盧顧偉 高 振 臧一天 毛 康 歐陽克蕙 李艷嬌

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/動物營養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團隊，南昌330045)

畜禽在生產(chǎn)過程中，不可避免遭受各種應激。應激激活下丘腦-垂體-腎上腺素(hypothalamus-pituitary-adrenergic，HPA)軸，引起血漿糖皮質(zhì)激素等激素分泌增加，造成機體代謝紊亂。肌肉能量狀態(tài)的改變是應激造成肌肉發(fā)育受阻的一個重要因素，因此，改善應激狀態(tài)下肌肉能量代謝狀態(tài)，對于提高畜禽生產(chǎn)水平有重要意義。糖皮質(zhì)激素是腎上腺皮質(zhì)束狀區(qū)分泌的一種激素，在維持能量代謝的內(nèi)環(huán)境平衡中起著重要作用。骨骼肌是糖皮質(zhì)激素的一個重要靶器官，糖皮質(zhì)激素可抑制骨骼肌葡萄糖攝取、利用以及糖原合成，并促進兒茶酚胺誘導的肌糖原分解，抑制胰島素刺激的糖原合成，引起骨骼肌胰島素抵抗[1]。然而，有研究表明，盡管糖原合成減少，但地塞米松(dexamethasone，DEX)處理卻增加了比目魚肌的糖原儲存[2]。這些表型背后的機制尚不清楚，或許與糖皮質(zhì)激素下調(diào)糖酵解相關因子有關，使得糖原分解減少。Xu等[3]研究表明，大劑量的地塞米松會下調(diào)C57BL/6小鼠糖酵解相關因子，并使葡萄糖的攝取減少。糖皮質(zhì)激素進入細胞內(nèi)，與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors，GR)結(jié)合，上調(diào)鈣離子(Ca2+)釋放通道，致使肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+流入胞漿，同時下調(diào)肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，降低肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+攝取能力，引發(fā)胞漿內(nèi)Ca2+超載[4]。Ca2+超載則會觸發(fā)一系列損傷機制，包括降低線粒體呼吸鏈關鍵酶活性、抑制線粒體的氧化磷酸化、激活磷脂酶導致細胞膜結(jié)構(gòu)受損、激活蛋白水解酶導致細胞凋亡等[5-8]。此外，諸多研究表明，糖皮質(zhì)激素能夠誘導細胞氧化應激[9-10]。氧化應激會引起線粒體損傷，活性氧(ROS)短期內(nèi)急劇積累，長時間氧化應激甚至導致線粒體功能障礙[11]。細胞線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞過程中偶聯(lián)ATP的線粒體呼吸復合酶活性升高[12]，線粒體氧化磷酸化減弱，產(chǎn)生的ATP供給不足，進而影響能量代謝[13]。由以上研究報道可知，短期應用糖皮質(zhì)激素可引起能量代謝升高，長期應用則引起肌肉糖酵解效率降低，同時導致組織的線粒體功能下降。

飼糧營養(yǎng)手段能夠增強畜禽機體能量代謝調(diào)節(jié)功能，有效緩解應激。肌肽(carnosine，Car)是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽，廣泛存在于脊椎動物肌肉、大腦等組織中，具有氫離子(H+)緩沖劑、Ca2+調(diào)節(jié)劑、抗糖化、調(diào)節(jié)能量代謝、維持線粒體功能、改善肉質(zhì)等作用[14-18]。β-丙氨酸(β-alanine，β-Ala)是肌肽在體內(nèi)合成的重要限速前體[19]，補充β-丙氨酸已被證明能夠以飼糧添加劑的方式增加肌肉肌肽的合成和含量[20-22]，且相比于肌肽，價格較低。β-丙氨酸被認為是競技運動員用來提高運動成績的較受歡迎的補充劑之一[23-25]。當β-丙氨酸與組氨酸在骨骼肌中結(jié)合時形成肌肽，組氨酸殘基的咪唑環(huán)的解離常數(shù)(pKa)增加到6.83，使其成為高效的細胞內(nèi)pH緩沖液，并增強細胞內(nèi)緩沖能力，從而提高對持續(xù)無氧活動的耐受性[21,26]。有研究表明，肌肽能夠調(diào)控HPA軸，減少糖皮質(zhì)激素誘導的機體氧化損傷和代謝紊亂[27-28]。肌肽被認為與肌肉的收縮功能和Ca2+的轉(zhuǎn)運能力密切相關[17]。肌肽也被證明可以緩沖運動誘導的酸中毒[22]，可以在線粒體Ca2+超載的環(huán)境中有效維持線粒體的正常功能[29-31]，并防止運動誘導的氧化應激[32-33]。研究表明，肌肽能夠降低拘束應激小鼠體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的水平，提高葡萄糖的儲備，并激活肝臟中糖原合成激酶，促進肝臟的糖原合成，有效改善應激小鼠能量代謝[34]。然而在糖皮質(zhì)激素(地塞米松)誘導的小鼠骨骼肌細胞(C2C12細胞)能量代謝損傷模型中，肌肽和β-丙氨酸是否通過調(diào)節(jié)其糖酵解代謝和線粒體功能來改善能量代謝尚不清楚。因此，本研究旨在探索肌肽和β-丙氨酸對C2C12細胞能量代謝損傷的調(diào)節(jié)作用，為肌肽和β-丙氨酸在生產(chǎn)上應用于緩解畜禽應激提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

