陳鐸 劉永哲

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100020；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院感染和臨床微生物科，北京 100020）

自2019年12月新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）爆發(fā)以來，對(duì)全球的經(jīng)濟(jì)社會(huì)造成了重大的影響，根據(jù)美國(guó)霍普金斯大學(xué)的統(tǒng)計(jì)，截至目前已經(jīng)超過4.7 億人次感染新型冠狀病毒，超過600 萬人死于新冠肺炎感染［1-2］。面對(duì)日益增長(zhǎng)的新型冠狀病毒感染病例，高效的檢測(cè)手段和有效的抗體治療是應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒的重中之重。

SARS-CoV-2 是目前發(fā)現(xiàn)的基因組較大的正鏈RNA 病毒，基因組大小約為30 kb，其5′端的基因主要編碼冠狀病毒的16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白［3-5］。基因組3′端編碼冠狀病毒的4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括核蛋白（nucleocapsid，N）、表面刺突蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）和外膜蛋白（membrane，M）［6-8］。N 蛋白是冠狀病毒中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒內(nèi)部，具有較高的保守性。冠狀病毒N 蛋白包含了N 端結(jié)構(gòu)域和C 端結(jié)構(gòu)域，是一種具有較高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒內(nèi)部與病毒RNA結(jié)合形成螺旋衣殼，穩(wěn)定病毒的基因組［9-13］。因此，N 蛋白是重要的冠狀病毒檢測(cè)靶點(diǎn)，同時(shí)也是關(guān)鍵的抗體開發(fā)靶點(diǎn)蛋白。

雖然新型冠狀病毒的N 蛋白非常重要，但由于其蛋白中間存在柔性部分，全長(zhǎng)蛋白并不穩(wěn)定［14-15］。為了便于N 蛋白的結(jié)構(gòu)生物研究和后續(xù)的抗體開發(fā)，本研究分析了N 蛋白全長(zhǎng)的氨基酸序列，選取N 蛋白序列中的N 端結(jié)構(gòu)域，約12 kD 的核酸結(jié)合序列作為靶蛋白，構(gòu)建原核的表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)新型冠狀病毒N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域重組蛋白，N2+親和層析和分子篩凝膠層析探索N蛋白N 端結(jié)構(gòu)域的純化方式從而獲得較高純度的目的蛋白，通過Hampton 晶體試劑盒優(yōu)化得到質(zhì)量較高的N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)晶體，為后續(xù)N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和抗體制備提供關(guān)鍵研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET28b 原核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；N-N 蛋白（N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域（47N-175G））基因由北京睿博生物科技有限公司進(jìn)行優(yōu)化合成；大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）和質(zhì)粒擴(kuò)增菌株DH5α 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；卡那霉素、DTT 和IPTG誘導(dǎo)劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；酵母粉和蛋白胨購自O(shè)XOID 公司；鹽酸、氯化鈉和咪唑購自北京化工廠；HEPES 和六水氯化鎂購自Amresco公司；DNA 膠回收試劑盒和小提質(zhì)粒試劑盒購自杭州博日科技有限公司；SDS-PAGE 預(yù)制膠和Ni-NTA beads 購自南京金斯瑞生物科技有限公司；T4 連接酶和PCR mix 酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher 公司；晶體篩選試劑盒購自Hampton 公司；16 孔晶體板購自天宇有機(jī)玻璃制品高分子有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250 和G250 購自北京溪洋匯智科技有限公司；10 kD 超濾濃縮管（15 mL 和5 mL）購自Merck Millipore 公司；Superdex 75 10/30 GL 購自GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 N-N 蛋白的序列合成和表達(dá)載體構(gòu)建 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫查詢新型冠狀病毒N 蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列（GenBank：MN908947.3），本實(shí)驗(yàn)使用CLUSTALW 網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比，選取N-N 蛋白（47N-175G）129 個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的基因序列為目的序列，經(jīng)北京睿博生物科技有限公司進(jìn)行原核系統(tǒng)密碼子優(yōu)化并人工合成，N-N 蛋白的基因序列連入通用載體Topo。我們以Topo-N-N 為模板，N-N-F和N-N-R 為引物（表1），擴(kuò)增新型冠狀病毒N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域基因序列。擴(kuò)增目的基因片段通過DNA膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收，之后和質(zhì)粒pET28b分別通過雙酶切（NdeI 和XhoI）、T4 連接酶進(jìn)行片段載體連接和轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α 感受態(tài)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，培養(yǎng)皿挑選陽性單克隆并通過小提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，雙酶切和測(cè)序鑒定正確的重組目的質(zhì)粒命名為pET28b-N-N。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 N-N 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的pET28b-N-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。通過卡那霉素抗性平板篩選陽性的表達(dá)菌株，轉(zhuǎn)移至包含5 mL LB 培養(yǎng)基的小試管中并添加50 μg/mL 卡那霉素進(jìn)行37℃ 220 r/min 過夜搖晃培養(yǎng)。第2 天將菌株轉(zhuǎn)入包含1 L LB 培養(yǎng)基的大瓶中并添加50 μg/mL 卡那霉素進(jìn)行220 r/min 搖晃培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.8 時(shí)，降低培養(yǎng)溫度至16℃，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG 進(jìn)行過夜誘導(dǎo)，之后將菌液進(jìn)行4 000 r/min 離心收集大腸桿菌，然后用lysis buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2）重懸并進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎，12 000 r/min 離心后收集上清液進(jìn)行后續(xù)的純化。

