胡琪 侯玉翔 李璿 李梅蘭

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，晉中 030800）

普通白菜（Brassica rapassp.chinensisMakino）又稱青菜、油菜，屬十字花科蕓薹屬蕓薹種，含較多蛋白質(zhì)、維生素等成分，營養(yǎng)價值較高，在全國南北各地均廣泛栽培［1］。白菜是種子春化型蔬菜，春季容易先期抽薹，因此，研究植物的開花機(jī)制具有重要的實踐價值。

植物開花是由內(nèi)源激素和外部環(huán)境信號共同作用的結(jié)果，已知的五大類生長激素包括赤霉素、生長素、脫落酸、乙烯和細(xì)胞分裂素，均與春化作用和成花誘導(dǎo)有關(guān)［2］，其中生長素（IAA）屬于生長促進(jìn)劑，對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用［3］。植物體內(nèi)IAA 的合成非常復(fù)雜［4］，其生物合成途徑主要分為依賴色氨酸和非依賴色氨酸2 條途徑。根據(jù)合成的中間產(chǎn)物，依賴色氨酸途徑又分為4 條支路，吲哚乙醛肟途徑［5］、色胺途徑［6］、吲哚乙酰胺途徑［7］和吲哚丙酮酸途徑［8］。吲哚乙醛肟途徑是蕓薹屬植物中最重要的一條途徑［9］，又稱為CYP79B 途徑。CYP79B2 可以催化色氨酸轉(zhuǎn)化形成吲哚乙醛肟，而吲哚乙醛肟是IAA 和吲哚族硫苷的共同前體物［10-11］。Mikkelsen 等［12］發(fā)現(xiàn)經(jīng)1 μmol/L 2，4-D 處理的擬南芥CYP79B2被誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致吲哚硫苷積累量增加。楊子琴等［13］發(fā)現(xiàn)阻斷龍眼頂芽IAA 的運(yùn)輸可導(dǎo)致延遲開花，而IAA 濃度較低時可促進(jìn)開花。Hull 等［14］發(fā)現(xiàn)擬南芥CYP79B2可以將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-乙醛肟，且過表達(dá)CYP79B2擬南芥產(chǎn)生抵抗毒性的色氨酸類似物，表明CYP79B2可能與植物的防御機(jī)制和逆境脅迫有關(guān)。另有研究表明，CYP79B2在不同植物生長發(fā)育各階段的表達(dá)模式既有相似性又有特異性，在菘藍(lán)和大白菜中，經(jīng)茉莉酸甲酯脅迫，CYP79B2表達(dá)增強(qiáng)，但經(jīng)水楊酸脅迫后，其表達(dá)趨勢相反［15-16］。王夢雨［17］還發(fā)現(xiàn)BoaCYP79B2和BoaCYP79B3的表達(dá)量與芥子油苷的含量密切相關(guān)，表明CYP79B2在植物體內(nèi)具有抗癌防癌的作用。

CYP 酶是一類膜蛋白超家族酶系［18］。目前，在擬南芥、油菜、西蘭花等植物中已經(jīng)克隆到CYP79家族中的多個基因，如CYP79A、CYP79B、CYP79D和CYP79F等［19-22］。前期研究主要闡明了CYP79 在植物生長素合成及其對害蟲、病原菌的防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。除此之外，宋延宇等［23］發(fā)現(xiàn)調(diào)控薹菜CYP79B5的表達(dá)能改善蔬菜的風(fēng)味品質(zhì)。何薈如等［24］發(fā)現(xiàn)茶樹CYP79A1的表達(dá)量與品種和搖青程度有關(guān)。由此可見，CYP 酶幾乎是“萬能的生物催化劑”。但前人的研究多集中在生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，如硫苷［25］的合成，以及參與多種乙醛肟類化合物的反應(yīng)調(diào)控，如吲哚乙醛肟［26］的轉(zhuǎn)化。而有關(guān)CYP79B2在普通白菜開花調(diào)控中的研究卻鮮有報道。

本研究以普通白菜品系‘75#’為試驗材料，通過RT-PCR 方法克隆普通白菜中生長素CYP79B2同源基因，利用生物信息學(xué)方法對其序列及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，運(yùn)用RT-qPCR 方法分析該基因在不同組織和不同時期的表達(dá)情況，以期為后續(xù)普通白菜開花調(diào)控的基因功能驗證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為普通白菜品系‘75#’，在適宜環(huán)境下，種子露白后，4℃低溫處理20 d 即可完成春化，然后移栽至穴盤，并分別對移栽后0、10、15 和16 d 的植物組織莖尖進(jìn)行取樣，樣品分別標(biāo)記為V0、V10、V15 和V16。取樣量為0.1 g，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1BrcCYP79B2-2的克隆