肌肽購自上海希格瑪高技術(shù)有限公司，商品編號：C9635-5G，純度≥99.9%。β-丙氨酸購自北京索萊寶科技有限公司，商品編號：SA8090，純度≥99.9%。測定ATP、糖原和乳酸含量，測定磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)、線粒體呼吸鏈復合酶Ⅱ和Ⅳ以及Ca2+-ATP酶活性的相關試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定葡萄糖含量的試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

試驗細胞C2C12小鼠成肌細胞由江西農(nóng)業(yè)大學曾慶杰老師課題組饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 C2C12小鼠成肌細胞培養(yǎng)

將C2C12小鼠成肌細胞接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，加入3 mL基礎培養(yǎng)基(高糖DMEM溶液中加入10%胎牛血清，1% 100 U/L青霉素+鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在鏡下觀察細胞匯合率達到80%～90%時，更換培養(yǎng)基(高糖DMEM溶液中加入2%馬血清，1% 100 U/L青霉素+鏈霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)，誘導分化。每2 d更換培養(yǎng)液，待細胞分化5～6 d形成可收縮的肌管后，收集細胞待用。

1.2.2 試驗分組

將分化后的C2C12骨骼肌細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，其中一組加入正常分化基持續(xù)孵育36 h作為對照組，記為Control組；一組加入正常分化基孵育24 h后再加入10 μmol/L地塞米松處理細胞12 h(地塞米松添加量參考Chai等[4])，記為DEX組；一組加入10 mmol/L肌肽孵育24 h后再加入10 μmol/L地塞米松處理細胞12 h(肌肽添加量參考Cripps等[35])，記為Car組；一組加入10 mmol/L β-丙氨酸孵育24 h后再加入10 μmol/L地塞米松處理細胞12 h(β-丙氨酸添加量參考Schnuck等[36])，記為β-Ala組。試驗結(jié)束后，即刻收樣。

1.2.3 C2C12細胞內(nèi)Ca2+含量測定

參照游敏芳等[37]的方法，將培養(yǎng)后的C2C12細胞按照鈣離子熒光探針Fluo-3/AM檢測試劑盒說明書對Ca2+進行熒光負載，倒置熒光顯微鏡觀察負載效果，并利用熒光酶標儀檢測其熒光值，通過公式計算出C2C12細胞內(nèi)Ca2+濃度

Ca2+濃度=Kd×F/F0。

式中：F為表達載體的熒光值；F0為水對照組的熒光值；Kd為Ca2+的解離常數(shù)(224)。

1.2.4 ATP含量、糖酵解及相關酶活性、線粒體相關酶活性測定

各組C2C12細胞上清液棄去，將細胞刮下，用PBS沖洗并離心得細胞沉淀，按照相應說明書加入相應提取液，混勻后在冰上使用超聲波細胞破碎儀經(jīng)行破碎。破碎的C2C12細胞懸液經(jīng)離心后取相應上清液，按照廠家說明書在96孔板上進行ATP、葡萄糖、糖原(表示每管收集到的所有細胞總糖原的含量，細胞數(shù)量在106個左右)、乳酸含量檢測和PFK、HK、PK、LDH、CS、線粒體呼吸鏈復合酶Ⅱ和Ⅳ以及Ca2+-ATP酶活性檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以平均值和標準誤(SE)表示，各組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析，并采用Dunnettt法檢驗進行組間比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 地塞米松、肌肽及β-丙氨酸對C2C12細胞內(nèi)ATP含量的影響

