季潔韻 李強(qiáng) 曾幼玲

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830017；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091）

遺傳信息與外部環(huán)境共同影響生物體的生長(zhǎng)，而植物作為一種固著生物受到外界環(huán)境的影響較大，已進(jìn)化出系列機(jī)制應(yīng)對(duì)非生物脅迫［1］，包括脅迫傳感、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄加工及翻譯后的蛋白修飾。這些反應(yīng)會(huì)通過(guò)減少植物活性氧（ROS）水平、提高細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性等過(guò)程增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性［2］。

microRNA 是一種20-24 nt 的非編碼RNA。一般情況下，植物miRNA 通過(guò)剪切信使RNA（messenger RNA，mRNA）或者抑制翻譯負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。隨著測(cè)序技術(shù)與分子手段的發(fā)展，在多種植物中已鑒定了大量miRNA 并明確了其靶基因的作用。植物中很多miRNA 靶基因編碼的蛋白是與啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子［3］。miRNA/轉(zhuǎn)錄因子模塊在植物多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用。miR156/SPL 模塊是調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子。SPL，SQUAMOSA 啟動(dòng)子結(jié)合類蛋白，與花發(fā)育基因的啟動(dòng)子特異結(jié)合，影響植物的頂芽、花序發(fā)育以及開(kāi)花時(shí)間。幼苗期miR156 轉(zhuǎn)錄水平較高，導(dǎo)致SPL表達(dá)較低，隨著植物的生長(zhǎng)，miR156轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，使得SPL 轉(zhuǎn)錄因子積累，這樣SPL 又會(huì)促進(jìn)其下游miR172 的轉(zhuǎn)錄，從而抑制miR172 靶向的APETALA2（AP2）類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使植物從幼苗轉(zhuǎn)為成苗［4-6］。蘋(píng)果miR156/SPL模塊通過(guò)激活WRKY100的表達(dá)調(diào)控植物的耐鹽性［7］；miR171 及其靶向的轉(zhuǎn)錄因子SCARECROWLIKE（SCL）通過(guò)整合抗壞血酸途徑增強(qiáng)蘋(píng)果的耐旱性［8］。

1 植物miR169 對(duì)NFYA 的調(diào)控作用

在單子葉和雙子葉植物中共鑒定到400 多個(gè)miR169 家族成員［9］，其成熟體序列較為保守。鷹嘴豆（Cicer arietinum）中鑒定了13 個(gè)miR169 成員，其序列一致性達(dá)到84.25%，個(gè)別成員序列完全一致［10］。葡萄（Vitis vinifera）中鑒定出25 個(gè)成員，其成熟體約一半的堿基完全一致，僅3′和5′端1-2 個(gè)堿基保守性較差［11］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）miR169 家族分為4 個(gè)亞族，為miR169a、miR169b/c、miR169d/e/f/g 及miR169h/i/j/k/l/m/n［12］。

核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）又稱CCAAT 結(jié)合因子（CCAAT-binding factor，CBF），是由3 個(gè)進(jìn)化相對(duì)保守的亞基NFYA、NFYB、NFYC 組成。NFYA 家族有2 個(gè)核心結(jié)構(gòu)域，分別為在N 端與NFYB 和NFYC 互作的結(jié)構(gòu)域，以及在C 端識(shí)別并結(jié)合DNA 位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域［13］。NFYB 與NFYC 形成二聚體尋找CCAAT-box，繼而招募NFYA 形成三聚體插入DNA 雙螺旋的小溝，使DNA 雙螺旋保持松弛狀態(tài)，從而更有利地募集RNA 聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子［14］，對(duì)其下游基因進(jìn)行調(diào)控。目前，在多種真核生物中均有NF-Y 家族成員。擬南芥NFYA、NFYB 和NFYC 家族的成員分別有10（可分為3 組，第1 組：NFYA3/4/5/6/7/8，第2 組：NFYA1/9，第3 組：NFYA2/10）、13 和13 個(gè)，推測(cè)可形成1 690 種三聚體組合［15］。CCAAT-box 存在于25%以上的真核生物基因組中［16］，暗示NF-Y 家族通過(guò)結(jié)合CCAATbox 廣泛調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，參與植物多種生理過(guò)程。

