孫郁婷， 呂仁龍， 王燕茹， 袁秉琛， 程 誠， 周漢林， 楊虎彪*

（1.海南大學熱帶作物學院，海南?？?570228；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；3.海南大學林學院，海南儋州 571737；4.中國熱帶農業(yè)科學院試驗場，海南儋州 571737；5.中國熱帶農業(yè)科學院湛江實驗站，廣東湛江 5240134）

豬屎豆（Crotalaria pallida）為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬一年生草本植物，具有耐瘠、耐旱、粗生易長的特點，其植株生物量高，營養(yǎng)價值豐富，目前主要用于綠肥，植株所含有的生物堿可應用于抗癌等方面。研究發(fā)現(xiàn)，豬屎豆（野生品種）初花期粗蛋白質21.00%、粗纖維20.70%、粗脂肪2.30%、粗灰分7.00%、鈣1.36%、磷0.48%，營養(yǎng)參數(shù)具有作為飼用植物推廣應用的巨大潛能（鄒知明等，2008）。另一方面，豬屎豆中含有非營養(yǎng)物質野百合堿（Crotaline）（Verdoom等，1992），在動物利用方面存在一定風險，因此制約了飼用化發(fā)展。Duke等（1981）的研究發(fā)現(xiàn)，豬屎豆鮮葉中的生物堿在經過曬干后完全被降解，這暗示了合理的加工處理可能會有效分解豬屎豆中的毒性物質。

研究表明，不同豬屎豆資源含量的差異較大，且在整個生長周期內僅有少量增高。在眾多豬屎豆資源中，存在一些野百合堿含量極低或未檢出的品種，如光萼豬屎豆和三尖葉豬屎豆（張新蕊，2011）。Metha等（2021）試驗表明，在反芻動物飼糧中添加豬屎豆屬的菽麻青貯飼料可顯著提高干物質（DM）、有機物（OM）和粗蛋白質（CP）在瘤胃內的消化率，同時顯著提高瘤胃內丙酸產量。在前期工作中，研究團隊從300余份資源中帥選了12份未檢出野百合堿的豬屎豆樣本，這些資源具有作為飼用材料廣泛種植的潛力，本研究目的是針對篩選出的12份資源，進行集中栽培，評價其營養(yǎng)參數(shù)及在瘤胃內對干物質消化和瘤胃發(fā)酵的影響，探討其作為新型蛋白飼料的可行性。

1 材料與方法

1.1 栽培管理 供試材料由國家熱帶牧草種質資源中期（備份）庫提供。庫中保存300余份來自不同國家和地區(qū)的豬屎豆資源，委托武漢邁特維爾生物科技有限公司，經代謝物靶向檢測，篩選出未檢測到野百合堿和光萼野百合堿的12份資源作為本試驗對象，各資源采集地如表1所示。

表1 試驗材料

在農業(yè)科學院熱帶作物牧草基地（N19°31′22.63″，E109°34′36.00″）選定2塊試驗田，設定36個小區(qū)（5 m×6 m）。2021年9月4日將篩選出的12份材料種子經過挑選切種后用80℃熱水浸泡2 h，待種子吸漲后，播種至裝有育苗基質的育苗杯中。9月6日種子出苗，而后根據(jù)幼苗生長狀況進行補苗，待幼苗生長到10 cm高左右時，移栽至試驗田中（每個資源分別移栽至3個小區(qū)中），行距35～40 cm。植株生長期間，定時施肥4次（平均每30 d施肥一次，施肥量約為15 g復合肥/株）。自出苗日起，以各個小區(qū)為單位分別觀察各植株有20%開花時，進行刈割。將收割的樣品置于80℃烘箱烘干48 h，磨成粉樣，用于營養(yǎng)分析。本試驗期間天期情報來源于海南氣象信息服務網(wǎng)數(shù)據(jù)，如表2所示。本試驗所栽培的各資源根據(jù)不同植株從出苗到初花期所用天數(shù)分成3個小組（表3）進行試驗統(tǒng)計分析。

表2 2021年9～12月儋州市天氣概況

表3 不同品種豬屎豆生長天數(shù)分組及莖葉比

1.2 株高及莖葉比測定 刈割前，在每個小區(qū)內隨機取10株，測量其從地面到植株最高部位的絕對高度，取平均值為株高。刈割的植株將莖和葉部分離，分別放入80℃烘箱進行48 h烘干，測定干物質含量并計算莖葉比（干物質基礎）。

