孫郁婷， 呂仁龍， 王燕茹， 袁秉琛， 程 誠(chéng)， 周漢林， 楊虎彪*

（1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；3.海南大學(xué)林學(xué)院，海南儋州 571737；4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)，海南儋州 571737；5.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東湛江 5240134）

豬屎豆（Crotalaria pallida）為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬一年生草本植物，具有耐瘠、耐旱、粗生易長(zhǎng)的特點(diǎn)，其植株生物量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，目前主要用于綠肥，植株所含有的生物堿可應(yīng)用于抗癌等方面。研究發(fā)現(xiàn)，豬屎豆（野生品種）初花期粗蛋白質(zhì)21.00%、粗纖維20.70%、粗脂肪2.30%、粗灰分7.00%、鈣1.36%、磷0.48%，營(yíng)養(yǎng)參數(shù)具有作為飼用植物推廣應(yīng)用的巨大潛能（鄒知明等，2008）。另一方面，豬屎豆中含有非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)野百合堿（Crotaline）（Verdoom等，1992），在動(dòng)物利用方面存在一定風(fēng)險(xiǎn)，因此制約了飼用化發(fā)展。Duke等（1981）的研究發(fā)現(xiàn)，豬屎豆鮮葉中的生物堿在經(jīng)過(guò)曬干后完全被降解，這暗示了合理的加工處理可能會(huì)有效分解豬屎豆中的毒性物質(zhì)。

研究表明，不同豬屎豆資源含量的差異較大，且在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)僅有少量增高。在眾多豬屎豆資源中，存在一些野百合堿含量極低或未檢出的品種，如光萼豬屎豆和三尖葉豬屎豆（張新蕊，2011）。Metha等（2021）試驗(yàn)表明，在反芻動(dòng)物飼糧中添加豬屎豆屬的菽麻青貯飼料可顯著提高干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物（OM）和粗蛋白質(zhì)（CP）在瘤胃內(nèi)的消化率，同時(shí)顯著提高瘤胃內(nèi)丙酸產(chǎn)量。在前期工作中，研究團(tuán)隊(duì)從300余份資源中帥選了12份未檢出野百合堿的豬屎豆樣本，這些資源具有作為飼用材料廣泛種植的潛力，本研究目的是針對(duì)篩選出的12份資源，進(jìn)行集中栽培，評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)參數(shù)及在瘤胃內(nèi)對(duì)干物質(zhì)消化和瘤胃發(fā)酵的影響，探討其作為新型蛋白飼料的可行性。

1 材料與方法

1.1 栽培管理 供試材料由國(guó)家熱帶牧草種質(zhì)資源中期（備份）庫(kù)提供。庫(kù)中保存300余份來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的豬屎豆資源，委托武漢邁特維爾生物科技有限公司，經(jīng)代謝物靶向檢測(cè)，篩選出未檢測(cè)到野百合堿和光萼野百合堿的12份資源作為本試驗(yàn)對(duì)象，各資源采集地如表1所示。

表1 試驗(yàn)材料

在農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物牧草基地（N19°31′22.63″，E109°34′36.00″）選定2塊試驗(yàn)田，設(shè)定36個(gè)小區(qū)（5 m×6 m）。2021年9月4日將篩選出的12份材料種子經(jīng)過(guò)挑選切種后用80℃熱水浸泡2 h，待種子吸漲后，播種至裝有育苗基質(zhì)的育苗杯中。9月6日種子出苗，而后根據(jù)幼苗生長(zhǎng)狀況進(jìn)行補(bǔ)苗，待幼苗生長(zhǎng)到10 cm高左右時(shí)，移栽至試驗(yàn)田中（每個(gè)資源分別移栽至3個(gè)小區(qū)中），行距35～40 cm。植株生長(zhǎng)期間，定時(shí)施肥4次（平均每30 d施肥一次，施肥量約為15 g復(fù)合肥/株）。自出苗日起，以各個(gè)小區(qū)為單位分別觀察各植株有20%開(kāi)花時(shí)，進(jìn)行刈割。將收割的樣品置于80℃烘箱烘干48 h，磨成粉樣，用于營(yíng)養(yǎng)分析。本試驗(yàn)期間天期情報(bào)來(lái)源于海南氣象信息服務(wù)網(wǎng)數(shù)據(jù)，如表2所示。本試驗(yàn)所栽培的各資源根據(jù)不同植株從出苗到初花期所用天數(shù)分成3個(gè)小組（表3）進(jìn)行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

