和鐵的再利用，通過(guò)影響光合作用來(lái)影響煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，從而使煙株生物量和葉綠素濃度增加、鐵含量降低。

缺鐵條件下，OE 株系中的NtIRT1與NtFRO2的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于WT（圖7），說(shuō)明NtNRAMP3b-OE植株在缺鐵條件下通過(guò)增強(qiáng)NtIRT1與NtFRO2的表達(dá)，促進(jìn)煙株對(duì)鐵的吸收與利用。

圖7 缺鐵條件下基因的瞬時(shí)表達(dá)Fig.7 Transient expressions of genes under iron deficiency

3 討論

本研究克隆獲得NtNRAMP3b，全長(zhǎng)1 530 bp，編碼509 個(gè)氨基酸。其編碼蛋白等電點(diǎn)為5.77，含有51.47%的α 螺旋（alpha helix），不穩(wěn)定性指數(shù)為32.06，屬于穩(wěn)定蛋白，該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)與余沁等［29］研究結(jié)果一致。不同物種中的NRAMP 含有10-12 個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)［30］，且高度保守。NtNRAMP3b 具有11 個(gè)疏水的跨膜區(qū)域，符合NRAMP 家族的跨膜結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

Qin 等［31］研究表明NRAMP 可分為2 個(gè)亞家族，編碼蛋白分別定位于細(xì)胞膜和液泡膜，2 個(gè)亞家族成員的功能差異較大［32］，其中，AtNRAMP2、AtNRAMP3、AtNRAMP4和AtNRAMP5定位于液泡膜上［8］，主要參與液泡中金屬的釋放過(guò)程。NtNRAMP3b 的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，NtNRAMP3b 與At-NRAMP3 的親緣關(guān)系更近，Jia 等［23］研究表明NtNRAMP3 定位于液泡膜，屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。NtNRAMP3b在缺鐵條件下上調(diào)表達(dá)，在葉片中的瞬時(shí)表達(dá)極顯著高于正常處理。在缺鐵處理下對(duì)鐵濃度分析發(fā)現(xiàn)，NtNRAMP3b-OE葉片的鐵含量低于WT，證實(shí)該基因在煙草中主要負(fù)責(zé)葉片中鐵從液泡向外的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

Ihnatowicz 等［33］研究表明，NRAMP 家族在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)和光合作用等方面有調(diào)控作用［34］。啟動(dòng)子中的ABRE 可以促進(jìn)或抑制植物激素（如脫落酸）誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出加速或減緩植株衰老過(guò)程。低溫響應(yīng)順式元件（LTR）在低溫條件下誘導(dǎo)相關(guān)基因瞬時(shí)表達(dá)，從而改變植物的抗寒能力。低溫對(duì)類囊體產(chǎn)生氧化損傷［35-36］，從而降低了光系統(tǒng)II（PSII）的功能。因此，可以通過(guò)RT-qPCR 進(jìn)一步研究NtNRAMP3b在低溫下的表達(dá)情況，驗(yàn)證NtNRAMP3b在逆境下的調(diào)控機(jī)制。

NRAMP 家族對(duì)Fe、Cd 和Mn 的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收可以影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)在缺Mn 誘導(dǎo)PSII 光抑制，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），植物膜脂過(guò)氧化程度高；過(guò)量鎘進(jìn)入植物體內(nèi)后影響植株生長(zhǎng)發(fā)育，并通過(guò)食物鏈最終進(jìn)入人體，危害人體健康［37-38］；缺鐵（Fe）影響光系統(tǒng)I（PSI），導(dǎo)致葉綠素合成減少［39］。測(cè)定缺鐵環(huán)境下生長(zhǎng)的WT 和NtNRAMP3b-OE的鐵濃度和葉綠素濃度發(fā)現(xiàn)，NtNRAMP3b-OE植株的葉綠素濃度顯著高于WT，而Fe 含量低于WT，說(shuō)明NtNRAMP3b參與煙草葉片中Fe 的轉(zhuǎn)運(yùn)，該基因過(guò)表達(dá)后，大量Fe 轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡外，參與PSI，使葉綠素含量增加，降低了煙株中的鐵含量。后期可通過(guò)不同Cd、Mn 條件處理煙株，觀察不同處理下煙株表型與長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)定葉綠素含量、Cd 濃度及ROS 含量來(lái)驗(yàn)證NtNRAMP3b對(duì)光合作用的調(diào)控機(jī)理和對(duì)Cd、Mn 的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

在煙草中克隆了天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因NtNRAMP3b，NtNRAMP3b主要在葉片中表達(dá)且受鐵脅迫誘導(dǎo)并增強(qiáng)表達(dá)。初步驗(yàn)證了NtNRAMP3b主要參與鐵元素的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響葉片中鐵的吸收與再利用。