程琛，楊建，秦公照，具晟

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院婦科，江蘇 蘇州 215002；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，江蘇 蘇州 215001)

卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，病死率較高，以順鉑(cisplatin，DDP)為基礎(chǔ)的化療是目前臨床上常用的治療手段之一，但長(zhǎng)期使用DDP會(huì)引起耐藥問(wèn)題，尋找有效方法改善順鉑耐藥可有效改善治療效果[1]。高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)最初提取自海南三尖杉，用于治療白血病，改善白血病耐藥[2]。有研究[3-4]顯示，HHT對(duì)鼻咽癌、肝癌等腫瘤有抑制功效，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。ERK是MAPK家族中發(fā)現(xiàn)較早的成員，其包括ERK1、ERK2等異構(gòu)體，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個(gè)生理過(guò)程的調(diào)控[5]。文獻(xiàn)[6]表明，ERK1/2 信號(hào)在腫瘤中過(guò)度激活，抑制ERK1/2 信號(hào)可降低卵巢癌細(xì)胞增殖能力。HHT通過(guò)抑制ERK1/2 逆轉(zhuǎn)黑色素瘤耐藥[7]。目前尚未發(fā)現(xiàn)HHT對(duì)卵巢癌耐藥的作用和影響機(jī)制的相關(guān)研究。本研究旨在探討HHT調(diào)控ERK1/2 信號(hào)對(duì)卵巢癌細(xì)胞DDP耐藥的影響，為臨床改善卵巢癌DDP耐藥，明確HHT抗腫瘤機(jī)制提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細(xì)胞A2780(美國(guó)ATCC)；ERK1/2信號(hào)激活劑isoproterenol hydrochloride(ISO)(美國(guó)Sigma)；兔抗Bax一抗(武漢菲恩生物科技有限公司)；兔抗Bcl-2一抗(美國(guó)ABclonal)；兔抗ERK1/2一抗、兔抗p-ERK1/2一抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)；ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059(美國(guó)MedChemExpress)；HHT(規(guī)格：25 mg，純度：≥98.0%，成都普思生物科技股份有限公司)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO)；DDP(美國(guó)Sigma)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞A2780培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，采用DDP濃度梯度法培養(yǎng)DDP耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP，建立耐藥細(xì)胞株A2780/DPP[8]。在耐藥細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加2 nmol/L的DDP，用來(lái)維持細(xì)胞耐藥性，培養(yǎng)箱的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)為37 ℃，5% CO2。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP分為對(duì)照組、DDP組、HHT組、聯(lián)合組、ERK1/2抑制劑組、DDP+ERK1/2抑制劑組、ERK1/2激活劑組、聯(lián)合+ERK1/2激活劑組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)；DDP組細(xì)胞用80 μmol/L的DDP處理；HHT組細(xì)胞用2 μmol/L的HTT處理；聯(lián)合組細(xì)胞用80 μmol/L的DDP和2 μmol/L的HTT聯(lián)合處理；ERK1/2抑制劑組細(xì)胞用25 μmol/L[9]的ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059處理；DDP+ERK1/2抑制劑組細(xì)胞用80 μmol/L的DDP和25 μmol/L的ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059處理；ERK1/2激活劑組細(xì)胞用20 μmol/L[10]的ERK1/2信號(hào)激活劑ISO處理；聯(lián)合+ERK1/2激活劑組細(xì)胞用80 μmol/L的DDP、2 μmol/L的HTT、20 μmol/L的ERK1/2信號(hào)激活劑ISO處理。各組細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)0 h開(kāi)始處理，48 h后，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP種植到96孔板內(nèi)，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁以后，進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白組，即孔內(nèi)不添加細(xì)胞。48 h后，使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)÷(對(duì)照組OD-空白組OD)]×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP種植到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔中接種1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行細(xì)胞分組，48 h后，收集細(xì)胞(每個(gè)檢測(cè)樣本收集1×106個(gè)細(xì)胞)，2 000 g離心10 min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，用500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，在室溫條件下避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定。Annexin V-FITC激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，PI激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)615 nm。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP種植到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔中接種1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行細(xì)胞分組，48 h后，收集細(xì)胞，添加500 μL的細(xì)胞裂解液，放在冰上孵育60 min，4 ℃、12 000 g、離心10 min，吸取上清，經(jīng)過(guò)比辛酸(Bisoctanoic acid，BCA)方法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白與5×Loading Buffer混合煮沸5 min。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，在濃縮膠中利用80 V的電壓電泳，在分離膠中使用120 V的電壓電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h。將PVDF膜置于50 g/L的脫脂奶粉中，室溫結(jié)合1.5 h，然后放在一抗稀釋液(Bax、Bcl-2、ERK1/2一抗按照1∶1 000稀釋，p-ERK1/2一抗按照1∶600稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。再將PVDF膜放在二抗溶液(1∶4 000稀釋)中，室溫孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒分析目標(biāo)蛋白。以β-actin作為內(nèi)參，Image J掃描條帶的灰度，根據(jù)條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HHT和DDP聯(lián)合作用誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP凋亡

