閆春梅，鄭偉，韓葉，李忠強(qiáng)，肖治國(guó)，陳偉強(qiáng)，柳鵬

（吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 吉林 130033）

冷水性溯河產(chǎn)卵洄游大麻哈魚（Oncorhynchus keta Walbaum），俗稱太平洋鮭、大馬哈魚等[1]，曾在吉林省圖們江流域廣泛分布。近些年由于興修水利等人為因素破壞了大麻魚產(chǎn)卵洄游通道，影響自然繁殖，生殖洄游親本數(shù)量銳減，野生資源衰退，目前已處于瀕危狀態(tài)[2]。圖們江流域大麻哈魚群體遺傳多樣性較豐富[3]，可以通過(guò)人工增殖放流的方式補(bǔ)充大麻哈魚資源量。吉林省已開(kāi)展大麻哈魚增殖放流活動(dòng)十余年，年放流數(shù)量達(dá)40～50 萬(wàn)尾。隨之展開(kāi)的大麻哈魚放流效果評(píng)估研究也已經(jīng)歷了從掛牌標(biāo)記[4]、剪鰭法[5]、熒光標(biāo)記[6,7]到微衛(wèi)星標(biāo)記[8-10]、耳石標(biāo)記[11,12]等多個(gè)階段。剪鰭法和金屬線標(biāo)法甚至熒光標(biāo)記法均對(duì)魚體造成不同程度的傷害，且需逐尾操作，不適宜大規(guī)模標(biāo)記。微衛(wèi)星法對(duì)魚體沒(méi)有傷害，但操作門檻高，需要專業(yè)的分子生物學(xué)作為技術(shù)支撐，且耗資巨大，亦不適用于大規(guī)模標(biāo)記。

耳石是硬骨魚類內(nèi)耳的鈣質(zhì)結(jié)晶，能準(zhǔn)確記錄生活史中經(jīng)歷的溫度變化，閱讀耳石輪紋的周期性、明暗度、寬窄度等信息即可推斷魚類生活的歷史水溫變化[13]。耳石溫控標(biāo)記法即通過(guò)短期調(diào)控環(huán)境水溫，改變耳石上的日輪形成方式，形成終身不變的標(biāo)記，為評(píng)估大麻哈魚人工增殖放流效果提供技術(shù)支持。目前，耳石溫控標(biāo)記法已在紅點(diǎn)鮭（Salvelinus namaycush）[14]、太平洋鮭（Oncorhynchus spp）[15]、胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）[16]、大西洋鱈（Gadus morhua）[17]上獲得了成功經(jīng)驗(yàn)。本研究采用改變孵化期水溫的方式標(biāo)記大麻哈魚耳石，根據(jù)不同的日輪圖譜確定其來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 大麻哈魚發(fā)眼卵

試驗(yàn)用大麻哈魚發(fā)眼卵由吉林省延吉市青龍漁業(yè)有限公司從圖們江流域大麻哈魚生殖洄游群體經(jīng)人工繁殖所得。受精卵流水孵化，水溫8～10℃，發(fā)育至發(fā)眼期后經(jīng)干法運(yùn)輸至吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院繼續(xù)全程流水控溫孵化。

1.2 標(biāo)記圖譜

本研究按照摩斯密碼規(guī)則設(shè)計(jì)兩組標(biāo)記圖譜：CHN 和JL。摩斯密碼規(guī)定字母C 密碼為“嗒嘀嗒嘀”；H 為“嘀嘀嘀嘀”；N 為“嗒嘀”；J 為“嘀嗒嗒嗒”；L 為“嘀嗒嘀嘀”。嘀為1 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)，嗒為3 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)[18]。受大麻哈魚發(fā)育時(shí)長(zhǎng)限制，本研究將嗒設(shè)為2 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)，以縮短標(biāo)記天數(shù)。以24 h 為1 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)。以字母C 為例，嗒為2 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)即48 h 高溫，嗒嘀之間為字母內(nèi)間隔24 h 低溫，嘀為1 個(gè)單位時(shí)長(zhǎng)即24 h 高溫。因此，字母C 表示為48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H 模式。字母C 和字母H 之間為字母間間隔低溫24 h，即24C。

