王 博，張 婧，貢松松，張浩然，徐 汀，陳思思，吳劍平，嚴(yán) 鳳

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

蛋白同化激素俗稱合成類固醇，是一類擬雄性激素的人工合成的甾體激素，用藥后易吸收，血中濃度高，體內(nèi)活性大，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)異化，增加食欲、增長(zhǎng)肌肉、增加體重及增強(qiáng)體質(zhì)等多種作用［1－2］。因此有不法商家在肉用畜禽飼料中添加此類激素以提高產(chǎn)量和品質(zhì)，但這些激素會(huì)通過肉、奶、蛋等副食品向人體內(nèi)遷移蓄積，長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致肝功能障礙，兒童性早熟，異性特征顯現(xiàn)，內(nèi)分泌紊亂，甚至誘發(fā)一些腺體腫瘤［3－5］。

國(guó)內(nèi)在2008年制定了GB/T 22260－2008《飼料中甲基睪丸酮的測(cè)定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》［6］，但檢測(cè)藥物只有1種，而同年發(fā)布的農(nóng)業(yè)部公告1068－3－2008《飼料中10種蛋白同化激素的測(cè)定液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》［7］中涵蓋了10種常用蛋白同化激素，但檢測(cè)的蛋白同化激素只有4大類。根據(jù)生化結(jié)構(gòu)與化學(xué)合成方法，常用的蛋白同化激素可分為睪酮衍生物、雄烷衍生物、諾龍衍生物、雜環(huán)衍生物、雜類合成類固醇5大類，現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均不能滿足實(shí)際檢測(cè)要求。自1988年起，歐盟就已禁止動(dòng)物源性食品中使用激素，日本規(guī)定牛肉中雌三醇、孕酮的最大殘留限量（MRL）為0.01 mg/kg，美國(guó)規(guī)定牛肉、羊肉中孕酮的MRL為0.003 mg/kg，韓國(guó)規(guī)定牛肉中孕酮的MRL也為0.003 mg/kg［8］。

國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于蛋白同化激素含量檢測(cè)的文獻(xiàn)，檢測(cè)方法多為液相色譜－質(zhì)譜法［9－12］、氣相色譜－質(zhì)譜法［13－16］，檢測(cè)對(duì)象多為血清［17－18］、動(dòng)物組織［19－20］和尿液［21－22］，關(guān)于飼料中蛋白同化激素的研究較少。飼料基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，已有標(biāo)準(zhǔn)采用基質(zhì)匹配方法進(jìn)行定量，但操作繁瑣不便于推廣。本文以睪酮衍生物（睪酮、甲基睪酮、勃地龍）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮）、諾龍衍生物（諾龍、丙酸諾龍）、雜環(huán)衍生物（司坦唑醇）和雜類合成類固醇（美倫孕酮、黃體酮）5大類蛋白同化激素為研究對(duì)象，建立了同時(shí)檢測(cè)配合飼料中11種蛋白同化激素的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，采用內(nèi)標(biāo)法輔助定量，能很好彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)外的研究空白。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC－XEVO－TQ－MS高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（美國(guó)Waters公司）；離心機(jī)（德國(guó)Beckman公司）；萬分之一電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）；旋渦振蕩器（北京Targin公司）；氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國(guó)默克公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司）；睪酮、甲基睪酮、勃地龍、美雄酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮、諾龍、丙酸諾龍、司坦唑醇、美倫孕酮、黃體酮、睪酮－D3、甲基睪酮－D3、勃地龍－D3、美雄酮－D3、雄烯二酮－D7、脫氫異雄酮－D2、諾龍－D3、丙酸諾龍－D3、司坦唑醇－D3、美倫孕酮－D3、黃體酮－D9（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）。飼料樣品均來自市面收集，于3℃下保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

11種蛋白同化激素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：稱取各蛋白同化激素對(duì)照品10 mg，用乙腈定容于10 mL容量瓶中；11種同位素內(nèi)標(biāo)混合儲(chǔ)備液（1 μg/mL）：準(zhǔn)確量取各同位素內(nèi)標(biāo)母液（100 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容。標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

稱取試樣1 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和20 mL乙腈，以1 500 r/min振蕩提取20 min，9 000 r/min離心5 min。取3 mL上清液至50 mL離心管中，加入100 mg PSA粉，渦旋1 min，9 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液至10 mL離心管中，于50℃下用氮?dú)獯蹈桑? mL 50%乙腈溶液溶解，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

1.4 測(cè)定條件

色譜條件：色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.01%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，40%A；2～5 min，40%～100%A；5～6 min，100%A；6～6.1 min，100%～40%A；6.1～7.5 min，40%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式掃描；載氣：800 L/min；反吹氣：3 L/min；霧化氣溫度：500℃；電離電壓：3.5 kV；離子源溫度：150℃。各目標(biāo)物的采集離子對(duì)信息及質(zhì)譜條件見表1。

表1 各目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜碎片離子信息、錐孔電壓、碰撞能量及保留時(shí)間Table 1 Mass spectral fragment ion informations，cone voltages，collision energies and retention times of analytes and their internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化

ESI+離子化模式下，在m/z50～1 000范圍內(nèi)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到11種目標(biāo)物的總離子色譜圖，選擇2個(gè)離子作為定性離子，選擇響應(yīng)高且無雜質(zhì)干擾的1個(gè)離子作為定量離子，各目標(biāo)物的母離子和子離子見表1。比較其提取離子色譜圖的響應(yīng)和峰形，依次優(yōu)化得到各參數(shù)如“1.4”所示。

以Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）為分離色譜柱，分別考察了甲醇-0.1%甲酸（40∶60，體積比，下同）、甲醇-0.1%甲酸（80∶20）、乙腈-0.1%甲酸（60∶40）、乙腈-0.1%甲酸（40∶60）、乙腈-0.05%甲酸（40∶60）、乙腈-0.01%甲酸（40∶60）、乙腈-水（40∶60）為流動(dòng)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相有機(jī)相為甲醇時(shí)，部分目標(biāo)物的峰形較差，響應(yīng)較低，可能是因?yàn)椴糠帜繕?biāo)物難溶于甲醇；當(dāng)流動(dòng)相不含酸時(shí)，丙酸諾龍的響應(yīng)差，當(dāng)流動(dòng)相中含少量酸時(shí)，各目標(biāo)物的峰形好，響應(yīng)高，因此選用乙腈-0.01%甲酸（40∶60）作為流動(dòng)相。同時(shí)對(duì)流速、色譜柱溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定色譜條件如“1.4”所示。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇向空白豬配合飼料中添加11種蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)品，考察了分別以甲醇、30%甲醇、乙腈、30%乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)的提取效果。結(jié)果表明，以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)的提取效率相對(duì)較高，這可能是因?yàn)椴糠帜繕?biāo)物不溶于水或甲醇所致?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的選擇向空白豬配合飼料中添加11種蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)乙腈提取后，分別選擇常用的SPE法（分別為HLB（60 mg/3mL）、PRIME HLB（60 mg/3mL）、MCX（60 mg/3 mL）固相萃取柱）、正己烷液液萃取法和QuEChERS法進(jìn)行凈化條件考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用SPE法凈化時(shí)司坦唑醇較難洗脫，可能是因?yàn)殓薮碱愃幬镆妆晃剑皇褂谜和橐阂狠腿艋瘯r(shí)，正己烷會(huì)將一部分蛋白同化激素除去，造成損失。因此采用QuEChERS法凈化，分別對(duì)比了酸性Al2O3、C18和PSA粉3種凈化劑的效果，發(fā)現(xiàn)選擇酸性Al2O3時(shí)司坦唑醇約有40%被吸附，選擇C18粉時(shí)會(huì)造成部分目標(biāo)物損失，而選擇PSA粉時(shí)能較大提高丙酸諾龍的提取效率，且對(duì)其余目標(biāo)物影響不大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇PSA粉作為凈化條件。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)是指在樣品測(cè)試過程中，待測(cè)物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響待測(cè)物響應(yīng)的現(xiàn)象，從而影響定量分析的可靠性和準(zhǔn)確性。基質(zhì)效應(yīng)可通過下式評(píng)價(jià)：ME（%）=基質(zhì)溶液中分析物的峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锏姆迕娣e×100%。當(dāng)ME在85%～115%之間，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME大于或小于85%時(shí)，表明存在基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)分別比較了不同空白豬配合飼料和雞配合飼料基質(zhì)中添加100 μg/kg蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。如圖1所示，11種蛋白同化激素的ME值為51.6%～105%，表明基質(zhì)對(duì)部分目標(biāo)物檢測(cè)有抑制作用。消除基質(zhì)效應(yīng)的常見方法有基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法，本實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)標(biāo)法輔助定量。

圖1 11種蛋白同化激素的基質(zhì)效應(yīng)Fig.1 Matrix effects of 11 anabolic androgenic steroids

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密移取適量11種蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用50%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL），在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

以蛋白同化激素和同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)（X），蛋白同化激素和同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各蛋白同化激素在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均為0.999。

2.3.3 檢出限與定量下限在上述空白豬配合飼料和雞配合飼料中添加一定濃度的蛋白同化激素對(duì)照品，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限和定量下限。確定本方法的檢出限為20 μg/kg，定量下限為50 μg/kg?？瞻纂u配合飼料中添加50 μg/kg的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

圖2 空白雞配合飼料中添加50 μg/kg的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank chicken compound feed added 50 μg/kg

2.3.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選取9類空白飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)，樣品分別添加50、250、500 μg/kg 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其中，雞配合飼料和豬配合飼料的結(jié)果分別見表2和表3。3個(gè)加標(biāo)水平下，雞配合飼料中各蛋白同化激素的回收率為94.5%～111%，日內(nèi)RSD為1.2%～13%，日間RSD為1.4%～13%；豬配合飼料中各蛋白同化激素的回收率為90.1%～109%，日內(nèi)RSD為1.5%～9.0%，日間RSD為1.6%～8.8%。結(jié)果均符合GB/T 23182－2008《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測(cè)試驗(yàn)規(guī)程》［23］的要求。

表2 雞配合飼料中11種蛋白同化激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 11 anabolic androgenic steroids in chicken compound feed（n=5）

表3 豬配合飼料中11種蛋白同化激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 anabolic androgenic steroids in pig compound feed（n=5）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)收集的30批配合飼料樣品進(jìn)行測(cè)定。在8批雞配合飼料中檢出睪酮和勃地龍，含量分別為9.09～14.68 mg/kg和1.22～1.84 mg/kg（見表4）。

表4 陽性實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of actual positive samples

3 結(jié)論

本研究建立了配合飼料中11種蛋白同化激素的HPLC－MS/MS檢測(cè)方法。本方法前處理簡(jiǎn)便，采用內(nèi)標(biāo)法定量，便于操作且易于推廣，可對(duì)飼料中蛋白同化激素進(jìn)行較為全面的檢測(cè)，有助于飼料中違法濫用蛋白同化激素的監(jiān)管。