與對(duì)照組比較，DDP和HTT組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP存活率、凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；聯(lián)合組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP存活率降低；凋亡率明顯升高；促凋蛋白Bax表達(dá)增多；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 HHT和DDP聯(lián)合作用可抑制卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP中ERK1/2信號(hào)通路激活

與對(duì)照組比較，DDP組和HTT組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 抑制ERK1/2信號(hào)可改善卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥

與對(duì)照組比較，DDP組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP細(xì)胞存活率、凋亡率及p-ERK1/2/ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ERK1/2抑制劑組存活率降低；凋亡率增加；p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)減少；Bax蛋白表達(dá)增多；Bcl-2蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組、DDP組、ERK1/2抑制劑組比較，DDP+ERK1/2抑制劑組細(xì)胞存活率降低；凋亡率增加；p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)減少；Bax蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 激活ERK1/2信號(hào)對(duì)HTT影響卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

與對(duì)照組比較，聯(lián)合組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP細(xì)胞存活率降低，凋亡率增多，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ERK1/2激活劑組細(xì)胞存活率升高，凋亡率減少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與聯(lián)合組比較，聯(lián)合+ERK1/2激活劑組卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP細(xì)胞存活率升高，凋亡率減少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

化療是卵巢癌治療的常見(jiàn)手段，而卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生化療藥物耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者治愈率低的關(guān)鍵因素之一。DDP作為卵巢癌化療常見(jiàn)藥物，很多患者在治療初期對(duì)DDP敏感，但最終產(chǎn)生DDP耐藥，積極尋找有效方法改善卵巢癌DDP耐藥有重要意義[11]。HHT存在于三尖杉屬植物如三尖杉、海南粗榧中，臨床上多用于治療白血病[12]。有研究[13]顯示，HHT不僅對(duì)血液腫瘤有良好的抑制效果，還可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。HHT逆轉(zhuǎn)黑色素瘤細(xì)胞耐藥[7]。本研究顯示，單獨(dú)使用DDP或HHT對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP增殖影響不明顯(P>0.05)，聯(lián)合使用DDP和HHT可明顯下調(diào)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP增殖活性(P<0.05)，提示HHT可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥。

腫瘤細(xì)胞凋亡減少對(duì)腫瘤快速增長(zhǎng)具有重要意義，細(xì)胞凋亡涉及多個(gè)基因、信號(hào)通路、蛋白等的表達(dá)調(diào)控作用。其中Bcl-2蛋白家族成員較多，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分別在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮誘導(dǎo)和抑制功效，Bax屬于促凋亡蛋白而B(niǎo)cl-2屬于抗凋亡蛋白[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用DDP或HHT對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP凋亡影響不明顯(P>0.05)，DDP和HHT聯(lián)合作用后卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP凋亡率明顯提高(P<0.05)，且Bax蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，說(shuō)明HHT和DDP有協(xié)同促癌細(xì)胞凋亡的功效，進(jìn)一步證明了HHT有逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥的作用。MAPK是經(jīng)典的信號(hào)通路，包括ERK等亞家族，ERK激活后進(jìn)入細(xì)胞核，影響多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，其中ERK1/2研究較多[15]。ERK1/2在腫瘤中發(fā)揮多種作用，不僅與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等有關(guān)，還參與腫瘤耐藥過(guò)程，ERK1/2激活誘發(fā)腫瘤獲得性耐藥，導(dǎo)致細(xì)胞不可控生長(zhǎng)，促進(jìn)免疫逃逸，降低藥物敏感性[16]。文獻(xiàn)[17]證實(shí)，ERK1/2在腫瘤中過(guò)度磷酸化，可誘導(dǎo)卵巢癌生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，HHT和DDP聯(lián)合使用可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)減少，并且ERK1/2信號(hào)抑制劑可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥，增加細(xì)胞凋亡，HHT作用機(jī)制可能與ERK1/2信號(hào)有關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，ERK1/2信號(hào)激活劑逆轉(zhuǎn)HHT對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥作用，說(shuō)明HHT能夠通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥。

綜上，HHT對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780/DPP耐藥有改善作用，機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號(hào)有關(guān)，對(duì)卵巢癌DDP耐藥臨床治療有重要意義。