1.2.3 N-N 蛋白表達(dá)和純化 大量誘導(dǎo)表達(dá)N-N 蛋白，誘導(dǎo)結(jié)束后離心、收集大腸桿菌，重懸高壓均質(zhì)破碎，高速離心獲得含有大量目的蛋白的上清液，然后進(jìn)行Ni2+親和層析純化，上樣流速為1 mL/min，上樣后用wash buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 咪唑）進(jìn)行洗雜至G250 檢測(cè)不變藍(lán)，最后用Elution buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，200 mmol/L 咪唑）洗脫目的蛋白并收集流出液。我們將流出液經(jīng)過超濾濃縮管（截留蛋白分子量：10 kD）濃縮至1 mL，以1 mL/min 的流速上樣，進(jìn)行分子篩凝膠色譜層析（Superdex 75），收集最要的蛋白質(zhì)峰，即為新型冠狀病毒N-N 蛋白。通過SDS-PAGE 電泳對(duì)其進(jìn)行純度檢測(cè)。

1.2.4 N-N 蛋白與RNA 相互作用的EMSA 分析 通過EMSA 試驗(yàn)驗(yàn)證N-N 蛋白與核酸的相互作用。采用體積分?jǐn)?shù)為10%的Native 蛋白膠，合成序列為UCUUAGGAGAAUGAC 的RNA，按N-N 蛋白和RNA 摩爾比為1∶1.2 的比例預(yù)混蛋白和核酸，加上等比例的甘油，冰上孵育2 h 后上樣，冰浴電泳（7 mA，120 min）。結(jié)束后將蛋白膠放置到含有核酸染料的染液中染色10 min，在照膠儀上觀察條帶。

1.2.5 N-N 蛋白晶體優(yōu)化 將分子篩純化的N-N 蛋白峰進(jìn)行合并，經(jīng)過超濾濃縮管（截留蛋白分子量：10 kD）濃縮至7 mg/mL 左右進(jìn)行懸滴晶體生長(zhǎng)條件篩選。晶體生長(zhǎng)溫度為16℃，試劑條件包括Hampton 公司的index1-96、PEGRx 1、PEGRx 2、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等試劑盒。最終在PEG/Ion Screen的23 號(hào)條件（0.2 mol/L Ammonium formate，20%W/V Polyethlene glycol 3350）初篩獲得N-N 蛋白質(zhì)晶體，以此條件為基礎(chǔ)，進(jìn)行晶體生長(zhǎng)條件優(yōu)化。優(yōu)化手段包括以PEG/Ion Screen 的23 號(hào)條件為基礎(chǔ)，按4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，獲得較大晶體后再進(jìn)行Additive Screen 和Detergent Screen 最終優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 N-N蛋白的序列選取