表2 2021年9～12月儋州市天氣概況

表3 不同品種豬屎豆生長(zhǎng)天數(shù)分組及莖葉比

1.2 株高及莖葉比測(cè)定 刈割前，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)取10株，測(cè)量其從地面到植株最高部位的絕對(duì)高度，取平均值為株高。刈割的植株將莖和葉部分離，分別放入80℃烘箱進(jìn)行48 h烘干，測(cè)定干物質(zhì)含量并計(jì)算莖葉比（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。

1.3 土壤采集與成分分析 在試驗(yàn)田中隨機(jī)選擇10個(gè)點(diǎn)，分別取0～20 cm土樣和20～40 cm土樣，分別過(guò)40目篩，各土壤樣品參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)常規(guī)分析方法》測(cè)定速效鉀、有效磷、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮有機(jī)質(zhì)和全氮含量（表4）。

表4 試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分

1.4 豬屎豆?fàn)I養(yǎng)成分測(cè)定 將干燥粉樣參照Van Soest等（1991）的方法，分析中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、粗蛋白質(zhì)、磷（P）、鉀（K）、粗纖維（CF）、粗脂肪（EE）及粗灰分（CA）含量。

1.5 體外培養(yǎng)試驗(yàn) 體外培養(yǎng)方法參考呂仁龍等（2019）的試驗(yàn)。選用4只平均體重15.5 kg的海南黑山羊，單獨(dú)飼養(yǎng)在代謝籠中。按照山羊營(yíng)養(yǎng)能量維持標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼喂，每日8：30和16：00分別飼喂（粗飼料與精飼料的比例為5：5，粗飼料部分選用新鮮的王草），自由飲水、礦鹽。早晨飼喂2 h后，分別抽取4只山羊的瘤胃液，保存于玻璃密封瓶中，39℃水浴條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。再通過(guò)四層紗布過(guò)濾，過(guò)濾后的瘤胃液等比例混合后再與緩沖液按1：2的比例混合（緩沖液在使用前應(yīng)置于39℃水浴中，通入CO2去除溶液中的空氣）。在50 mL玻璃培養(yǎng)瓶中稱取培養(yǎng)樣品約0.3 g，再抽取30 mL培養(yǎng)液緩慢注入瓶中。通入CO2排凈瓶中的空氣使其處于厭氧狀態(tài)。密封后，將樣品置于39℃水浴搖床中連續(xù)培養(yǎng)6 h，振蕩頻率為50次/min。

1.5.1 干物質(zhì)消化率 采用過(guò)濾法測(cè)定干物質(zhì)消化率（NRC，2001）。用抽濾瓶和布氏漏斗將培養(yǎng)液和殘?jiān)萌霝V紙上，將有殘?jiān)臑V紙放入100℃烘箱烘干12 h，取出稱量。計(jì)算公式如下：

