周文平，許暢，牛潔琪，熊云昭，何珍，徐賀朋，張孟娟，王洪雙，王香婷，許慶友，王箏△

（1河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，2河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，4河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091）

近年來，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率顯著增加，不同國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率為10%～15%［1］。在高收入國(guó)家，CKD影響多達(dá)6%的育齡婦女和3%的孕婦［2］。CKD與妊娠的關(guān)系是雙向的，妊娠期腎臟特殊的生理變化可能會(huì)導(dǎo)致潛在的腎功能障礙的進(jìn)展，同時(shí)腎臟疾病及其治療可能會(huì)影響妊娠結(jié)局［3］。延緩CKD進(jìn)展并改善孕產(chǎn)結(jié)局是目前亟待解決的難題。然而目前對(duì)CKD妊娠的研究大多側(cè)重于臨床結(jié)局回顧性研究［4-6］。而CKD妊娠不良妊娠結(jié)局的發(fā)病機(jī)制鮮有報(bào)道，具體的作用機(jī)制尚不明確，改善妊娠加重的慢性腎臟病的有效療法有限。因此我們關(guān)注妊娠加重慢性腎臟病的生理病理機(jī)制。

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種CKD發(fā)展為終末期腎病的常見途徑［7］。以往的研究證實(shí)醛固酮（aldosterone，ALD）受體阻斷劑可通過阻斷醛固酮活化，抑制細(xì)胞增殖，延緩單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）妊娠大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎臟RIF進(jìn)展［8-9］。同時(shí)有研究顯示依普利酮（eplerenone，EPL）通過抑制UUO大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎臟病理性血管新生，延緩腎臟纖維化的進(jìn)程［10］?；谇捌趯?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本研究以UUO合并妊娠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，以醛固酮活化-炎癥損傷-低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/Slit2/Robo1信號(hào)通路-血管新生-RIF為研究途徑，并給予EPL治療，初步探討腎臟血管新生在妊娠加重CKD中的作用及EPL對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雌性未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠60只，雄性Wistar大鼠20只，5～6周齡，體重160～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被飼養(yǎng)于（22±2）℃的溫度和12 h的光-暗循環(huán)的房間，自由獲得食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

EPL：由輝瑞制藥公司生產(chǎn)，ResearchDiets進(jìn)行飼料加工（根據(jù)大鼠的藥物用量100 mg·kg-1·d-1與進(jìn)食量1.25 g/kg按比例加入飼料中［11］）；抗鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）抗體（Proteintech）；抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體（Abcam）；抗CD34抗體（Novus）；抗CD105抗體（Abcam）；抗HIF-1α抗體（Immunoway）；抗Slit2抗體（Novus）；抗Robo1抗體（Bio-Techne）；抗GAPDH抗體（Servicebio）；ALD試劑盒，孕酮（progesterone）試劑盒和雌二醇（estradiol）試劑盒（Cayman Chemical）；免疫組化通用SP試劑盒（中杉金橋生物公司）。