1.3 土壤采集與成分分析 在試驗田中隨機選擇10個點，分別取0～20 cm土樣和20～40 cm土樣，分別過40目篩，各土壤樣品參照《土壤農業(yè)化學常規(guī)分析方法》測定速效鉀、有效磷、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮有機質和全氮含量（表4）。

表4 試驗地土壤理化性質及營養(yǎng)成分

1.4 豬屎豆營養(yǎng)成分測定 將干燥粉樣參照Van Soest等（1991）的方法，分析中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、粗蛋白質、磷（P）、鉀（K）、粗纖維（CF）、粗脂肪（EE）及粗灰分（CA）含量。

1.5 體外培養(yǎng)試驗 體外培養(yǎng)方法參考呂仁龍等（2019）的試驗。選用4只平均體重15.5 kg的海南黑山羊，單獨飼養(yǎng)在代謝籠中。按照山羊營養(yǎng)能量維持標準進行飼喂，每日8：30和16：00分別飼喂（粗飼料與精飼料的比例為5：5，粗飼料部分選用新鮮的王草），自由飲水、礦鹽。早晨飼喂2 h后，分別抽取4只山羊的瘤胃液，保存于玻璃密封瓶中，39℃水浴條件下帶回實驗室。再通過四層紗布過濾，過濾后的瘤胃液等比例混合后再與緩沖液按1：2的比例混合（緩沖液在使用前應置于39℃水浴中，通入CO2去除溶液中的空氣）。在50 mL玻璃培養(yǎng)瓶中稱取培養(yǎng)樣品約0.3 g，再抽取30 mL培養(yǎng)液緩慢注入瓶中。通入CO2排凈瓶中的空氣使其處于厭氧狀態(tài)。密封后，將樣品置于39℃水浴搖床中連續(xù)培養(yǎng)6 h，振蕩頻率為50次/min。

1.5.1 干物質消化率 采用過濾法測定干物質消化率（NRC，2001）。用抽濾瓶和布氏漏斗將培養(yǎng)液和殘渣泵入濾紙上，將有殘渣的濾紙放入100℃烘箱烘干12 h，取出稱量。計算公式如下：

1.5.2 瘤胃發(fā)酵特性 培養(yǎng)結束后，用一個微量注射器從瓶口處注入100 μL福爾馬林溶液停止反應。用玻璃注射器測定培養(yǎng)瓶內氣體總量，使用雷磁PHS-3C精密pH計測定培養(yǎng)液的pH。培養(yǎng)液各揮發(fā)性脂肪酸（VFA）組成含量采用高效氣相色譜儀（GC，安捷倫，7890B）測定。GC設定條件為：色譜柱為HP-INNOWAX（19091N-133）毛細管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱溫為160℃，汽化室溫度為200℃，氮氣流速為30 mL/min，氫氣流速為60 mL/min，空氣流速為360 mL/min，進樣量為1 μL。利用苯酚次氯酸鈉比色法對揮發(fā)性氨態(tài)氮的含量進行分析，取1 mL培養(yǎng)液稀釋液，加入4 mL的0.2 mol/L鹽酸溶液，再加入苯酚和次氯酸鈉混勻后放入60℃水浴鍋中加熱，顯色10 min后冷卻，用波長設定為560 nm的分光光度計測定吸光度。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件（SAS，2004）進行統(tǒng)計分析，各品種豬屎豆營養(yǎng)成分和體外發(fā)酵特性等采用單因素方差進行分析，以P＜0.05作為差異顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 不同豬屎豆的生長周期 不同的豬屎豆品種在相同栽培條件下從出苗到初花期時間不同。其中T1、T3和T9材料的平均用時72 d。T4、T7、T8和T12樣品，平均用時87 d。T2、T5、T6、T10和T11樣品，平均用時97 d。莖葉比方面，各品種都表現(xiàn)出葉片部分干物質量顯著大于莖部。在12個品種中，T1莖葉比值最低，約為0.18。T6莖葉比值最高，約為0.59。在株高方面，第一組T1（78.3 cm），第二組的T4（89.8 cm）和T12（91.4 cm）和第三組的T2（89.4 cm）和T10（88.3 cm）在各分組中表現(xiàn)最高。

