馬芳芳 康碧靜 馬春英 劉振斌 楊迪 喬自林 王明明 馬忠仁 王家敏

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）是由流感病毒感染引起的病毒性傳染性呼吸道疾病。流感病毒屬于正黏病毒科，單股負(fù)鏈RNA 病毒，分為甲（A）、乙（B）、丙（C）、?。―）4 型，其中甲型流感病毒和乙型流感病毒主要引起人流感（圖1）。甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染宿主范圍廣，是導(dǎo)致季節(jié)性流感傳播的主要病原體［1］，給社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。乙型流感病毒（influenza B virus，IBV）僅僅在人與人之間傳播，常引起局限性流行。由于流感病毒RNA 聚合酶校正功能缺失，變異快，曾造成4 次世界范圍內(nèi)的大流行，分別為西班牙H1N1 流感、亞洲 H2N2 流感、中國(guó)香港H3N2 流感及2009年在全球暴發(fā)的H1N1 流感［2］。隨著病毒不斷變異，H5N1、H9N2、H7N9 和H10N8 亞型的人畜共患流感病毒被確定為將來(lái)潛在的流行毒株［3］，勢(shì)必對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重威脅，同時(shí)對(duì)公共衛(wèi)生及經(jīng)濟(jì)帶來(lái)打擊。

圖1 流感病毒Fig.1 Influenza virus

接種流感疫苗是預(yù)防流感最常用和最有效的手段。尤其自新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）暴發(fā)以來(lái)，因其癥狀與流感類似，且具有高致病性和傳染性，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成了巨大威脅，疫苗作為預(yù)防傳染性疾病最有效的策略之一再度成為研究熱點(diǎn)。值得注意的是，目前獲得批準(zhǔn)使用的流感疫苗主要是雞胚基質(zhì)流感疫苗，但是考慮到雞胚的局限性，科研人員逐漸關(guān)注哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗技術(shù)，而其中Vero（Vero simian Kidney epithelial）細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織和我國(guó)生物制品規(guī)程認(rèn)可的僅用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系。現(xiàn)就流感疫苗研究進(jìn)展及關(guān)于Vero 細(xì)胞基質(zhì)制備流感疫苗研究作一概述，為細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗的研發(fā)提供參考。

1 流感疫苗的研究現(xiàn)狀

目前，我們熟知的流感疫苗有雞胚基質(zhì)流感疫苗、細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗和重組流感疫苗。圖2展示了流感疫苗發(fā)展的歷史進(jìn)程［4］。

圖2 流感疫苗發(fā)展的歷史Fig.2 History of influenza vaccine development

雞胚苗的生產(chǎn)工藝已達(dá)70 余年，主要包括滅活疫苗（通常稱“流感疫苗”）和減毒（弱化）活疫苗（通常稱“鼻噴霧流感疫苗”）。基于雞胚基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)仍在廣泛應(yīng)用，表1總結(jié)了美國(guó)2020-2021 季節(jié)以雞胚為基質(zhì)流感疫苗產(chǎn)品，主要為四價(jià)流感疫苗［5］。盡管以雞胚為基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗是最成熟的方法，但雞胚苗存在以下缺陷［6］：第一，依賴于SPF 級(jí)雞胚，清潔程度高，生產(chǎn)過(guò)程繁瑣。首先，生產(chǎn)一劑人用流感疫苗需要1-2 個(gè)雞胚，每只雞胚可收獲尿囊液約10 mL，因此需要大量雞胚；此外，9-10日齡雞胚才可用于病毒接種，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。第二，不適于某些病增殖，如H3N2 株，高致病性禽流感株H5N1，導(dǎo)致病毒滴度低。第三，不可控因素較多，如下游加工過(guò)程存在無(wú)菌風(fēng)險(xiǎn)。第四，雞胚蛋白的殘留，導(dǎo)致潛在的過(guò)敏反應(yīng)。第五，若恰逢禽流感暴發(fā)，將面臨一時(shí)間內(nèi)雞胚嚴(yán)重供應(yīng)不足等問(wèn)題，將嚴(yán)重阻滯流感疫苗生產(chǎn)。

表1 2020-2021年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的季節(jié)性雞胚基質(zhì)流感疫苗Table 1 2020-2021 US FDA approved seasonal chicken embryo-based influenza vaccine