1.2.1.1 總RNA 的提取和cDNA 的合成 將V10 樣品在液氮中迅速研磨成粉末，按照RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，DP432）試劑盒提取RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，RR037Q）試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.1.2 基因克隆和序列分析 使用大白菜數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org）查找CYP79B的同源序列，用Primer 5.0 在線軟件對基因設(shè)計引物（F：5′-ATGTATCTCCTCACAACGCTCCA-3′；R：5′-TTACTTCACCGTCGGATAAAGTTGC-3′）。以1.2.1.1 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，使用TaKaRa LA Taq?（TaKaRa：RR02MQ）試劑進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為Ta-KaRa LA Taq 0.5 μL、LA Taq Buffer II（10×）5 μL、正、反引物以及cDNA 模板各1 μL、無菌水33.5 μL。反應(yīng)程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，共35 個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小正確且無雜帶即可進(jìn)行回收。

將回收的DNA 產(chǎn)物與pUCm-T Vector（PCR Products Cloning Kit Sangon Biotech，B522213）在PCR儀中連接。后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α Competent Cells 中，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR 驗證，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN 軟件將測序序列翻譯成氨基酸，以NCBI 數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，進(jìn)行氨基酸序列多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用在線工具ProtParam 分析氨基酸的理化性質(zhì)，再分別使用SOPMA 和Swissmodel 在線軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效預(yù)測，了解蛋白質(zhì)的一些功能。

1.2.3 基因的表達(dá)分析 為更清楚地了解CYP79B同源基因的功能，對普通白菜‘75#’的根、莖、葉、花蕾和果莢進(jìn)行取樣，用RT-qPCR 方法研究其在不同組織中的表達(dá)情況。設(shè)計BrcCYP79B2-2的特異性引物序列（F：5′-TTAGGTACGGCGTTGACCAC-3′和R：5′-TCACCGACCATAACCAACGG-3′）。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆

以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條與目的條帶大小一致的條帶（圖1）。經(jīng)測序驗證后，基因長度為1 554 bp，命名普通白菜CYP79B的同源基因為BrcCYP79B2-2。提交序列至GenBank，登錄號為OM339440。

圖1 BrcCYP79B2-2 的擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Amplified electrophoresis of BrcCYP79B2-2

2.2 序列分析及多重比對

使用DNAMAN 軟件對BrcCYP79B2-2的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，BrcCYP79B2-2共編碼517 個氨基酸。多重序列比對結(jié)果（圖2）表明，BrcCYP79B2-2編碼氨基酸序列同大白菜（Brassica pekinensis）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitata）、蕪菁（Brassicarapa）、花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytis）、蘿卜（Raphanus sativus）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）具有較高同源性，同源性分別為99.42%、99.23%、98.84%、99.42%、98.84%、97.10%和93.44%。表明克隆基因確實為普通白菜BrcCYP79B2-2，且該基因在不同變種白菜中，序列高度保守。

圖2 不同物種CYP79B2-2 氨基酸序列的多重比對Fig.2 Multiple alignment of CYP79B2-2 amino acid sequences from different species

2.3 蛋白質(zhì)親緣關(guān)系分析

為進(jìn)一步了解BrcCYP79B2-2 在不同物種之間的親緣關(guān)系，使用DNAMAN 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，與大白菜（Brassica pekinensis）同源性最高，并且同花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytis）和甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitata）同屬于一個小分支，與蘿卜（Raphanus sativus）、白芥（Sinapis alba）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）親緣關(guān)系較近，與番木瓜（Carica papaya）、黃麻（Corchorus capsularis）、茶花（Camellia sinensis）等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 不同物種CYP79B2-2 同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CYP79B2-2 homologous proteins from different species

2.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測

BrcCYP79B2-2編碼517 個氨基酸，分子量為58.522 29 kD，其理論等電點為8.71，脂肪指數(shù)為88.47，親水性的平均值為-0.167；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為58，帶正電荷的殘基總數(shù)為64，不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為36.99，此蛋白質(zhì)分類相對穩(wěn)定。