3 動(dòng)物分組及模型制備

60只5～6周齡未經(jīng)產(chǎn)雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、假手術(shù)+妊娠組（pregnancy組）、模型（model）組和EPL組，共4組，每組15只。model組和EPL組大鼠采用UUO手術(shù)造成腎臟損傷［12］；sham組和pregnancy組大鼠僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。UUO術(shù)后次日，EPL組大鼠給予EPL（100 mg·kg-1·d-1）治療，其余3組自由飲食飲水，每天1次，連續(xù)給藥至妊娠第19天。UUO術(shù)后第8周在顯微鏡下觀察梗阻對(duì)側(cè)腎臟組織病理切片，若符合RIF病理改變（炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原成分沉積），說明UUO造模成功。UUO術(shù)后第9周開始，對(duì)pregnancy組、model組及EPL組大鼠進(jìn)行陰道涂片并監(jiān)測(cè)其動(dòng)情周期，將處于動(dòng)情前期或動(dòng)情期的雌鼠與雄鼠按1∶1比例合籠，并將觀察到陰道栓之日確定為妊娠的第1天。妊娠雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，腎損傷妊娠大鼠模型制備成功。妊娠第19天，對(duì)母鼠行安樂死手術(shù)，取母鼠股動(dòng)脈血清，摘取梗阻對(duì)側(cè)腎臟。采用ELISA法測(cè)定醛固酮、孕酮和雌二醇含量。一部分腎臟置于4%多聚甲醛中進(jìn)行病理、免疫組化和免疫熒光檢測(cè)，另一部分置于-80℃冰箱中以備進(jìn)行ELISA、RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。UUO造模以及后期有部分大鼠因手術(shù)、感染等原因死亡。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，pregnancy組見栓未孕2只，model組見栓未孕4只，因流產(chǎn)死亡1只，EPL組見栓未孕2只，死亡2只，model組成功造模10只，因此其他3組隨機(jī)取10只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 腎臟病理學(xué)腎臟標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，二甲苯脫蠟30 min（2次），梯度濃度乙醇進(jìn)行脫水，進(jìn)行HE染色、Masson染色和天狼星紅（Sirius red）染色。HE染色觀察腎組織病理變化，藍(lán)染的部位是細(xì)胞核；間質(zhì)纖維化區(qū)域采用Masson和Sirius red染色觀察膠原纖維，Masson染色膠原纖維染色為藍(lán)色，Sirius red染色膠原纖維為紅色。

4.2 ELISA檢測(cè)醛固酮、孕酮和雌二醇含量將股動(dòng)脈血清在4℃、3 000×g離心10 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清醛固酮、孕酮和雌二醇含量。將10%的腎臟組織勻漿在4℃、3 000×g離心10 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)腎臟組織醛固酮含量。

4.3 Western blot檢測(cè)HIF-1α、Slit2和Robo1的蛋白表達(dá)取腎組織100 mg加入含蛋白酶抑制劑的裂解液400 μL，勻漿取上清，檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)以20～50 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15～20 min，然后將膜與抗HIF-1α（1∶1 000）、Slit2（1∶1 000）和Robo1（1∶500）抗體，在4℃下孵育過夜，同時(shí)用GAPDH（1∶2 000）作為內(nèi)參照。第2天，將膜與熒光素偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶15 000）在室溫下孵育1 h，用Odyssey雙色紅外激光成像掃描儀（LICOR），相同的實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次，并用ImageJ 1.50的內(nèi)部加載控制進(jìn)行定量。

4.4 免疫組化檢測(cè)腎組織中MR、NF-κB、HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白表達(dá)采用SABC法檢測(cè)，切片，梯度脫水，抗原修復(fù)，加Ⅰ抗［MR（1∶100）、NF-κB（1∶100）、HIF-1α（1∶300）、Slit2（1∶100）和Robo1（1∶200）］，4℃孵育過夜；加入Ⅱ抗，PBS清洗，滴加SABC復(fù)合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。以鏡下出現(xiàn)棕黃色為陽性表達(dá)，用ImageJ軟件連續(xù)6個(gè)高功率場(chǎng)對(duì)每個(gè)腎的陽性細(xì)胞和染色面積進(jìn)行定量，以每視圖陽性區(qū)域百分比表示。

4.5 免疫熒光染色檢測(cè)血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34和CD105表達(dá)將石蠟切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水，加入含3%H2O2的去離子水，恒溫水浴箱內(nèi)孵育10 min；PBS洗凈后加入0.01 mol/L枸椽酸緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加10%山羊血清，室溫孵育1 h；傾倒多余的山羊血清，勿洗，加入Ⅰ抗（濃度均為1：100）4℃過夜；PBS清洗，加入Ⅱ抗（避光）37℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育1 h；滴加DAPI液（避光）室溫孵育10 min；滴加抗熒光衰減封片劑（避光）封片。激光共聚焦顯微鏡（Leica，SP8）觀測(cè)以上指標(biāo)的表達(dá)。