試驗(yàn)分4 組：1 組為恒溫組，全程（11±0.5）℃流水孵化；2 組為CHN 組，按照摩斯密碼規(guī)則，標(biāo)記圖譜為48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24 H-24C-24H-24C-24H-24C-24H-24C-48H-24C-2 4H；3 組為JL 組，按照摩斯密碼規(guī)則，標(biāo)記圖譜為24H-24C-48H-24C-48H-24C-48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24H；4 組為48 h 變溫組，標(biāo)記圖譜為48H-48C-48H-48C-48H-48C-48H。各組標(biāo)記模式圖見(jiàn)圖1。以高溫標(biāo)記字母，低溫標(biāo)記間隔的原則進(jìn)行。其中白色區(qū)域代表高溫區(qū)，間隔線代表低溫區(qū)。線條及白色區(qū)域的寬度代表持續(xù)時(shí)間。

圖1 耳石溫控標(biāo)記各試驗(yàn)組溫控方式模式圖Fig.1 Model diagram of temperature control mode in each test group

1.3 標(biāo)記試驗(yàn)

試驗(yàn)選取大麻哈魚發(fā)眼期受精卵干法運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，分為4 組，1 000 粒/組。1 組為恒溫對(duì)照組；2 組為CHN 標(biāo)記組；3 組為JL 標(biāo)記組；4 組為48 h 變溫組。在控溫在（11±0.5）℃的水族箱中暫養(yǎng)2 d 后，4 組均調(diào)溫至（8±0.5）℃，作為標(biāo)記圖譜起始標(biāo)記。24 h 后，4 組均調(diào)溫至（11±0.5）℃，按照各組標(biāo)記圖譜開(kāi)始溫控標(biāo)記試驗(yàn)。為減少受精卵受溫度變化影響，高低溫轉(zhuǎn)換需在1～2 h 內(nèi)溫和過(guò)渡。每天記錄受精卵死亡情況，挑出死卵。各組標(biāo)記結(jié)束后均轉(zhuǎn)換至（8±0.5）℃，持續(xù)24 h，作為標(biāo)記圖譜結(jié)束標(biāo)志。

1.4 標(biāo)記效果鑒定

各組標(biāo)記結(jié)束后，記錄各組死亡率，隨機(jī)取初孵仔魚樣品20 尾/組，置于95%乙醇中固定，鑒定標(biāo)記效果。

1.4.1 耳石摘取

從95%乙醇中取出初孵仔魚，剪下頭部置于載玻片中央，用蒸餾水清洗3 次后，滴加6.5%次氯酸鈉溶液至浸沒(méi)整個(gè)魚頭。在解剖鏡下觀察浸蝕效果，待整個(gè)魚頭組織僅剩眼部及周圍少量組織后，小心將剩余組織移除，解剖鏡下觀察，將剩余液體中的耳石小心移至載玻片干凈部位，蒸餾水清洗耳石3 次，每次用濾紙吸凈周圍液體。室溫晾干。

1.4.2 耳石制片

載玻片干燥后，在耳石旁邊滴加1 滴中性樹(shù)膠，然后在中性樹(shù)膠上滴加二甲苯，使中性樹(shù)膠擴(kuò)散至耳石區(qū)域，包埋住耳石而封片，室溫晾干后，Olympus BH-2 光學(xué)顯微鏡觀察耳石輪紋。

1.4.3 標(biāo)記圖譜分析

按照設(shè)定的標(biāo)記圖譜，人工調(diào)節(jié)水溫形成特殊的耳石標(biāo)記日輪。溫控試驗(yàn)前以24 h 低溫標(biāo)記輪作為標(biāo)記圖譜起始信號(hào)，標(biāo)記結(jié)束后以24 h 低溫標(biāo)記輪作為標(biāo)記圖譜結(jié)束信號(hào)。繪制標(biāo)記條形碼用于建立標(biāo)記檔案。以樣品中耳石出現(xiàn)標(biāo)記圖譜的仔魚數(shù)量占取樣總數(shù)的百分比計(jì)算標(biāo)記率。以標(biāo)記中死亡胚胎數(shù)量占起始樣品總數(shù)的百分比計(jì)算死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 耳石標(biāo)記圖譜鑒定