使用SOPMA 和Swiss model 分別預(yù)測蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）顯示，BrcCYP79B2-2二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，主要二級結(jié)構(gòu)是α-螺旋（47%）和無規(guī)則卷曲（36.36%）；其三級結(jié)構(gòu)模型與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果吻合。

圖4 BrcCYP79B2-2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Protein tertiary structure prediction of BrcCYP-79B2-2

2.5 基因表達(dá)分析

為了解BrcCYP79B2-2在普通白菜不同組織與不同生育期中的表達(dá)模式，分別對根、莖、花蕾和果莢組織部位取材，使用RT-qPCR 方法對BrcCYP79B2-2的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果（圖5-A）顯示，BrcCYP79B2-2在不同的組織中均有表達(dá)，在植物莖中的表達(dá)量最低，在花中的表達(dá)量較低，而在根中的表達(dá)量最高。比較莖尖在不同發(fā)育期的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫處理后，BrcCYP79B2-2表達(dá)較低，在移栽10 d 后達(dá)到頂峰，此時為營養(yǎng)生長期，移栽15 和16 d 后，即花芽即將分化和分化開始時處于相對較低的表達(dá)水平，說明該基因?qū)Φ蜏靥幚碛许憫?yīng)，在營養(yǎng)生長時期莖尖的表達(dá)較高，但是在莖尖分化時下降（圖5-B）。

圖5 BrcCYP79B2-2 在不同組織的表達(dá)和低溫處理后不同時期莖尖部位的表達(dá)Fig.5 Expressions of BrcCYP79B2-2 in different tissues and in stem tip in different stages after low temperature treatment

3 討論

本試驗利用同源克隆技術(shù)成功克隆到普通白菜BrcCYP79B2-2，從蛋白質(zhì)親緣關(guān)系圖來看，普通白菜BrcCYP79B2同源基因所編碼的蛋白質(zhì)與大白菜、擬南芥和蘿卜等十字花科親緣關(guān)系較近，而與黃麻、茶花等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)一步說明BrcCYP家族基因具有高度保守性。

植物在適宜的外部環(huán)境中，生長到一定階段的時候，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理結(jié)構(gòu)均會發(fā)生改變，其中由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變過程最為典型［27-28］，這個過程即高等植物的開花過程。白菜在開花過程中，激素調(diào)節(jié)的作用不可忽視［29］。IAA 是五大激素之一，幾乎調(diào)控植物生長發(fā)育的所有方面，包括形態(tài)發(fā)生和對環(huán)境變化的響應(yīng)［30］。在擬南芥中CYP79B共鑒別出2 個基因：CYP79B2和CYP79B3，它們都能催化IAA 的合成，可能與植物開花有關(guān)。CYP79B2過表達(dá)是導(dǎo)致植物體內(nèi)IAA 升高的原因之一［31］。當(dāng)它們被敲除后，cyp79b2cyp79b3雙突變體則表現(xiàn)出葉片短小，體內(nèi)生長素水平下降的明顯特征［32］。本試驗通過RT-qPCR 研究在普通白菜不同器官中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BrcCYP79B2-2在根中的表達(dá)量最高，這與孫夏莉等［33］研究結(jié)果一致。BrcCYP79B2-2在不同組織和不同發(fā)育期的表達(dá)含量不同，同樣，原曉龍等［34］研究顯示蒜頭果實中CYP79的表達(dá)量在花謝后1月＞2月＞4月＞3月，也進(jìn)一步說明生長素在植物體內(nèi)的表達(dá)具有時空特異性。杜海等［35］在研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫處理后CYP79B2的表達(dá)量呈下降趨勢，本研究中，莖尖在低溫處理后表達(dá)降低，與前人在擬南芥中的研究結(jié)果相似。另外，莖尖在營養(yǎng)生長期BrcCYP79B2-2的表達(dá)量較高，在花芽即將分化和分化時降低，這可能表示植物體內(nèi)存在一種機(jī)制可以降解濃度過高的生長素，來完成花芽分化的過程。

4 結(jié)論

從普通白菜中成功克隆到CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-2，其編碼序列全長為1 554 bp，編碼517 個氨基酸，在白菜不同變種中高度保守。BrcCYP79B2-2具有組織特異性，且參與對低溫的響應(yīng)。BrcCYP79B2-2在莖尖不同發(fā)育階段的動態(tài)變化，說明其可能具有促進(jìn)花芽分化的功能。