miR169 家族最主要的靶基因是NFYA 家族成員。葡萄miR169 基因家族共預(yù)測(cè)22 個(gè)靶基因，其中，有21 個(gè)屬于NFYA 家族［11］；油菜（Brassica napus）miR169 家族的16 個(gè)靶基因中，12 個(gè)屬于NFYA 家族［17］。與多數(shù)植物miRNA 作用相似，miR169 家族的調(diào)控方式多為轉(zhuǎn)錄后水平切割mRNA，使其降解。大部分NFYA 家族的3′UTR 區(qū)域有一段可以與miR169 互補(bǔ)的保守序列（不同物種中的序列有差異），擬南芥NFYA 家族成員中大多數(shù)具有這段保守序列［15］；玉米（Zea mays）14 個(gè)NFYA 成員中，有8 個(gè)可以被miR169 靶向切割［18］。在大豆（Glycine max）［19］、日本杏（Prunus mume）［20］、水稻（Oryza sativa）［21］等物種中也均有報(bào)道通過(guò)RLM-RACE 技術(shù)確定miR169 家族對(duì)靶基因3′UTR 區(qū)域的切割位點(diǎn)。miR169 也會(huì)在翻譯水平上影響靶基因的表達(dá)。擬南芥miR169i/l 的二級(jí)結(jié)構(gòu)在11 nt 和16 nt 處堿基錯(cuò)配造成的凸起，改變了AGO 蛋白的分選，導(dǎo)致沒(méi)有降低靶基因AtNFYA5的轉(zhuǎn)錄豐度，反而增加了其蛋白水平［22］。miR169 對(duì)其靶基因調(diào)控方式呈現(xiàn)多樣性。miR169/NFYA 模塊就像一個(gè)開(kāi)關(guān)，啟動(dòng)或關(guān)閉下游基因的表達(dá)，以滿足植物應(yīng)對(duì)逆境和生長(zhǎng)發(fā)育階段變化的生理需求。因此，研究miR169/NFYA模塊的作用具有重要的理論與實(shí)際意義。

2 miR169/NFYA 模塊在非生物脅迫中發(fā)揮作用

miR169/NFYA 模塊響應(yīng)鹽、旱、高溫、低溫等非生物脅迫。油菜miR169 家族啟動(dòng)子中含有干旱誘導(dǎo)元件MYB、逆境脅迫響應(yīng)元件TC-rich、脫落酸（abscisic acid，ABA）響應(yīng)元件ABRE 等［17］。擬南芥［23］和玉米幼苗［18，24］暴露于干旱脅迫、鹽脅迫及外源激素ABA 時(shí)，miR169 家族成員的表達(dá)受到強(qiáng)烈抑制，NFYA 家族基因的表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這種現(xiàn)象在玉米根中的表現(xiàn)尤為明顯。在柑橘（Citrus sinensis）［25］、棉花（Gossypium hirsutum）［26］、小麥（Triticum aestivum）［27］等物種中，NFYA 家族也會(huì)受到鹽分和干旱脅迫及外源激素ABA 的誘導(dǎo)。低氮條件下，擬南芥miR169 家族的表達(dá)也被強(qiáng)烈抑制，導(dǎo)致NFYA 基因的表達(dá)顯著上調(diào)［28］。高溫及低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)擬南芥miR169 家族基因的表達(dá)［29］。