2.2 不同品種豬屎豆的營養(yǎng)成分變化 由表5可知，在第一組中（平均栽培期72 d），T1、T3和T9之間，除酸性洗滌纖維和磷含量以外，其他營養(yǎng)參數(shù)含量沒有顯著差異。T9的磷（0.18% DM）和酸性洗滌纖維（20.8% DM）含量，顯著高于其他兩個品種，其中，磷含量高約16%、酸性洗滌纖維高出約73 %（P＜0.05）。第二組中（平均栽培期87 d），T12的中性洗滌纖維含量約為42.9% DM，高出其他品種約16%（P＜0.05），粗蛋白質含量中，T4和T8表現(xiàn)最高，約為38.5% DM，顯著高于其他品種含量17%左右（P＜0.05），T4的酸性洗滌纖維（15.1% DM）和鉀（5.39% DM）含量分別顯著高于其他品種約19%和24%。第三組品種中（平均栽培期97 d），各品種的粗蛋白質和中性洗滌纖維含量沒有顯著差異。

表5 不同品種豬屎豆莖葉混合營養(yǎng)成分

2.3 體外培養(yǎng)后對不同品種豬屎豆干物質消化率和發(fā)酵參數(shù)的影響 由表6可知，12份經過培養(yǎng)后的豬屎豆資源，培養(yǎng)液發(fā)酵參數(shù)未見異常。在第一組中（平均栽培期72 d），T1和T3的干物質消化率約為36.4% DM，二者之間沒有顯著差異，但高于T9（31.5% DM）約16%左右（P＜0.05），各品種的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量沒有顯著差異，產氣量方面，T1和T3之間無顯著差異，平均為19.5 mL/g，略高于其他品種。T9（21.2%）的丙酸含量顯著低于T1（23.4%）和T3（23.3%）（P＜0.05）。在第二組中（平均栽培期86 d），T4和T12的干物質消化率無顯著差異，但高于T7和T8（P＜0.05）。T4的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量最高，約為0.60 mg/100 mL，顯著高于T7、T8和T12，且三者之間無顯著差異（P＞0.05）。揮發(fā)性脂肪酸方面，T4（67.2%）和T12（68.7%）的乙酸含量顯著高于其他兩個品種，而T12（20.8%）的丙酸含量顯著低于其他品種10%左右（P＜0.05）。第三組品種中（平均栽培期97 d），T5的干物質消化率最高，為37.5%。各資源的揮發(fā)性氨態(tài)氮濃度沒有表現(xiàn)出顯著差異。T11（69.1%）的乙酸含量在同組中最高（P＜0.05），顯著高于其他品種，丙酸（20.5%）含量相比其他品種含量顯著偏低約15%（P＜0.05）。

表6 不同品種豬屎豆莖葉混合體外培養(yǎng)產氣、pH及瘤胃發(fā)酵情況

3 討論

牧草的株高、莖葉比及營養(yǎng)成分等是判定生產性能的主要參數(shù)（謝金玉，2018）。不同品種和來源地影響植株的生長和營養(yǎng)特征（郝振帆，2021），氣溫、光照和降雨量也是影響植物生長性能的重要因素（Lv等，2021）。本試驗期間，11月開始以后的氣溫較低，這可能直接影響了植物株高，在秋冬季節(jié)栽培豬屎豆可能生產效率會大大降低，與此同時，11～12月的降雨量嚴重不足，這也直接導致作物生長緩慢。海南地區(qū)，柱花草作為常見豆科牧草在部分地區(qū)被種植，蔣亞君等（2017）測得柱花草的自然株高均值為55.9 cm，顯著低于豬屎豆（本試驗平均植株高度為81.2 cm）。另一方面，植物根系的發(fā)達程度直接影響?zhàn)B分的吸收與合成，截至目前，鮮見關于豬屎豆根系研究，明確根系生理和生長狀態(tài)，更便于篩選更為高效的品種進行推廣栽培（強勝等，2006）。牧草的莖葉比影響全株營養(yǎng)組成以及對反芻動物適口性和采食率（趙明坤，2006），研究對比了幾種常見牧草資源的莖葉比情況，其中，苜蓿草約為1.10（柴鳳久，2005）、紫色象草約為0.98（易顯鳳，2015）以及王草約為0.78（陳勇，2009），都遠遠大于豬屎豆（0.37）。植物的主要營養(yǎng)幾乎都集中在葉片部分（Konrad等，2001），豬屎豆繁茂的葉量更加凸顯了作為優(yōu)質牧草的巨大優(yōu)勢。