使用CLUSTALW 網(wǎng)站對(duì)SARS-CoV-2（QHD 43423.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和MERS-CoV（YP_009047211.1）進(jìn)行N 蛋白氨基酸序列對(duì)比，可以看出在N 蛋白的N 端結(jié)構(gòu)域3 種病毒的差異較大，特別是MERS-CoV 與其他兩種病毒的差異更大（圖1），因此本研究選取了新型冠狀病毒N-N 蛋白（47N-175G）129 個(gè)氨基酸序列作為目的蛋白序列，并在NCBI 查找對(duì)應(yīng)的基因序列，通過生物公司進(jìn)行基因合成構(gòu)建原核表達(dá)重組載體，通過原核表達(dá)純化獲得性質(zhì)較好特異性較高的N-N 蛋白。

圖1 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERS-CoV 的N 蛋白氨基酸序列對(duì)比Fig.1 Comparison of N protein amino acid sequences of SARS-CoV-2，SARS-CoV and MERS-CoV

2.2 N-N蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

以Topo-N-N 為模板，生物公司合成N-N-F 和N-N-R 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小約350 bp 的目的基因片段，與預(yù)期的大小相符（圖2），通過NdeI 和XhoI雙酶切目的片段和載體，T4 連接酶22℃連接2 h 轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)中，通過帶卡那霉素抗性的板子篩選獲得陽性克隆，再通過雙酶切鑒定和基因測(cè)序鑒定，獲得pET28b-N-N 重組原核表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 N-N 蛋白基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification result of N-N protein

2.3 N-N蛋白的純化

將pET28b-N-N 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，按照1.2.2 中的方法培養(yǎng)誘導(dǎo)N-N 蛋白的大量表達(dá)，采用Ni2+親和層析柱和分子篩凝膠色75 譜層析柱純化N-N 蛋白。N-N 蛋白在Superdex 75 分子篩中的出峰位置為16.5 mL，符合Superdex 75 分子篩的出峰情況，其峰尖280 nm 的吸收值約為260 nm 的2 倍為正常的蛋白質(zhì)比值（圖3-A），通過12% SDS-PAGE 蛋白質(zhì)膠分析N-N 的純化情況，經(jīng)過Ni2+親和層析柱和分子篩凝膠色譜層析柱的純化，通過Quantity One 軟件對(duì)蛋白膠進(jìn)行積分定量分析，N-N 蛋白的純度達(dá)到90%以上（圖3-B）。

圖3 N-N 蛋白的表達(dá)純化Fig.3 Expression and purification of N-N protein

2.4 EMSA試驗(yàn)驗(yàn)證N-N蛋白與RNA相互作用

通過EMSA 試驗(yàn)證明了N-N 蛋白與RNA 確實(shí)具有較強(qiáng)的相互作用（圖4），隨著N-N 蛋白濃度的提高，可以形成穩(wěn)定分N-N 蛋白-RNA 復(fù)合物。進(jìn)一步明確N-N 蛋白結(jié)合RNA 的能力，從側(cè)面驗(yàn)證N蛋白N 端結(jié)構(gòu)域結(jié)合病毒基因組，穩(wěn)定病毒基因組的功能。但是EMSA 無法準(zhǔn)確定量N-N 蛋白與RNA的結(jié)合比例以及N-N 蛋白與RNA 結(jié)合的具體方式，這些將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過完整的N-N 蛋白-RNA 復(fù)合物結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 N-N 蛋白與RNA 結(jié)合的EMSA 結(jié)果Fig.4 EMSA result of binding of N-N protein and RNA

2.5 N-N蛋白的晶體篩選

將分子篩純化的N-N 蛋白濃縮至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 還原劑后進(jìn)行晶體生長(zhǎng)篩選。在PEG/Ion Screen 的23 號(hào)（0.2 mol/L Ammonium formate，20% Polyethlene glycol 3350 W/V）池液生長(zhǎng)條件獲得初篩N-N 蛋白晶體（圖5-A）。以PEG/Ion Screen 的23 號(hào)條件為基礎(chǔ)，按照4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，在添加Crystal Screen 的45 號(hào)（0.2 mol/L Zinc acetate dihvdrate，0.1 mol/L Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5，18% Polyethlene glycol 8000 W/V）獲得較大的晶體（圖5-B）。之后再進(jìn)行Additive Screen 和Detergent Screen 優(yōu)化，最終在添加Additive Screen 25 號(hào)（1.0 mol/L Sodium malonate pH 7.0）下獲得質(zhì)量較高的N-N 蛋白晶體（圖5-C）。