為克服雞胚生產(chǎn)的限制，細(xì)胞培養(yǎng)作為一種相對(duì)較新的技術(shù)相繼發(fā)展。1995年以來(lái)，美國(guó)FDA和WHO 積極推進(jìn)使用細(xì)胞苗替代雞胚苗［7］。最初，該生產(chǎn)工藝使用的候選疫苗病毒是雞胚衍生的，直到2016年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn) Seqirus（美國(guó)唯一一家獲得FDA 批準(zhǔn)的基于細(xì)胞的流感疫苗制造商）開(kāi)始使用細(xì)胞培養(yǎng)的候選疫苗病毒［8］。Flucelvax Quadrivalent是唯一獲得FDA 許可在美國(guó)使用的細(xì)胞基質(zhì)滅活流感疫苗，主要適用于6 個(gè)月及以上人群［9］。與雞胚苗相比，細(xì)胞苗具有以下優(yōu)點(diǎn)［10-11］，（1）細(xì)胞便于儲(chǔ)存，并且細(xì)胞培養(yǎng)避免了對(duì)雞胚等原材料的依賴；（2）易于規(guī)模化生產(chǎn)；（3）在標(biāo)準(zhǔn)化制造過(guò)程中加強(qiáng)控制，細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)基和原材料的無(wú)菌性降低了最終產(chǎn)品微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)；（4）避免對(duì)雞胚蛋白過(guò)敏；（5）疫苗病毒株在細(xì)胞中傳代突變幾率低，細(xì)胞衍生的疫苗株抗原性更接近自然流行株；（6）從生產(chǎn)的角度來(lái)看，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗的方法更快、更廉價(jià)、更高效，有助于人類預(yù)防包括禽流感在內(nèi)的流感的大規(guī)模暴發(fā)。同時(shí)環(huán)境友好，降低廢棄物排放，減輕制造商負(fù)擔(dān)，特別是在大流行等緊急情況下，應(yīng)用細(xì)胞基質(zhì)代替雞胚基質(zhì)可有效緩解衛(wèi)生壓力。綜上所述，細(xì)胞苗已成為流感疫苗研制的重要方向。

在培養(yǎng)流感病毒的細(xì)胞生產(chǎn)開(kāi)發(fā)中，貼壁依賴性生長(zhǎng)的MDCK 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞和PER.C6 三個(gè)細(xì)胞系是目前最普遍的選擇［12］（表2）。MDCK 細(xì)胞是培養(yǎng)和分離流感病毒最佳的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但其存在潛在成瘤性，使得其應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)顧慮重重；PER.C6 是流感病毒的敏感適應(yīng)細(xì)胞系，但它屬于荷蘭抗體和疫苗公司專利所有。Vero 細(xì)胞是貼壁性連續(xù)傳代細(xì)胞系，由日本千葉大學(xué)的Y.Yasumura 和Y.Kawakita 從正常成年非洲綠猴的腎臟分離培養(yǎng)［13］，與其他細(xì)胞基質(zhì)相比，其安全性是Vero 細(xì)胞用于流感疫苗生產(chǎn)的最大優(yōu)勢(shì)。但與MDCK 細(xì)胞相比，Vero 細(xì)胞表面唾液酸受體相對(duì)較少，對(duì)大多數(shù)流感病毒的敏感性較低［14］，故選育流感病毒Vero 細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，成為Vero 細(xì)胞流感疫苗研發(fā)首當(dāng)其沖的首要任務(wù)。另外，建立高效的流感病毒擴(kuò)增系統(tǒng)是基于Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)的第一步，最初細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究主要采用含血清培養(yǎng)系統(tǒng)［15］。近年來(lái)，由于動(dòng)物源性血清具有潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)和不斷提升的質(zhì)量監(jiān)管要求以及微載體費(fèi)用高等成本問(wèn)題，采用無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)成為流感病毒擴(kuò)增工藝的主要趨勢(shì)［16］。基于MDCK 和Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒不同工藝研究比較（表3）。

表2 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗Table 2 Cell-based influenza vaccine

表3 MDCK 和Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒不同工藝研究比較Table 3 Comparison of different techniques of MDCK and Vero cell culture for influenza virus

2 Vero 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗研究進(jìn)展

自 20世紀(jì) 80年代以來(lái)，Vero 細(xì)胞被廣泛用于脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、乙型腦炎以及新型冠狀肺炎等十多種人用病毒性疫苗的生產(chǎn)且被安全使用［17］。鑒于Vero 細(xì)胞是人用病毒性疫苗生產(chǎn)的良好細(xì)胞基質(zhì)，近年來(lái)，基于 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗研究越來(lái)越多。圖3展示了Vero 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗工藝流程，可以看到培養(yǎng)大量細(xì)胞是疫苗制備的基礎(chǔ)，而獲得Vero 細(xì)胞適應(yīng)性且高產(chǎn)的流感病毒株是制備Vero 細(xì)胞流感疫苗的關(guān)鍵。