2.1 miR169/NFYA模塊在干旱脅迫中發(fā)揮作用

由于全球氣候變化，干旱已成為限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要脅迫之一。植物受到干旱脅迫后，會(huì)通過(guò)激素信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生生理生化反應(yīng)，從而抵御干旱。施加外源ABA 可以提高植物包括干旱在內(nèi)多種非生物抗性［30］。植物遭受逆境脅迫時(shí)，編碼ABA 合成關(guān)鍵酶的NCEDs、ABAs基因表達(dá)量上升，植物體內(nèi)ABA 含量增加［31］。當(dāng)ABA 存在時(shí)，ABA 受體蛋白PYR/PYLs 與蛋白磷酸酶PP2Cs 結(jié)合并抑制其活性，從而解除PP2Cs 對(duì)蛋白激酶SnRK2s 的抑制作用，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ABFs 激活下游啟動(dòng)子中含ABRE元件的ABA 響應(yīng)基因，通過(guò)促進(jìn)葉片氣孔關(guān)閉防止水分散失［32］和促進(jìn)植物主根生長(zhǎng)吸取更多水分［33］增強(qiáng)植物抗逆性。ABA 不敏感基因（ABA-insensitive，ABI）也在ABA 信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，其中，ABI1/2編碼的PP2C 蛋白負(fù)調(diào)控ABA 信號(hào)傳導(dǎo)。然而，被SnRKs 激活的B3 類轉(zhuǎn)錄因子ABI3、AP2類轉(zhuǎn)錄因子ABI4 和bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子ABI5 則會(huì)正調(diào)控ABA 信號(hào)傳導(dǎo)［31］，例如ABI3［34］和ABI5［35］可激活編碼親水性蛋白LEA基因的表達(dá)，提高植物對(duì)滲透脅迫的耐受性。

miR169 家族參與植物抵御干旱脅迫，但其發(fā)揮的作用并不保守，miR169 對(duì)靶基因不同的調(diào)控方式使其發(fā)揮的作用不同。擬南芥miR169a 靶向切割抗旱正調(diào)控因子AtNFYA5，過(guò)表達(dá)miR169a株系與nfya5突變體表現(xiàn)出對(duì)干旱敏感相似的表型［23］。擬南芥miR169i/l 能夠增強(qiáng)AtNFYA5 蛋白豐度，過(guò)表達(dá)miR169i/l 提高擬南芥的耐旱性［22］。大豆GmmiR169c 的靶基因GmNFYA3賦予大豆的耐旱性［14］，且GmmiR169c 通過(guò)靶向切割A(yù)tNFYA1及AtNFYA5，降低擬南芥的抗旱性［19］。在油菜中沉默BnmiR169n 后，由于其靶基因BnNFYA8的增加，植物的耐旱性有所上升［36］。過(guò)表達(dá)SlmiR169c番茄（Solanum lycopersicum）降低了SlNFYA1、SlNFYA2、SlNFYA3和一個(gè)多藥耐藥相關(guān)蛋白基因（multidrug resistance-associated protein，SlMRP1）的表達(dá)，使得植物的抗旱性增強(qiáng)［37］。同樣，過(guò)表達(dá)PtmiR169o楊樹(shù)（Populus trichocarpa）通過(guò)靶向切割抗旱負(fù)調(diào)控因子PtNFYA6，增強(qiáng)了植物的抗旱性［38］。