圖5 N 蛋白的晶體優(yōu)化Fig.5 Optimization of N protein crystal

3 討論

冠狀病毒包含4 種結(jié)構(gòu)蛋白，N 蛋白是冠狀病毒最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一［16］，負(fù)責(zé)穩(wěn)定病毒的基因組，協(xié)助病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程。此外，N 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性［17］，可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答［18］。N 蛋白的抗體較S 蛋白的抗體更早出現(xiàn)［19］，而且檢測(cè)率更高，維持時(shí)間更長(zhǎng)，說明對(duì)于N 蛋白抗體檢測(cè)試劑盒的開發(fā)比S 蛋白更加有優(yōu)勢(shì)［20-21］。由于N 蛋白全長(zhǎng)序列中間存在柔性較大的部分，直接表達(dá)存在一定的困難［22］，為了獲得大量穩(wěn)定的N蛋白，本研究通過構(gòu)建N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了大量的可溶N-N 蛋白，為后續(xù)抗體檢測(cè)試劑盒開發(fā)［23］和抗體藥物［24］開發(fā)提供重要的研究基礎(chǔ)。

本研究參考Chatzileontiadou 等［25］的蛋白純化方法，在獲得大量的可溶N-N 蛋白基礎(chǔ)上，通過Hampton 晶體試劑盒進(jìn)行晶體篩選。但與既往的研究不同，根據(jù)初篩條件還需要進(jìn)一步摸索條件，如上述結(jié)果中所述，既往大部分研究將分子篩純化的N-N 蛋白濃縮至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 還原劑，本研究為進(jìn)行多輪晶體優(yōu)化，最終獲得質(zhì)量較高的N-N 蛋白晶體，故以PEG/Ion Screen的23 號(hào)條件為基礎(chǔ)，按照4∶1 的體積比分別加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶體篩選試劑，在添加Crystal Screen 的45 號(hào)獲得較大的晶體，從而通過X 射線衍射試驗(yàn)，獲得較好的衍射圖像。此步驟獲得的蛋白晶體，為N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)的解析提供直接的研究基礎(chǔ)。為后續(xù)的N 蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，以及N 蛋白穩(wěn)定核酸機(jī)制的解釋提供了重要高純度蛋白。

本研究還通過EMSA 試驗(yàn)定性驗(yàn)證了N-N 蛋白與RNA 具有明確的相互作用。隨著N-N 蛋白濃度的提高，可以形成穩(wěn)定分N-N 蛋白-RNA 復(fù)合物，該結(jié)果也被其他類似研究證實(shí)［26-29］。從側(cè)面證實(shí)了N蛋白N 端結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定病毒基因組中的作用，為后續(xù)的N 蛋白功能研究提供思路和依據(jù)。

N 蛋白主要兩大作用，一是結(jié)合在病毒的RNA，穩(wěn)定病毒的基因組，二是可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄復(fù)制形成N 蛋白的RNAP 復(fù)合物，促進(jìn)基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制［30］。N 蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白，目前開發(fā)的抗體試劑盒也是針對(duì)N 蛋白或者S 蛋白［26-27］。本研究通過N-N蛋白的表達(dá)純化，主要是優(yōu)化了后續(xù)的晶體生長(zhǎng)條件，獲得質(zhì)量較高的N-N 蛋白晶體，后續(xù)將以此為基礎(chǔ)解析N-N 蛋白晶體結(jié)構(gòu)，為N 蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供重要研究基礎(chǔ)。同時(shí)，N 蛋白具有較好的機(jī)體免疫原性，本研究提供了N 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)純化的方法，將為后續(xù)的抗體檢測(cè)試劑盒開發(fā)，以及靶點(diǎn)N 蛋白的抗體藥物研究提供關(guān)鍵的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究提供了新型冠狀病毒N-N 蛋白表達(dá)純化的新方法，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效的表達(dá)大量可溶N-N 蛋白。通過Ni2+親和層析和分子篩凝膠色譜層析可以獲得純度超過90%的N-N 蛋白。通過晶體篩選最終獲得質(zhì)量較高的N-N 蛋白晶體，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供重要理論基礎(chǔ)。