由圖1可知，與Control組相比，DEX組細胞內(nèi)ATP含量顯著降低(P<0.05)，β-Ala組細胞內(nèi)ATP含量極顯著升高(P<0.01)。與DEX組相比，Car組和β-Ala組細胞內(nèi)ATP含量顯著升高(P<0.05)。

2.2 地塞米松、肌肽及β-丙氨酸對C2C12細胞內(nèi)糖酵解的影響

由圖2可知，與Control組相比，DEX組細胞內(nèi)糖原含量顯著升高(P<0.05)，細胞內(nèi)葡萄糖和乳酸含量極顯著降低(P<0.01)。與DEX組相比，Car組和β-Ala組細胞內(nèi)葡萄糖含量顯著升高(P<0.05)，β-Ala組細胞內(nèi)糖原含量顯著降低(P<0.05)，Car組和β-Ala組細胞內(nèi)乳酸含量無顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 肌肽、β-丙氨酸及地塞米松對C2C12細胞內(nèi)糖酵解相關酶活性的影響

由圖3可知，與Control組相比，DEX組細胞內(nèi)HK活性極顯著升高(P<0.01)，細胞內(nèi)PK和LDH活性極顯著降低(P<0.01)。與DEX組相比，Car組和β-Ala組細胞內(nèi)HK活性極顯著降低(P<0.01)，細胞內(nèi)PFK活性極顯著升高(P<0.01)；β-Ala組細胞內(nèi)LDH活性極顯著升高(P<0.01)，Car組細胞內(nèi)LDH活性顯著升高(P<0.05)；Car組和β-Ala組細胞內(nèi)PK活性無顯著差異(P>0.05)。

2.4 肌肽、β-丙氨酸及地塞米松對C2C12細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

由圖4可知，與Control組相比，DEX組細胞內(nèi)Ca2+含量顯著升高(P<0.05)。與DEX組相比，Car組和β-Ala組細胞內(nèi)Ca2+含量顯著降低(P<0.05)。

2.5 肌肽、β-丙氨酸及地塞米松對C2C12細胞內(nèi)線粒體相關酶活性的影響

由圖5可知，與Control組相比，DEX組、Car組和β-Ala組細胞內(nèi)Ca2+-ATP酶活性極顯著降低(P<0.01)，線粒體呼吸鏈復合酶Ⅳ活性極顯著升高(P<0.01)。各組之間細胞內(nèi)CS、線粒體呼吸鏈復合酶Ⅱ活性無顯著差異(P>0.05)。

圖2 地塞米松、肌肽及β-丙氨酸對C2C12細胞內(nèi)糖酵解的影響

圖3 地塞米松、肌肽及β-丙氨酸對C2C12細胞內(nèi)糖酵解相關酶活性的影響

3 討 論

地塞米松被廣泛用于治療炎癥性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病等[37-39]。然而，地塞米松可以通過增加蛋白質(zhì)分解率來降低骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率，并大量產(chǎn)生ROS，引發(fā)胞漿內(nèi)Ca2+超載，誘導骨骼肌細胞受損[4,40]。地塞米松能夠通過降低靜息狀態(tài)下骨骼肌的氧化磷酸化，減少ATP的生成，并通過降低葡萄糖的攝取影響能量代謝[41-42]。