在大豆、玉米、楊樹(shù)、柑橘和棉花等物種中，一些在干旱脅迫中發(fā)揮作用的NFYA 家族成員未被報(bào)道受miR169 的調(diào)控。非生物脅迫下，它們的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。楊樹(shù)NFYA9的啟動(dòng)子受鹽、旱脅迫的誘導(dǎo)［39］。與野生型擬南芥相比，施加外源ABA 后，異源表達(dá)GmNFYA5［40］、GmNFYA13［41］以及PtNFYA9［39］的擬南芥萌發(fā)率更低，葉片氣孔更加閉合；另一方面，轉(zhuǎn)基因擬南芥受到干旱脅迫后存活率更高，體內(nèi)ABA 積累更多。GmNFYA5、GmNFYA13 和PtNFYA9 會(huì)增加ABA 的合成，放大ABA 信號(hào)的傳導(dǎo)，增強(qiáng)植物的抗旱性。NFYA 作為NFY 家族的一個(gè)亞族，需要與NFYB、NFYC 形成三聚體發(fā)揮作用，這兩個(gè)亞族成員也會(huì)通過(guò)ABA依賴的方式增強(qiáng)植物的抗旱性［42］。大豆中NFY 家族成員會(huì)整合脫落酸信號(hào)調(diào)節(jié)植物的抗逆能力。NFYA16、NFYB2 和NFYC14 形成的三聚體可以提高PYR1的表達(dá)量，其編碼的蛋白與ABA 結(jié)合后抑制PP2C 的積累，激活SnRK2，使之磷酸化ABFs 途徑介導(dǎo)的ABA 信號(hào)傳導(dǎo)，最終提高植物的耐鹽和抗旱性［43］。楊樹(shù)NFYB21可以提高FUSCA3（FUS3）的積累，激活NCED3的表達(dá)，使楊樹(shù)根中積累更多ABA，從而增強(qiáng)主根的生長(zhǎng)來(lái)抵御旱脅迫［44］。擬南芥NFYC9 及苔蘚（Physcomitrella patens）NFYC1 也會(huì)與ABI3/5的啟動(dòng)子結(jié)合并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，提高LEA1 蛋白的積累增強(qiáng)植物的抗逆性［45-46］。這些文獻(xiàn)報(bào)道證明NF-Y 轉(zhuǎn)錄因子家族成員與ABA 信號(hào)通路具有密切的關(guān)系，調(diào)控植物的抗逆性。也有NFYA 家族成員，如水稻NFYA7不受ABA 誘導(dǎo)，OsNFYA7通過(guò)ABA 非依賴途徑參與植物賦予植物極強(qiáng)的抗旱性［47］。

2.2 miR169/NFYA模塊在鹽脅迫中發(fā)揮作用

miR169/NFYA 模塊在鹽脅迫中同樣發(fā)揮作用。植物受到鹽脅迫時(shí)，體內(nèi)ROS 水平升高，解除ROS毒性對(duì)植物抵御鹽脅迫有重要意義。鹽脅迫下，玉米miR169q 的表達(dá)受到抑制，其靶基因ZmNFYA8表達(dá)上調(diào)。ZmNFYA8 與編碼抗氧化物酶的基因ZmPER1啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)，減輕ROS 對(duì)植物的毒害作用，增強(qiáng)玉米的耐鹽性［48］。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組和ChIP 分析，大豆NFYA 會(huì)與GmLOS2（滲透性反應(yīng)低表達(dá)基因）、GmOMT（編碼O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因）、GmXTH23-2（編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡萄糖基酶/水解酶基因）等鹽響應(yīng)基因啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，賦予大豆耐鹽性［49］。

ABA 也是鹽脅迫中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)因子，外源施加ABA 會(huì)產(chǎn)生更多的脯氨酸［31］，提高抗氧化物酶活性［50］，增強(qiáng)植物對(duì)鹽的耐受性。前述GmNFYA13［41］和PtNFYA9［39］在擬南芥中過(guò)表達(dá)，同樣通過(guò)增加ABA 合成和信號(hào)傳導(dǎo)通路提高植物的鹽耐性。值得注意的是，ABA 導(dǎo)致植物萌發(fā)期胚胎發(fā)育停滯，這被認(rèn)為是提高幼苗在脅迫下存活的適應(yīng)機(jī)制之一。相較野生型，過(guò)表達(dá)AtNFYA1的擬南芥在鹽脅迫下會(huì)積累更多ABA，表現(xiàn)出嚴(yán)重的萌發(fā)后生長(zhǎng)停滯，但這種鹽敏感表型隨著植物的生長(zhǎng)逐漸消失［51］。與其他NFYA 家族成員不同，小麥NFYA10的表達(dá)受到鹽脅迫及外源ABA 的抑制，過(guò)表達(dá)TaNFYA10的擬南芥抑制ABA 信號(hào)傳導(dǎo)，使植物成苗期對(duì)鹽脅迫敏感［27］（表1，表2）。