大麻哈魚耳石原基及中心核區(qū)形成于發(fā)眼期[19]，因此本研究在大麻哈魚發(fā)眼期后進(jìn)行耳石溫控標(biāo)記。根據(jù)國(guó)際通用摩斯密碼規(guī)則設(shè)計(jì)可辨識(shí)率高的標(biāo)記圖譜，按照各組標(biāo)記圖譜（圖1）實(shí)施溫控標(biāo)記。結(jié)果顯示，4 組耳石樣本標(biāo)記率達(dá)到100%。各組耳石中心核區(qū)均出現(xiàn)的第1 條暗帶，為大麻哈魚發(fā)眼卵由養(yǎng)殖場(chǎng)運(yùn)輸至控溫實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中形成的標(biāo)記輪。第2 條暗帶為控溫試驗(yàn)開(kāi)始前各組均調(diào)整水溫至（8±0.5）℃，形成的標(biāo)記圖譜起始標(biāo)記。之后各組輪紋均按照各組預(yù)先設(shè)計(jì)的標(biāo)記圖譜實(shí)施控溫標(biāo)記，各組標(biāo)記輪紋與設(shè)計(jì)圖譜一致。CHN 組和JL組標(biāo)記輪紋中，以白色區(qū)域代表標(biāo)記圖譜形成模式，白色區(qū)域的寬度代表持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短。暗色輪紋僅作為分隔（圖2）。

圖2 耳石溫控標(biāo)記圖譜Fig.2 Maps of otolith thermal marking

2.2 標(biāo)記率及死亡率

各組標(biāo)記結(jié)束后，記錄各組標(biāo)記率及死亡率（表1）。由表1 表可知，除恒溫對(duì)照組外，各組所采樣品均檢測(cè)到與預(yù)期相符標(biāo)記圖譜，標(biāo)記率100%。除CHN 組死亡率略高于恒溫對(duì)照組外，其他標(biāo)記組死亡率均低于恒溫組，各組差異不顯著（P＞0.05）。

表1 溫控標(biāo)記各組標(biāo)記率及死亡率情況表Tab.1 Marking rates and mortality in each group

3 討論

3.1 耳石標(biāo)記時(shí)間

魚類耳石第一日輪的形成存在種間差異，如底鳉（Fundulus heteroclitus）的第一日輪形成于剛孵出時(shí)[20]；鯡（Clupea harengus pallasi）第一日輪形成于卵黃囊完全吸收后[21]；歐洲鳀（Engraulis encrasicolus）第一日輪形成于孵出第2 d[22]，而大麻哈魚耳石第一日輪則形成于發(fā)眼期[19]。因此，本研究選擇在大麻哈魚受精卵進(jìn)入發(fā)眼期后開(kāi)始實(shí)施標(biāo)記。

3.2 耳石制片

魚類耳石通常有三種制片方式：剖片、壓片和磨片，其中，剖片和壓片適用于發(fā)眼期至破膜階段的胚胎期，磨片則適用于稚魚至成魚階段的大規(guī)格魚類。本研究在大麻哈魚發(fā)眼卵至破膜階段進(jìn)行溫控標(biāo)記，不需要用磨片。壓片方式未摘出耳石，而是用蓋玻片直接將整個(gè)胚體壓制成片，耳石外有組織覆蓋，鏡下觀測(cè)耳石輪紋清晰度不夠。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，最終選擇剖片方式進(jìn)行耳石制片。

剖片是在解剖鏡下利用解剖工具摘取耳石。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，破膜期魚體規(guī)格小，耳石僅有0.25 mm×0.35 mm[23]，解剖鏡下摘取耳石難度很大,且存在標(biāo)本不潔凈等問(wèn)題。本研究使用次氯酸鈉這種腐蝕性溶液，將耳石周圍組織腐蝕掉，使耳石的摘取變得容易，且耳石干凈，鏡下觀察耳石輪紋清晰，利于標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。