圖4 地塞米松、肌肽及β-丙氨酸對C2C12

本試驗采用10 μmol/L地塞米松作用于小鼠C2C12細胞，模擬畜禽遭受應激時糖皮質(zhì)激素對于骨骼肌能量代謝的影響，結(jié)果顯示，與Control組相比，DEX組C2C12細胞內(nèi)ATP含量顯著下降，表明地塞米松刺激下C2C12細胞能量代謝嚴重受損；進一步試驗表明，DEX組細胞內(nèi)糖原含量顯著升高，葡萄糖和乳酸含量顯著下降，提示地塞米松誘導C2C12細胞糖酵解能力下降。據(jù)報道，單獨使用地塞米松會導致雄性SD大鼠骨骼肌中糖原含量升高[43]。長時間地塞米松刺激，細胞葡萄糖的攝取和糖酵解途徑的關鍵調(diào)節(jié)因子都會下調(diào)[2,44-45]，肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放率降低，導致肌糖原的利用率隨之下降，肌糖原的分解受到抑制。所以本試驗結(jié)果呈現(xiàn)為DEX組細胞內(nèi)糖原含量升高，葡萄糖含量下降。雖然添加地塞米松提高了細胞內(nèi)HK活性，促進骨骼肌進行糖酵解的第一步，即加速葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G6P)的轉(zhuǎn)化，但由于細胞內(nèi)PK與LDH活性降低，使轉(zhuǎn)化而成的G6P不能更快地轉(zhuǎn)化為乳酸并提供ATP。而添加肌肽和β-丙氨酸后，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)PFK和LDH活性，提高C2C12細胞糖酵解能力，并且肌肽能夠在線粒體Ca2+超載的環(huán)境中有效維持Ca2+對肌糖原的轉(zhuǎn)運能力[31-32]，調(diào)節(jié)C2C12細胞對肌糖原的利用能力[46]，所以肌肽與β-丙氨酸組細胞內(nèi)糖原含量降低，乳酸含量升高。Hipkiss等[27]研究報道，肌肽在糖酵解前體1,6-二磷酸果糖形成之前抑制糖酵解，即對HK活性一定抑制作用，但整體促進糖酵解，與本研究結(jié)果一致。Tsoi等[47]研究表明，肌肽不僅能逆轉(zhuǎn)應激所致的糖耐量和肌肉中糖原含量的下降，而且還能降低血液中皮質(zhì)酮含量。肌肽還可能通過抑制糖原異生，促進糖原合成，促進糖酵解，并通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝酶促進葡萄糖從血液到肝臟的轉(zhuǎn)運，從而部分改善機體能量代謝[47]。

添加肌肽和β-丙氨酸提高了細胞內(nèi)ATP含量，這可能不僅由于肌肽和β-丙氨酸可以刺激糖酵解供能，還與能夠調(diào)節(jié)ROS誘導的線粒體功能障礙有關[48-49]。線粒體是細胞的能量供應中心，提供細胞代謝所需的95%以上的ATP[50]，當ROS大量產(chǎn)生，肌肽也能通過調(diào)控線粒體呼吸鏈維持能量供應[51]。因此，本試驗又對線粒體相關酶活性進行了測定，以探究肌肽和β-丙氨酸對地塞米松影響的C2C12細胞線粒體功能的調(diào)控作用。添加肌肽和β-丙氨酸對細胞內(nèi)CS活性有一定的提高作用，這提示肌肽和β-丙氨酸不僅可能刺激糖酵解供能，還可能減弱ROS對骨骼肌細胞線粒體的損傷，加強應激狀態(tài)下線粒體的氧化磷酸化。Macedo等[49]報道也發(fā)現(xiàn)急性肌肽給藥提高了幼鼠大腦CS活性。骨骼肌產(chǎn)生的能量與特定酶的活性有關。在細胞中，一些酶代表無氧代謝，即檸檬酸合成酶(Krebs循環(huán)酶之一)、細胞色素C氧化酶(線粒體呼吸鏈復合酶Ⅳ)，以及與無氧代謝相關的酶，如LDH[52]。研究表明，在運動性疲勞后，骨骼肌的有氧呼吸酶和厭氧呼吸酶活性都沒有變化，但會刺激線粒體的生物生成，并促進肌肉組織重塑為糖酵解更少的纖維型成分[53]。呼吸鏈主要負責進行生物氧化并且能夠與ATP酶結(jié)合完成氧化磷酸化為細胞提供能量。因此，線粒體呼吸鏈復合體的活性高低直接影響線粒體呼吸鏈傳遞電子的速率和細胞正常的能量代謝活動。地塞米松導致線粒體呼吸功能下降，表現(xiàn)為線粒體呼吸控制率降低、線粒體膜電位降低、ATP合成減少、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體DNA損傷、ROS積累[44]。地塞米松誘導肌肉受損的另一個機制是導致肌肉抑制素基因表達上調(diào)，這也與地塞米松導致線粒體腫脹或空泡化有關[54]。本研究中，與Control組相比，DEX組、Car組和β-Ala組細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復合酶Ⅳ活性顯著上升，線粒體呼吸鏈復合酶Ⅱ活性無顯著差異。由于細胞種類的不同，肌肽對線粒體功能調(diào)控的能力有差異。據(jù)報道，在以糖酵解為主提供能量的SGC7901細胞、宮頸癌細胞、胃癌細胞中，肌肽顯著降低線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ～Ⅳ的活性和線粒體ATP的生成，并降低三羧酸循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的活性，抑制細胞糖酵解供能[55-57]。而在以線粒體氧化磷酸化為主供能的公羊精子細胞與肌細胞中，肌肽不僅可以刺激細胞糖酵解供能，還可以促進線粒體氧化磷酸化[58-59]。我們推測肌肽保護與促進應激狀態(tài)下的線粒體功能是由于肌肽的抗氧化功能[60-61]，肌肽通過清除ROS并直接與超氧陰離子和過氧基反應，減少線粒體因ROS大量堆積帶來的線粒體腫脹與空泡化[62]。

