郝廣曙，周慶云，潘志鳳，魯平，趙潔

(甘肅省婦幼保健院病理科，甘肅 蘭州 730050)

肝纖維化是由各種致病因子所導(dǎo)致的肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理生理性過程[1-2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源于中胚層，具有多向分化和自我更新潛能的成體干細(xì)胞[3-5]，具有免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)及抗炎等作用[6-8]，廣泛存在于骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等組織和器官中。與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似生物學(xué)特性的人臍帶和胎盤絨毛來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs和 hPMSCs)具有豐富來源、獲取容易、低免疫原性、無倫理安全問題等優(yōu)點，應(yīng)用價值較高[9]。MSCs對肝纖維化和肝硬化動物模型具有有效的治療作用，孫慧聰?shù)萚10]研究報道，UC-MSCs和hPMSCs移植可減弱大鼠肝纖維化程度；高琳琳等[11]則指出，臍帶和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠改善大鼠肝硬化。本研究擬探討UC-MSCs和hPMSCs治療四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)誘發(fā)的肝纖維化鼠模型的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

UC-MSCs和hPMSCs均取自課題組已建立的細(xì)胞庫[12]，選取凍存的第二代細(xì)胞，快速復(fù)溫后傳代培養(yǎng)至細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建大鼠模型 6 周齡SPF(specific pathogen free,SPF)級健康雄性SD(Sprague Dawley,SD)大鼠，體重180 ～ 200 g，由具有標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件的浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)過程遵循GB/T 35892-2018實驗動物福利倫理審查指南[13]。將50% CCl4橄欖油溶液，按照5 mL/kg皮下注射，每周兩次，持續(xù)8周[1]。

1.2.2 實驗分組 48只大鼠隨機分為4組。正常組：造模時注射生理鹽水；UC-MSCs移植組：模型構(gòu)建完成后通過尾靜脈注射生理鹽水制備的3～6代UC-MSCs懸浮液1 mL，每只大鼠注射2.0×106個細(xì)胞；hPMSCs移植組：模型構(gòu)建完成后通過尾靜脈注射生理鹽水制備的3～6代hPMSCs懸浮液 1 mL，每只大鼠注射2.0×106個細(xì)胞；肝纖維化模型組：模型構(gòu)建完成后尾靜脈注射生理鹽水1 mL/只。每組各12只大鼠[1]。

1.2.3 肝功能檢測 移植細(xì)胞12周后處死大鼠，收集血清，取肝臟。用全自動生化分析儀(Abbott)檢測白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的濃度。

1.2.4 肝臟病理組織學(xué)檢測 大鼠肝臟組織，經(jīng)過4%中性緩沖甲醛固定過夜，按照常規(guī)病理組織處理流程處理，進(jìn)行蘇木精/伊紅染色(HE染色)、天狼星紅染色、馬松(MTC)染色，按照J(rèn)ain-Garcia評分系統(tǒng)，對大鼠肝臟纖維化程度進(jìn)行評分。

1.2.5 肝臟免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋的大鼠肝臟組織4～5 μm連續(xù)切片，脫蠟，利用鏈霉菌抗生物素蛋白- 過氧化物酶連結(jié)法(SP)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染。光學(xué)顯微觀察，免疫組化陽性表達(dá)部位呈現(xiàn)棕褐色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UC-MSCs和hPMSCs的培養(yǎng)

UC-MSCs貼壁生長呈良好的纖維細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代頻率3～4 d/次；hPMSCs貼壁生長，單層，纖維狀，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代頻率3～4 d/次。見圖1。

2.2 各組肝臟病理學(xué)特征比較

HE和MTC染色結(jié)果顯示，正常組大鼠的肝臟小葉結(jié)構(gòu)正常，界限清晰，結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠，正常肝小葉出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞，假小葉，且肝板排列呈紊亂狀態(tài)，纖維組織增生嚴(yán)重；UC-MSCs和hPMSCs移植組，肝臟組織的纖維增生具有明顯的改善。通過HE和MTC染色后依據(jù)Jain-Garcia評分系統(tǒng)進(jìn)行評分，UC-MSCs和hPMSCs移植組較對照組纖維化程度有所改善，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；UC-MSCs組與hPMSCs組的肝組織評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。天狼猩紅染色表明，正常組大鼠，肝小葉中央靜脈管壁呈現(xiàn)紅色纖維組織染色，少量的染色出現(xiàn)在小葉間隔及匯管區(qū)；而大量纖維組織沉積染色出現(xiàn)在模型組大鼠肝臟中，且包繞肝細(xì)胞形成假小葉，大鼠肝纖維化模型構(gòu)建較成功。UC-MSCs和hPMSCs移植組纖維組織的沉積量明顯少于肝纖維化模型組。見圖2及表1。