本試驗中，各資源的粗蛋白質含量都表現(xiàn)了豆科植物的優(yōu)越性，其含量均在30%以上，特別是T1、T4、T8，均超過38%。這也遠遠高于目前熱帶地區(qū)常見粗飼料資源，紫花苜蓿（17%～18%）（萬素梅，2004）、木薯莖（20.0%～36.4%）（Castellanos等，1994）、柱花草（14%～18%）（賴志強，2012）及王草（7%～9%）（譚文彪，2008）。研究表明，早期收割的牧草可以得到較高濃度的粗蛋白質含量（Lv等，2017），本試驗中，第一組（75 d）的粗蛋白質平均含量38.1%，第二組（87 d）為35.6%，第三組（97 d）為33.6%，呈現(xiàn)了相同的趨勢。

本試驗測得豬屎豆的中性洗滌纖維含量為35%～40%，酸性洗滌纖維的含量為13%～16%，符合1級牧草的中酸性洗滌纖維分級標準（陳谷，2010）。脂肪為動物提供了必需氨基酸（王定發(fā)，2016），本試驗各品種選材脂肪含量（6.0%～9.5%）也顯著高于木薯莖葉（4.17%～8.28%）（周璐麗，2016），因此對豬屎豆的脂肪酸組成進行評價，探究其作為粗飼料資源的潛在價值具有重要意義。

在體外發(fā)酵過程中，產氣總量反映了飼料的降解程度和微生物的活動狀況。產氣總量越高，可發(fā)酵營養(yǎng)物質含量越高（Sun等，2014）。本研究中，瘤胃液的發(fā)酵情況沒有發(fā)生異常。一般情況下，干物質消化率與產氣量呈正相關關系（陳艷琴，2011），在本研究中，很多品種并不完全呈現(xiàn)這樣的相關性，這可能是由于不同品種間的豬屎豆中的單寧含量存在差異，植物中的丹寧可以顯著抑制瘤胃產氣量（米見對，2011）。

植物葉片部分集中了更多的營養(yǎng)并且容易被反芻動物消化利用（陸景陵，2003），通過莖葉比和干物質消化率的數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，莖葉比比值較低的品種，基本呈現(xiàn)干物質消化率顯著偏高現(xiàn)象，如T1的莖葉比為0.18，其干物質消化率可達32.2%，而T6的莖葉比為0.59，其干物質消化率僅為25.5%，這表明了葉比莖更易消化，莖葉比越低，飼用價值可能越好（余成群，2010）。因此，在篩選品種過程中，可以通過莖葉比情況快速推定其飼用價值。

揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物的主要能量來源，其產量和比例顯著影響反芻動物飼糧中營養(yǎng)物質的吸收和利用（黃雅莉，2014）。本試驗中，所有豬屎豆品種的乙酸、丙酸含量均略高于李文娟等（2017）試驗中柚子皮的脂肪酸含量，說明飼喂豬屎豆時，反芻動物瘤胃微生物對有機物的發(fā)酵更為徹底。乙酸/丙酸的值與能量利用效率成線性關系（鄒彩霞，2011），本研究中乙酸/丙酸的值（2.93）略低于何香玉（2015）（苜蓿草，3.21），這反應了豬屎豆可以提供充足的能量來作為反芻動物飼料。氨態(tài)氮是評價瘤胃內環(huán)境的一個重要指標，過高或過低時都對微生物的生長繁殖不利（李文娟，2017），同時也可反映蛋白質的利用率，本試驗第一組中的T3和T9，第二組中的T4以及第三組中除T6的其他品種可能有著較高的蛋白質利用率。

作為一種新型飼料資源，有必要長期深入地評價其安全性能、營養(yǎng)變化、平均生物量等指標。豬屎豆作為豆科植物，其高蛋白的巨大特性應被充分挖掘利用，在未來研究中，還將對其蛋白質組成及在反芻動物體內代謝情況進行試驗，掌握豬屎豆資源作為動物日糧的最高效利用方法，最終應用于生產加工中。

4 結論

本研究結果表明，T1（云南玉元）、T3（廣西廉江）、T4（海南?？冢┖蚑5（海南瓊山）蛋白質含量和干物質消化率較高，品種優(yōu)勢較為明顯，具有作為優(yōu)質豬屎豆資源進一步評價的潛力和作為粗飼料資源的可行性。