4.6 RT-qPCR檢測(cè)MR、NF-κB、CD34和CD105的表達(dá)使用RNA提取液（Servicebio）從全組織標(biāo)本中分離總RNA。以cDNA為模板，用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX，Servicebio）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用ABI 7500 FAST系統(tǒng)（Applied Biosystems）檢測(cè)MR、NF-κB、CD34、CD105和GAPDH的mRNA水平。用2-ΔΔCt法分析其相對(duì)表達(dá)水平。所有引物均由Servicebio提供，序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示連續(xù)變量。符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析及LSD法比較組間差異，不符合正態(tài)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，model組大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎小管擴(kuò)張明顯，尤其是遠(yuǎn)端小管，可見細(xì)胞水腫，脫落甚至壞死，小管間質(zhì)見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；EPL組大鼠腎臟病理損傷有所減輕。Masson和Sirius red染色結(jié)果顯示，與sham組和pregnancy組相比，model組大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎臟膠原沉積增加，EPL組膠原沉積較model組減輕。Masson染色定量分析結(jié)果顯示，model組膠原體積分?jǐn)?shù)顯著高于sham組和pregnancy組，EPL組膠原體積分?jǐn)?shù)顯著低于model組（P＜0.01）。見圖1。

Figure 1.The pathomorphological changes of the contralateral kidney of the rats in each group（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖1各組大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎臟病理形態(tài)變化

2 各組大鼠孕產(chǎn)情況

ELISA結(jié)果顯示，與sham組相比，妊娠各組大鼠血清孕酮和雌二醇含量升高（P＜0.05）；與pregnancy組相比，model組孕酮和雌二醇含量顯著降低（P＜0.01），EPL組孕酮和雌二醇含量較model組升高（P＜0.05），見圖2。大鼠孕產(chǎn)情況結(jié)果顯示，與pregnancy組相比，model組大鼠見栓懷孕率下降，畸胎死胎率升高，EPL組見栓懷孕率較model組升高，各組孕鼠平均產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異，見表2。

表2 各組大鼠孕產(chǎn)情況Table 2.Pregnancy-and parturition-related conditions in rats

3 醛固酮、MR和NF-κB的蛋白及mRNA檢測(cè)

ELISA結(jié)果顯示，與sham組相比，pregnancy組血清及腎組織醛固酮含量上升（P＜0.05），而model組兩者的含量較pregnancy組顯著升高（P＜0.01），EPL組的含量較model組顯著降低（P＜0.01），見圖2。RT-qPCR結(jié)果顯示，與sham組和pregnancy組相比，model組MR和NF-κB mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而EPL治療后可顯著下調(diào)其表達(dá)（P＜0.01），見圖2。免疫組化結(jié)果顯示，MR和NF-κB在sham組和pregnancy組僅有少量表達(dá)；而在model組表達(dá)顯著增多，主要表達(dá)于遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核中；與model組相比，EPL組兩者表達(dá)顯著減少（P＜0.01），見圖3。

4 HIF-1α/Slit2/Robo1信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α、Slit2和Robo1在model組表達(dá)明顯增多，HIF-1α主要表達(dá)于遠(yuǎn)端腎小管上皮的細(xì)胞核，Slit2和Robo1主要表達(dá)于遠(yuǎn)端擴(kuò)張腎小管上皮的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，而EPL可以下調(diào)其表達(dá)（P＜0.01），見圖4。

Western blot結(jié) 果顯示，sham組 及pregnancy組HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白低表達(dá)，model組三者表達(dá)上調(diào)，而EPL組較model組顯著降低（P＜0.01），見圖5。

5 血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，sham組和pregnancy組大鼠腎組織可見少量CD34和CD105陽性表達(dá)；model組二者表達(dá)增多，主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)，呈彌漫分布；EPL組二者表達(dá)有所減少，見圖6A。RTqPCR結(jié)果顯示，model組CD34和CD105表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而EPL可以顯著 下 調(diào) 其 表 達(dá)（P＜0.01），見圖6B。

討 論

Figure 2.Serum progesterone and estradiol levels，serum and renal tissue aldosterone levels，and the mRNA expression of MR and NF-κB in UUO pregnant rats.Mean±SD.n=10.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs pregnancy group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖2各組大鼠血清孕酮和雌二醇水平、血清和腎組織醛固酮水平及腎組織MR和NF-κB的mRNA表達(dá)

Figure 3.The expression of MR and NF-κB detected by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MR和NF-κB的表達(dá)

Figure 4.Immunohistochemical detection of HIF-1α，Slit2 and Robo1 protein expression in the contralateral kidneys of the rats in each group（scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖4免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎臟HIF-1α、Slit2和Robo1蛋白表達(dá)