圖3 Vero 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗工藝流程Fig.3 Technological process of Vero cell-based influenza vaccine

2.1 Vero細(xì)胞高產(chǎn)疫苗株

據(jù)報(bào)道，在2003年Hiroichi Ozaki 等［18］通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)建立了Vero 細(xì)胞高產(chǎn)甲型流感病毒毒株。他們通過(guò)將適應(yīng)Vero 細(xì)胞的重組流感病毒株NS基因替換PR8 NS基因，獲得一種改良的A/Puerto Rico/8/34（PR8）流感病毒毒株，改善了在Vero 上病毒拯救和生長(zhǎng)特性。與在標(biāo)準(zhǔn)PR8 毒株上挽救相同組合的病毒相比，在新毒株上挽救的H1N1、H3N2、H6N1 和H9N2 血凝素和神經(jīng)氨酸酶組合的病毒動(dòng)力學(xué)顯著增強(qiáng)。Legastelois 等［19］通過(guò)反向遺傳學(xué)產(chǎn)生了流感重組RG5，在雞胚和Vero 細(xì)胞上進(jìn)行病毒種子擴(kuò)增，該病毒種子可作為預(yù)防新高致病性禽流感毒株在人類傳播的疫苗毒株“文庫(kù)”。Shen等［20］通過(guò)基因重配法將Vero 細(xì)胞適應(yīng)性流感病毒株A/Yunnan/1/2005/Va（H3N2） 和A/Anhui/1/2005（H5N1）共感染后，用抗 A/Yunnan/1/2005Va（H3N2）毒株的山羊抗體篩選重配體，獲得Vero 細(xì)胞適應(yīng)型H5N1 流感病毒株，且重組前后單價(jià)活疫苗血清抗體滴度無(wú)顯著差異。Hu 等［21］通過(guò)連續(xù)傳代法使流感病毒株A/Puerto Rico/8/1934 適應(yīng)Vero 細(xì)胞，20 代后獲得高增長(zhǎng)毒株，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該流感病毒適應(yīng)株在NP、PB1、PA 和NS1 處均發(fā)生突變。綜上所述，通過(guò)篩選或重配等方法可獲得已適應(yīng)Vero細(xì)胞的流感高產(chǎn)毒株，實(shí)現(xiàn)以Vero 細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗指日可待。

2.2 懸浮培養(yǎng)型Vero細(xì)胞

為實(shí)現(xiàn)Vero 細(xì)胞高密度大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，研究者通過(guò)將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)二者工藝優(yōu)勢(shì)巧妙結(jié)合，建立了Vero 細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)工藝。但微載體懸浮培養(yǎng)工藝也有缺陷，如微載體價(jià)格昂貴、工藝繁瑣、細(xì)胞消化不完全、無(wú)法細(xì)胞計(jì)數(shù)等［22］。與之相比，全懸浮培養(yǎng)工藝恰好能夠彌補(bǔ)其不足之處，開(kāi)發(fā)無(wú)血清全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝對(duì)流感疫苗的生產(chǎn)具有重要意義。1992年，Litwin［23］首次報(bào)道Vero 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中以細(xì)胞聚團(tuán)樣懸浮生長(zhǎng)，而非單個(gè)細(xì)胞樣懸浮生長(zhǎng)。在此之后，未見(jiàn)Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相關(guān)報(bào)道，直到2009年，Paillet 等［24］通過(guò)逐步增加無(wú)血清培養(yǎng)基的比例，經(jīng)120 d 左右的馴化，終于使Vero E6 細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，并且比較了水泡口炎病毒、單純皰疹病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒在貼壁型Vero 細(xì)胞和懸浮型Vero 細(xì)胞上的增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)Vero 細(xì)胞上水泡口炎病毒的產(chǎn)率最高。單純皰疹病毒，感染后47 h 病毒滴度可達(dá)3.2×108TCID50/mL，與貼壁培養(yǎng)型Vero 細(xì)胞相似。盡管該研究發(fā)現(xiàn)Vero 細(xì)胞成功適應(yīng)單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，并且開(kāi)發(fā)了生物反應(yīng)器工藝，但是該系統(tǒng)并未進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。10年之后，Rourou［25］和Shen［26］兩個(gè)科研團(tuán)隊(duì)描述了Vero 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的適應(yīng)性。Rourou 等研究發(fā)現(xiàn)Vero 細(xì)胞最初在IPT-AFM 中以單個(gè)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，平均細(xì)胞密度達(dá)（2.1±0.4）×106個(gè)/mL，分傳第二代時(shí)出現(xiàn)中小不同程度的細(xì)胞聚團(tuán)。Shen和團(tuán)隊(duì)成功馴化貼壁型Vero 細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清和動(dòng)物源性成分IHM03 培養(yǎng)基并懸浮生長(zhǎng)，但也觀察到一些聚集物，其倍增時(shí)間在40 h 和44 h 之間。Lee等［27］運(yùn)用逐步適應(yīng)法獲得了能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基OptiPRO 中懸浮培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞，并且腺病毒產(chǎn)量比貼壁培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞高1.5 倍。此外，劉鵬等［28］使用自配的Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基初步建立了Vero細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)，并在懸浮Vero 細(xì)胞培養(yǎng)重組流感病毒H5N1 和H7N9 上獲得了較高的血凝素產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)大流行流感病毒株疫苗做鋪墊。這些結(jié)果顯示，懸浮培養(yǎng)型Vero 細(xì)胞系用于疫苗生產(chǎn)具有巨大潛力，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)探索。