3.3 標(biāo)記效果

大麻哈魚耳石標(biāo)記圖譜主要用于區(qū)分放流大麻哈魚的不同屬地。要求標(biāo)記圖譜具有獨(dú)一無(wú)二及高度可辨識(shí)特征。本研究將國(guó)際通用摩斯密碼規(guī)則融入大麻哈魚耳石標(biāo)記圖譜的設(shè)定，主要因?yàn)槟λ姑艽a編碼簡(jiǎn)單清晰，二義性小，編碼主要是由兩個(gè)字符表示：“.”和“—”，一短一長(zhǎng)，通常也稱為“嘀”、“嗒”。通過(guò)不同的排列順序來(lái)表達(dá)不同的英文字母、數(shù)字和標(biāo)點(diǎn)符號(hào)。

本研究設(shè)立CHN 和JL 兩組字母組合作為標(biāo)記圖譜。大麻哈魚耳石標(biāo)記最佳標(biāo)記時(shí)間在發(fā)眼期至破膜期之間，受精卵破膜之后活動(dòng)范圍變大，攝食活動(dòng)等會(huì)不同程度地影響標(biāo)記圖譜，使標(biāo)記難度增加。因此，本研究將標(biāo)記天數(shù)控制在20 d 左右。同時(shí)考慮到標(biāo)記圖譜的清晰性，將短標(biāo)記“嘀”設(shè)為24 h，長(zhǎng)標(biāo)記“嗒”設(shè)為48 h，使長(zhǎng)標(biāo)記和短標(biāo)記區(qū)分更加明顯。CHN 組標(biāo)記整個(gè)標(biāo)記期用時(shí)22 d，JL 組標(biāo)記用時(shí)19 d。將摩斯密碼規(guī)則應(yīng)用于耳石標(biāo)記，保證了標(biāo)記的清晰性、準(zhǔn)確性及高度可辨識(shí)性。

為了驗(yàn)證耳石溫控標(biāo)記法是否影響大麻哈魚孵化率，本研究以恒溫對(duì)照組作為參照，標(biāo)記過(guò)程中每天記錄各組卵粒死亡情況。標(biāo)記結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組受精卵死亡情況。恒溫對(duì)照組標(biāo)記受精卵共死亡36 粒，死亡率3.6%，CHN 組死亡率稍高于對(duì)照組，共死亡38 粒，死亡率3.8%，JL 組和48 h 恒溫對(duì)照組死亡率均小于恒溫對(duì)照組，分別為3.0%和3.1%。組間差異不明顯?？梢?jiàn)，耳石溫控標(biāo)記法不會(huì)對(duì)大麻哈魚卵孵化率造成不良影響。同時(shí)，檢測(cè)CHN 組、JL 組和48 h 恒溫對(duì)照組所有采集樣本的耳石輪紋。結(jié)果顯示，除恒溫對(duì)照組外，其他三組所有采集的耳石樣本均出現(xiàn)與各組預(yù)設(shè)標(biāo)記圖譜相一致的清晰輪紋，各組標(biāo)記率均達(dá)100%。

3.4 耳石溫控標(biāo)記的應(yīng)用

耳石終生生長(zhǎng)，具有代謝惰性，一旦沉積，耳石材料不可能被重吸收或者改變。因此，可以從魚類耳石入手，利用魚類耳石能準(zhǔn)確記錄生活史中的經(jīng)歷事件，如溫度波動(dòng)、攝食及饑餓、光周期等特點(diǎn)，人為短期地對(duì)水溫進(jìn)行調(diào)控以改變耳石上的一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)輪紋的特征，形成終身可識(shí)別的標(biāo)記。再通過(guò)閱讀耳石輪紋生成的周期性、寬度及光密度等信息識(shí)別放流群體。本文僅僅通過(guò)人工調(diào)控溫度波動(dòng)就能對(duì)胚胎、仔魚耳石進(jìn)行有效地大規(guī)模標(biāo)記，方法簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可以滿足對(duì)大麻哈魚放流進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤評(píng)估的技術(shù)要求。