1.5.2 瘤胃發(fā)酵特性 培養(yǎng)結(jié)束后，用一個(gè)微量注射器從瓶口處注入100 μL福爾馬林溶液停止反應(yīng)。用玻璃注射器測(cè)定培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體總量，使用雷磁PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH。培養(yǎng)液各揮發(fā)性脂肪酸（VFA）組成含量采用高效氣相色譜儀（GC，安捷倫，7890B）測(cè)定。GC設(shè)定條件為：色譜柱為HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱溫為160℃，汽化室溫度為200℃，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，氫氣流速為60 mL/min，空氣流速為360 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。利用苯酚次氯酸鈉比色法對(duì)揮發(fā)性氨態(tài)氮的含量進(jìn)行分析，取1 mL培養(yǎng)液稀釋液，加入4 mL的0.2 mol/L鹽酸溶液，再加入苯酚和次氯酸鈉混勻后放入60℃水浴鍋中加熱，顯色10 min后冷卻，用波長(zhǎng)設(shè)定為560 nm的分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件（SAS，2004）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各品種豬屎豆?fàn)I養(yǎng)成分和體外發(fā)酵特性等采用單因素方差進(jìn)行分析，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬屎豆的生長(zhǎng)周期 不同的豬屎豆品種在相同栽培條件下從出苗到初花期時(shí)間不同。其中T1、T3和T9材料的平均用時(shí)72 d。T4、T7、T8和T12樣品，平均用時(shí)87 d。T2、T5、T6、T10和T11樣品，平均用時(shí)97 d。莖葉比方面，各品種都表現(xiàn)出葉片部分干物質(zhì)量顯著大于莖部。在12個(gè)品種中，T1莖葉比值最低，約為0.18。T6莖葉比值最高，約為0.59。在株高方面，第一組T1（78.3 cm），第二組的T4（89.8 cm）和T12（91.4 cm）和第三組的T2（89.4 cm）和T10（88.3 cm）在各分組中表現(xiàn)最高。

2.2 不同品種豬屎豆的營(yíng)養(yǎng)成分變化 由表5可知，在第一組中（平均栽培期72 d），T1、T3和T9之間，除酸性洗滌纖維和磷含量以外，其他營(yíng)養(yǎng)參數(shù)含量沒(méi)有顯著差異。T9的磷（0.18% DM）和酸性洗滌纖維（20.8% DM）含量，顯著高于其他兩個(gè)品種，其中，磷含量高約16%、酸性洗滌纖維高出約73 %（P＜0.05）。第二組中（平均栽培期87 d），T12的中性洗滌纖維含量約為42.9% DM，高出其他品種約16%（P＜0.05），粗蛋白質(zhì)含量中，T4和T8表現(xiàn)最高，約為38.5% DM，顯著高于其他品種含量17%左右（P＜0.05），T4的酸性洗滌纖維（15.1% DM）和鉀（5.39% DM）含量分別顯著高于其他品種約19%和24%。第三組品種中（平均栽培期97 d），各品種的粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維含量沒(méi)有顯著差異。

表5 不同品種豬屎豆莖葉混合營(yíng)養(yǎng)成分

2.3 體外培養(yǎng)后對(duì)不同品種豬屎豆干物質(zhì)消化率和發(fā)酵參數(shù)的影響 由表6可知，12份經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的豬屎豆資源，培養(yǎng)液發(fā)酵參數(shù)未見(jiàn)異常。在第一組中（平均栽培期72 d），T1和T3的干物質(zhì)消化率約為36.4% DM，二者之間沒(méi)有顯著差異，但高于T9（31.5% DM）約16%左右（P＜0.05），各品種的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量沒(méi)有顯著差異，產(chǎn)氣量方面，T1和T3之間無(wú)顯著差異，平均為19.5 mL/g，略高于其他品種。T9（21.2%）的丙酸含量顯著低于T1（23.4%）和T3（23.3%）（P＜0.05）。在第二組中（平均栽培期86 d），T4和T12的干物質(zhì)消化率無(wú)顯著差異，但高于T7和T8（P＜0.05）。T4的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量最高，約為0.60 mg/100 mL，顯著高于T7、T8和T12，且三者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。揮發(fā)性脂肪酸方面，T4（67.2%）和T12（68.7%）的乙酸含量顯著高于其他兩個(gè)品種，而T12（20.8%）的丙酸含量顯著低于其他品種10%左右（P＜0.05）。第三組品種中（平均栽培期97 d），T5的干物質(zhì)消化率最高，為37.5%。各資源的揮發(fā)性氨態(tài)氮濃度沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異。T11（69.1%）的乙酸含量在同組中最高（P＜0.05），顯著高于其他品種，丙酸（20.5%）含量相比其他品種含量顯著偏低約15%（P＜0.05）。