表1 miR169/NFYA 模塊參與植物的鹽、旱脅迫Table 1 miR169/NFYA module involved in plant salt and drought stress

表2 NFYA 轉(zhuǎn)錄因子在鹽、旱脅迫中發(fā)揮作用Table 2 NFYA transcription factors playing a role in salt and drought stress

大部分miR169 家族成員在植物受到逆境脅迫下的表達(dá)都會(huì)下調(diào)，而其靶向的NFYA 家族成員表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，同時(shí)，NFYA 家族成員響應(yīng)非生物脅迫也會(huì)受到自身啟動(dòng)子的調(diào)控。NFYA 與NFYB、NFYC 形成三聚體直接或間接正調(diào)控其下游ABA 合成基因（NCED3、ABA1、ABA2）、ABA 信號(hào)傳導(dǎo)基因（PYR1、ABFs、ABI3和ABI5）賦予植物耐逆性。另外，NFYA 家族成員還會(huì)激活逆境響應(yīng)基因（DREB1、WRKY4、MYB84、NHX1、SOS1、SALT3等）的表達(dá)增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性（圖1）。

圖1 miR169/NFYA 模塊在植物鹽、旱脅迫中的調(diào)控機(jī)理Fig.1 Regulatory mechanism of miR169/NFYA module in plants under salt and drought stress

3 miR169/NFYA 模塊對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育也會(huì)受到影響。ChIP-seq 及RNA-seq 的結(jié)果表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子GRF1/3（growth-regulating factors1/3）通過(guò)調(diào)節(jié)防御和發(fā)育相關(guān)基因以及激素水平來(lái)平衡植物的生長(zhǎng)與防御［53］。參與植物花發(fā)育的TOE3（target of early activation tagged）、ELF3（early flowering）可以提高植物的冷抗性及耐鹽性［54-55］。miR169/NFYA 模塊也參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

擬南芥應(yīng)激條件下miR169m/o 表達(dá)量降低，導(dǎo)致其靶基因AtNFYA2/3/7/10的表達(dá)急劇上升。AtNFYA2/3/7/10 會(huì)抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致植物矮化、生長(zhǎng)停滯、種子變?。?6］；擬南芥NFYA1/5/6/9 也有同樣的功能［57］。miR169/NFYA 模塊在植物花器官的發(fā)育中也起到了重要的作用。過(guò)表達(dá)miR169 的擬南芥中，其靶基因AtNFYA2的表達(dá)降低，導(dǎo)致提前開(kāi)花。AtNFYA2 與開(kāi)花抑制因子FLC（flowering locus C）啟動(dòng)子中的AACCT 元件結(jié)合并激活其表達(dá)，推遲植物的開(kāi)花時(shí)間［58］。擬南芥NFYA8 與miR156 的啟動(dòng)子結(jié)合阻止植物幼苗向成苗轉(zhuǎn)換，延遲植物開(kāi)花時(shí)間［59］。

4 展望

本文綜述了miR169/NFYA 模塊參與植物非生物脅迫的作用機(jī)制。為了更好地利用候選基因改良作物的耐鹽抗旱性，還有一些問(wèn)題需要研究：（1）在一些極端耐鹽、耐旱的植物中探討miR169/NFYA 模塊的作用機(jī)理或許可以得到更多信息。（2）miRNA常常有多個(gè)功能不同的靶基因，miRNA 對(duì)植物生理過(guò)程的調(diào)控是精細(xì)且復(fù)雜的。目前，對(duì)于miR169 靶基因的研究主要集中于NFYA 家族，可利用降解組測(cè)序技術(shù)更廣泛地研究miR169 的靶基因網(wǎng)絡(luò)，宏觀了解其在植物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制。（3）NFYA 在逆境脅迫中多發(fā)揮正向調(diào)控作用，但會(huì)使擬南芥具有晚花、種子變小等表型。將其作為候選基因進(jìn)行抗逆分子育種，還需更深入研究。