Figure 5.Western blot detection of HIF-1α，Slit2 and Robo1 protein expression in contralateral renal tissue of UUO pregnant rats.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖5 Western blot檢測(cè)UUO妊娠大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎組織HIF-1α、Slit2和Robo1的蛋白表達(dá)

慢性腎臟病近年來患病率顯著增加，伴隨計(jì)劃生育政策的放開，慢性腎臟病患者妊娠率也在上升。CKD并非是妊娠絕對(duì)禁忌，但CKD患者屬于妊娠高危人群，其妊娠面臨著重大挑戰(zhàn)［13］。CKD患者的妊娠結(jié)局取決于腎臟損害的程度、是否存在高血壓、蛋白尿、感染和先兆子癇等［14］。CKD患者妊娠期的病理狀態(tài)主要表現(xiàn)為高灌注、高濾過和高凝狀態(tài)，這種病理狀態(tài)使原有腎臟疾病加重，嚴(yán)重威脅到孕婦和胎兒的生命安全［15-16］。CKD患者有生育需求且符合妊娠條件者，需在孕前、孕期及產(chǎn)后充分評(píng)估原發(fā)病及病情活動(dòng)指標(biāo)，腎功能，尿蛋白以及是否出現(xiàn)合并癥等?？梢姡焉锛又谻KD是腎內(nèi)科、婦產(chǎn)等領(lǐng)域共同的課題，學(xué)科交叉研究較少，目前大多聚焦于慢性腎臟病妊娠臨床結(jié)局，而對(duì)其生理病理機(jī)制報(bào)導(dǎo)較少。本研究則關(guān)注妊娠加重慢性腎臟病的可能發(fā)病機(jī)制，闡明腎臟血管新生在妊娠加重CKD中的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

已有的研究證實(shí)，妊娠加重CKD和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotension-aldosterone system，RAAS）密切聯(lián)系，尤其是RAAS下游的醛固酮［17］。妊娠期醛固酮水平受雌、孕激素影響較大。醛固酮介導(dǎo)的水鈉潴留和孕酮利尿排鈉的作用相互制約，保持水鈉平衡。但在妊娠晚期及病理狀態(tài)下，醛固酮的作用可能超過孕酮的作用，導(dǎo)致高血壓、水腫和蛋白尿等妊娠中毒癥狀的出現(xiàn)。醛固酮不僅對(duì)血流動(dòng)力學(xué)有調(diào)控作用，亦可引起炎癥損傷、氧化應(yīng)激和膠原沉積等多種病理反應(yīng)［18］。已有證據(jù)支持醛固酮可能作為生長(zhǎng)因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和細(xì)胞因子介導(dǎo)的胎盤和腎臟損傷的中介作用［19］。

Figure 6.The expression of CD34 and CD105 in the contralateral renal tissue of UUO pregnant rats detected by immunofluorescence staining（A；scale bar=250 μm）and RT-qPCR（B）.Mean±SD.n=10.△△P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs pregnancy group；##P＜0.01 vs model group.圖6免疫熒光法及RT-qPCR法檢測(cè)UUO妊娠大鼠梗阻對(duì)側(cè)腎組織CD34和CD105的表達(dá)

RIF是各種慢性腎臟病進(jìn)展為終末期腎功能衰竭的主要病理特征之一，主要表現(xiàn)為臟器萎縮、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和細(xì)胞增生［20］。由于UUO模型與臨床阻塞性疾病的病理過程相似，可在短時(shí)間內(nèi)引起RIF，而不會(huì)引起明顯的腎小球病變［21］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)UUO可激活RAAS系統(tǒng)，產(chǎn)生ROS和NF-κB，促進(jìn)大鼠RIF［22］。因此，認(rèn)為UUO為研究慢性腎臟病RIF的首選模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UUO術(shù)后8周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及大量膠原成分沉積，符合RIF的病理改變，在UUO術(shù)后9周雌雄大鼠1∶1合籠，復(fù)制腎損傷妊娠大鼠模型。HE、Masson和天狼星紅結(jié)果表明腎損傷妊娠大鼠模型可導(dǎo)致腎臟病理損傷和纖維化，而EPL可以減輕腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積，減輕RIF。