綜上所述，雖然已有成功懸浮培養(yǎng)的報(bào)道，但與流感病毒在懸浮培養(yǎng)型Vero 細(xì)胞上增殖的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鮮有，因此還需要研究來(lái)彌補(bǔ)懸浮培養(yǎng)型Vero 細(xì)胞的不足。根據(jù)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道懸浮培養(yǎng)型動(dòng)物細(xì)胞系的成功建立，例如懸浮培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞系［29］、CHO 細(xì)胞系［30］、HEK293 細(xì)胞系［31］等，發(fā)現(xiàn)以上細(xì)胞系已有成熟的商品化培養(yǎng)基，而市面上Vero 細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)基甚少。因此，盡管已有現(xiàn)有技術(shù)的支撐，但Vero 細(xì)胞的懸浮馴化及應(yīng)用仍然極具挑戰(zhàn)。

3 總結(jié)與展望

由于流感病毒極易變異，其有效防控依然是人類和畜禽養(yǎng)殖業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的雞胚苗已無(wú)法滿足巨大的市場(chǎng)需求，故需進(jìn)一步優(yōu)化流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)，細(xì)胞苗的研發(fā)是科研人員和醫(yī)療人員需要攻克的難題。另外，從動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)、無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)等是當(dāng)前世界各大生物公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)疫苗等生物制品的首要選擇和發(fā)展方向。

在過(guò)去30年里，Vero 細(xì)胞系已被廣泛研究，并獲得了WHO 的認(rèn)可，用于人類疫苗生產(chǎn)。近年來(lái)，Vero 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗研發(fā)取得了較大進(jìn)展，基于Vero 細(xì)胞系生產(chǎn)大流行性和季節(jié)性流感疫苗的研究，顯示其具有良好的耐受性和免疫原性［32］。然而相對(duì)于成熟的MDCK 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)工藝，Vero細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗在全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和高產(chǎn)疫苗毒株等配套體系建設(shè)、病毒滴度的提高、高效生產(chǎn)工藝研發(fā)與優(yōu)化、Vero 細(xì)胞專用懸浮培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)等研究方面尚面臨較多需要解決的問(wèn)題，因此，Vero細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗研究工藝還需進(jìn)一步深入研究。

除了加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗的研發(fā)之外，還需探索新的流感疫苗研究技術(shù)，例如當(dāng)前COVID-19大流行中強(qiáng)調(diào)的mRNA 疫苗，以解決流感疫苗生產(chǎn)能力的潛在不足。需值得注意的是，A（H1N1）pdm09 大流行期間一劑疫苗足以提供足夠的免疫保護(hù)，但對(duì)于其他流感亞型（例如H5N1）可能需要兩劑大流行疫苗才能引發(fā)足夠的免疫反應(yīng)，而目前70%人口不足以滿足兩劑的接種目標(biāo)［33］。另外，由于流感病毒的進(jìn)化是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及突變和重組以及多個(gè)宿主，因此，難以預(yù)測(cè)下一次流 感大流行何時(shí)發(fā)生以及確切的毒株是什么。鑒于面臨的以上困難，將來(lái)對(duì)通用型流感疫苗的研發(fā)也是及其有必要的。