表1 UC-MSCs組與hPMSCs組的肝組織評分

2.3 各組肝臟功能比較

與肝纖維化模型組比較，UC-MSCs和hPMSCs移植組的肝功能指標(biāo)(ALB、ALT、ALP、AST)均改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，UC-MSCs和hPMSCs移植能夠提高肝功能；UC-MSCs和hPMSCs組大鼠的肝功能指標(biāo)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表2。

表2 移植后大鼠肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 各組免疫組織化學(xué)比較

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與肝纖維化模型組相比，UC-MSCs和hPMSCs移植組的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)水平降低，表明UC-MSCs和hPMSCs移植可抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活性和防止HSC分化。見圖3。

3 討論

肝硬化是由多種原因引起的肝臟慢性進(jìn)行性病變，其主要特點是肝臟結(jié)構(gòu)破壞，纖維狀隔膜圍繞再生或再生的實質(zhì)結(jié)節(jié)，肝纖維化是肝硬化發(fā)展的中間階段。目前，肝移植仍是臨床治療肝硬化的最有效方法，但礙于各種復(fù)雜因素，其臨床應(yīng)用受限[1-2]。近年來，隨著干細(xì)胞移植治療疾病的發(fā)展，干細(xì)胞移植治療肝病逐漸成為研究熱點，由于兼?zhèn)湟浦布?xì)胞來源豐富、低免疫原性且創(chuàng)傷性小等優(yōu)勢，有望于成為改善終末期肝病的一種有前途的替代方法，使肝病治療進(jìn)入一個劃時代再生治療階段[14]。Ryu等[4]指出，移植的MSC治療效果可通過抗纖維化機制和促進(jìn)肝細(xì)胞再生衡量，且其治療肝纖維化的療效較顯著 。MSC可能通過分泌保護細(xì)胞免受損傷的有機營養(yǎng)因子，或通過激活內(nèi)源性修復(fù)機制促進(jìn)纖維基質(zhì)降解，恢復(fù)受損肝臟[8,15]。本研究中， UC-MSCs和hPMSCs移植組纖維化程度的改善效應(yīng)均強于肝纖維化模型組，纖維組織的沉積量也減少。既往研究[16]采用Laennec fibrosis scoring system對肝纖維化進(jìn)行評分分類，但由于缺少確切的隔膜和結(jié)節(jié)大小，易誤診。本研究運用Jain-Garcia評分系統(tǒng)對肝硬化進(jìn)行了更加確切和詳細(xì)的分類，評分結(jié)果與H&E 、MTC和天狼星紅染色結(jié)果一致，均表明移植治療組能夠改善肝纖維化。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)降解不足和HSC活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素，激活的HSC可通過轉(zhuǎn)化為鼠心肌成纖維細(xì)胞(mouse cardiac fibroblasts，MFC)促進(jìn)ECM合成增多、降解減少或代償不足，誘發(fā)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，進(jìn)而引起肝纖維化[5,15]。α-SMA則是HSC激活標(biāo)志，肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展均與HSC過表達(dá)α-SMA密切相關(guān)[1,17]。TGF-β1具有調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和降解作用，不僅能夠激活HSC、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、抑制肝細(xì)胞增殖，促進(jìn)ECM生成，還能夠減少膠原酶和蛋白酶產(chǎn)生，增加組織抑制因子的生成，使ECM降解減少[1,18]。本研究顯示，移植治療組α-SMA和TGF-β1表達(dá)下調(diào)，表明UC-MSCs和hPMSCs的移植可抑制HSC活性并阻礙其分化。

綜上，UC-MSCs和hPMSCs移植組對大鼠肝臟纖維化程度的改善程度明顯優(yōu)于對照組，一定程度上恢復(fù)大鼠肝臟功能。