血管新生也稱為血管生成，是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖和遷移密切相關(guān)。腎臟正常的血管生成發(fā)生在胚胎發(fā)育和組織修復(fù)過程中，病理狀態(tài)下對(duì)腫瘤、眼科疾病等血管新生的機(jī)制研究較多。最新研究表明血管新生在慢性疾病進(jìn)展中還參與臟器纖維化的形成，如心臟病、腎臟病進(jìn)展中檢測(cè)到血管的異常新生［23］。新生的血管給炎癥細(xì)胞侵入病灶提供了新的通道，從而加重了炎癥反應(yīng)和局部組織過度修復(fù)，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖及膠原纖維大量沉積［24］。可見，大量炎癥因子分泌可導(dǎo)致異常的、不可控的病理性腎微血管的新生，造成纖維性修復(fù)，加劇RIF進(jìn)程。

血管新生的檢測(cè)采用血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，CD34和CD105均是常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光檢測(cè)CD34和CD105表達(dá)，結(jié)果顯示model組大鼠兩者表達(dá)顯著增多，主要位于腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，說明腎臟血管新生參與妊娠加重CKD腎臟損傷。

有研究表明CKD進(jìn)展中腎纖維化和炎癥損傷與低氧的關(guān)系密切［25］。醛固酮通過激活內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的鹽皮質(zhì)激素受體，增加氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥、加速血管僵硬、重塑和鈣化，改變血管生成，從而促進(jìn)血管疾病的發(fā)生［26］。醛固酮被激活后，可誘導(dǎo)NF-κB活化，進(jìn)而促進(jìn)多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子等多種物質(zhì)的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)和纖維化等病理過程［27］。由于腎血流量大，能量消耗大，對(duì)缺血缺氧比較敏感，HIF-1α表達(dá)增加。NF-κB是低氧時(shí)炎癥基因表達(dá)所必需的，且HIF-1α和NF-κB信號(hào)之間高度依賴［28］。HIF-1α和Slit2的轉(zhuǎn)錄因子SIM（single-minded）的組成均有一個(gè)bHLH單元和一個(gè)PAS單元組成，即CME單元，序列的相似性為HIF-1α啟動(dòng)Slit2的表達(dá)提供了依據(jù)［29］。Slit2通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞上Robo1受體數(shù)量和激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）來活化內(nèi)皮細(xì)胞，參與病理?xiàng)l件下的血管再生［30］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示model組大鼠醛固酮含量增多，MR、NF-κB、HIF-1α、Slit2和Robo1等表達(dá)上調(diào)，說明醛固酮與MR結(jié)合后，可誘導(dǎo)腎臟和炎癥損害和缺氧，進(jìn)一步通過HIF-1α/Slit2/Robo1信號(hào)通促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移而參與腎臟血管新生。

針對(duì)血管新生的機(jī)制，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制劑目前主要應(yīng)用于腫瘤和視網(wǎng)膜病變的治療，但有報(bào)道指出其在臨床上會(huì)出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及腎功能損傷等不良反應(yīng)［31］。因此，血管新生的治療藥物需要通過長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證，密切關(guān)注其不良影響及靶器官的損傷。根據(jù)妊娠加重CKD激活RAAS參與RIF的機(jī)制，阻斷RAAS可能是控制疾病的關(guān)鍵。然而有報(bào)道顯示，妊娠早期使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素受體阻斷劑類藥物是胎兒發(fā)生并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素，部分患者還出現(xiàn)“醛固酮逃逸”［32-33］?？紤]醛固酮在CKD妊娠進(jìn)展中的重要作用，MR阻斷劑的選擇尤為重要。相比較第一代藥物螺內(nèi)酯，第二代的EPL與性激素受體親和力較低，故可以有效地避免性激素的不良反應(yīng)［34］。故本實(shí)驗(yàn)將EPL選作治療藥物。本研究結(jié)果表明，EPL可以抑制醛固酮與MR的結(jié)合，減輕梗阻對(duì)側(cè)腎臟炎癥損傷及病理性血管新生，從而減RIF進(jìn)展和改善孕產(chǎn)結(jié)局，這些結(jié)果表明EPL在CKD妊娠中具有重要作用。