表6 不同品種豬屎豆莖葉混合體外培養(yǎng)產(chǎn)氣、pH及瘤胃發(fā)酵情況

3 討論

牧草的株高、莖葉比及營(yíng)養(yǎng)成分等是判定生產(chǎn)性能的主要參數(shù)（謝金玉，2018）。不同品種和來(lái)源地影響植株的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)特征（郝振帆，2021），氣溫、光照和降雨量也是影響植物生長(zhǎng)性能的重要因素（Lv等，2021）。本試驗(yàn)期間，11月開(kāi)始以后的氣溫較低，這可能直接影響了植物株高，在秋冬季節(jié)栽培豬屎豆可能生產(chǎn)效率會(huì)大大降低，與此同時(shí)，11～12月的降雨量嚴(yán)重不足，這也直接導(dǎo)致作物生長(zhǎng)緩慢。海南地區(qū)，柱花草作為常見(jiàn)豆科牧草在部分地區(qū)被種植，蔣亞君等（2017）測(cè)得柱花草的自然株高均值為55.9 cm，顯著低于豬屎豆（本試驗(yàn)平均植株高度為81.2 cm）。另一方面，植物根系的發(fā)達(dá)程度直接影響?zhàn)B分的吸收與合成，截至目前，鮮見(jiàn)關(guān)于豬屎豆根系研究，明確根系生理和生長(zhǎng)狀態(tài)，更便于篩選更為高效的品種進(jìn)行推廣栽培（強(qiáng)勝等，2006）。牧草的莖葉比影響全株?duì)I養(yǎng)組成以及對(duì)反芻動(dòng)物適口性和采食率（趙明坤，2006），研究對(duì)比了幾種常見(jiàn)牧草資源的莖葉比情況，其中，苜蓿草約為1.10（柴鳳久，2005）、紫色象草約為0.98（易顯鳳，2015）以及王草約為0.78（陳勇，2009），都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于豬屎豆（0.37）。植物的主要營(yíng)養(yǎng)幾乎都集中在葉片部分（Konrad等，2001），豬屎豆繁茂的葉量更加凸顯了作為優(yōu)質(zhì)牧草的巨大優(yōu)勢(shì)。

本試驗(yàn)中，各資源的粗蛋白質(zhì)含量都表現(xiàn)了豆科植物的優(yōu)越性，其含量均在30%以上，特別是T1、T4、T8，均超過(guò)38%。這也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前熱帶地區(qū)常見(jiàn)粗飼料資源，紫花苜蓿（17%～18%）（萬(wàn)素梅，2004）、木薯莖（20.0%～36.4%）（Castellanos等，1994）、柱花草（14%～18%）（賴志強(qiáng)，2012）及王草（7%～9%）（譚文彪，2008）。研究表明，早期收割的牧草可以得到較高濃度的粗蛋白質(zhì)含量（Lv等，2017），本試驗(yàn)中，第一組（75 d）的粗蛋白質(zhì)平均含量38.1%，第二組（87 d）為35.6%，第三組（97 d）為33.6%，呈現(xiàn)了相同的趨勢(shì)。

本試驗(yàn)測(cè)得豬屎豆的中性洗滌纖維含量為35%～40%，酸性洗滌纖維的含量為13%～16%，符合1級(jí)牧草的中酸性洗滌纖維分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（陳谷，2010）。脂肪為動(dòng)物提供了必需氨基酸（王定發(fā)，2016），本試驗(yàn)各品種選材脂肪含量（6.0%～9.5%）也顯著高于木薯莖葉（4.17%～8.28%）（周璐麗，2016），因此對(duì)豬屎豆的脂肪酸組成進(jìn)行評(píng)價(jià)，探究其作為粗飼料資源的潛在價(jià)值具有重要意義。