圖5 肌肽、地塞米松及β-丙氨酸對C2C12細胞線粒體相關酶活性的影響

細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的平衡對于維持細胞正常機能非常重要，鈣穩(wěn)態(tài)的破壞會給機體帶來許多危害。在肌肉疲勞收縮期間，肌漿網(wǎng)的Ca2+釋放、肌纖維對Ca2+的敏感性和對Ca2+的重新吸收都會減少[63]。這些因素與代謝副產(chǎn)物H+的堆積協(xié)同作用，導致肌肉在劇烈收縮活動期間失去功能。地塞米松刺激骨骼肌細胞中Ca2+-ATP酶活性顯著下降，胞漿中游離多余鈣攝入肌質(zhì)網(wǎng)腔，導致Ca2+轉(zhuǎn)運功能改變。肌肽和β-丙氨酸的添加對Ca2+-ATP酶有一定的提高作用，但效果不顯著，但對細胞內(nèi)因地塞米松引起的Ca2+超載有顯著的調(diào)節(jié)作用。肌肽在促進肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放和增加肌纖維對Ca2+的敏感性方面發(fā)揮了作用[64-65]。肌肉的pH和Ca2+的轉(zhuǎn)運能力是密不可分的，在應激情況下，負責Ca2+攝取的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-ATP酶泵率在pH從7.1下降到6.6的過程中下降了近2倍[53]。而肌肽中的咪唑環(huán)緩沖pH來源于肌肽結(jié)合肌肉H+的能力，間接地維持肌肉細胞對Ca2+的轉(zhuǎn)運能力[32,66]。

本研究發(fā)現(xiàn)，作為肌肽合成前體的β-丙氨酸對C2C12細胞的能量代謝與線粒體代謝的調(diào)控表現(xiàn)出更佳的效果，具體表現(xiàn)為細胞內(nèi)ATP含量及HK、LDH、CS活性的上升。肌肽進入腸道后，空腸黏膜中的組織肌肽酶2(CN2)會將肌肽水解為其組成氨基酸β-丙氨酸和L-組氨酸，在此過程中需要消耗部分ATP[68]。最終只有約14%的肌肽可以進入血液被機體直接使用，而β-丙氨酸卻可以直接進入血液通過質(zhì)子輔助的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1和?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白進入骨骼肌，并在肌肽合成酶的催化下合成肌肽[67-68]。此外，由于肌肽在腸道中的生物利用度有限，補充β-丙氨酸通過肌肽合成酶1(Carns1)介導的反應比補充肌肽更大程度地增加肌肉中肌肽的合成[40]。而在Schnuck等[36]的研究中，β-丙氨酸對線粒體代謝的影響可能更多來源于對氧化代謝改善的標志物增加，包括細胞內(nèi)過氧化體增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4含量增加，這導致線粒體含量增加與葡萄糖攝取的增加[40]。在今后的研究中，應當設置α-丙氨酸、組氨酸作對照，以便更加明確地區(qū)別在細胞能量代謝調(diào)控中，β-丙氨酸是作為底物促進肌肽合成還是作為功能物質(zhì)發(fā)揮的作用。

4 結(jié) 論

① 地塞米松處理導致C2C12細胞內(nèi)PK、PFK、LDH活性降低，Ca2+含量升高，ATP生成減少，影響細胞正常的能量代謝。

② 添加肌肽能夠促進C2C12細胞在應激狀態(tài)下的葡萄糖含量，并促進PFK、LDH的糖酵解進程，為細胞供能，對Ca2+超載有一定緩解作用，但并未見對細胞線粒體功能相關酶活信有顯著作用。

③ 添加β-丙氨酸能夠調(diào)節(jié)C2C12細胞在應激狀態(tài)下的能量代謝，通過促進糖酵解相關活PFK、LDH活性促進細胞ATP含量提升，并對Ca2+超載有一定緩解作用。