在體外發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)氣總量反映了飼料的降解程度和微生物的活動(dòng)狀況。產(chǎn)氣總量越高，可發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量越高（Sun等，2014）。本研究中，瘤胃液的發(fā)酵情況沒(méi)有發(fā)生異常。一般情況下，干物質(zhì)消化率與產(chǎn)氣量呈正相關(guān)關(guān)系（陳艷琴，2011），在本研究中，很多品種并不完全呈現(xiàn)這樣的相關(guān)性，這可能是由于不同品種間的豬屎豆中的單寧含量存在差異，植物中的丹寧可以顯著抑制瘤胃產(chǎn)氣量（米見(jiàn)對(duì)，2011）。

植物葉片部分集中了更多的營(yíng)養(yǎng)并且容易被反芻動(dòng)物消化利用（陸景陵，2003），通過(guò)莖葉比和干物質(zhì)消化率的數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，莖葉比比值較低的品種，基本呈現(xiàn)干物質(zhì)消化率顯著偏高現(xiàn)象，如T1的莖葉比為0.18，其干物質(zhì)消化率可達(dá)32.2%，而T6的莖葉比為0.59，其干物質(zhì)消化率僅為25.5%，這表明了葉比莖更易消化，莖葉比越低，飼用價(jià)值可能越好（余成群，2010）。因此，在篩選品種過(guò)程中，可以通過(guò)莖葉比情況快速推定其飼用價(jià)值。

揮發(fā)性脂肪酸是反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源，其產(chǎn)量和比例顯著影響反芻動(dòng)物飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用（黃雅莉，2014）。本試驗(yàn)中，所有豬屎豆品種的乙酸、丙酸含量均略高于李文娟等（2017）試驗(yàn)中柚子皮的脂肪酸含量，說(shuō)明飼喂豬屎豆時(shí)，反芻動(dòng)物瘤胃微生物對(duì)有機(jī)物的發(fā)酵更為徹底。乙酸/丙酸的值與能量利用效率成線性關(guān)系（鄒彩霞，2011），本研究中乙酸/丙酸的值（2.93）略低于何香玉（2015）（苜蓿草，3.21），這反應(yīng)了豬屎豆可以提供充足的能量來(lái)作為反芻動(dòng)物飼料。氨態(tài)氮是評(píng)價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的一個(gè)重要指標(biāo)，過(guò)高或過(guò)低時(shí)都對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖不利（李文娟，2017），同時(shí)也可反映蛋白質(zhì)的利用率，本試驗(yàn)第一組中的T3和T9，第二組中的T4以及第三組中除T6的其他品種可能有著較高的蛋白質(zhì)利用率。

作為一種新型飼料資源，有必要長(zhǎng)期深入地評(píng)價(jià)其安全性能、營(yíng)養(yǎng)變化、平均生物量等指標(biāo)。豬屎豆作為豆科植物，其高蛋白的巨大特性應(yīng)被充分挖掘利用，在未來(lái)研究中，還將對(duì)其蛋白質(zhì)組成及在反芻動(dòng)物體內(nèi)代謝情況進(jìn)行試驗(yàn)，掌握豬屎豆資源作為動(dòng)物日糧的最高效利用方法，最終應(yīng)用于生產(chǎn)加工中。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，T1（云南玉元）、T3（廣西廉江）、T4（海南?？冢┖蚑5（海南瓊山）蛋白質(zhì)含量和干物質(zhì)消化率較高，品種優(yōu)勢(shì)較為明顯，具有作為優(yōu)質(zhì)豬屎豆資源進(jìn)一步評(píng)價(jià)的潛力和作為粗飼料資源的可行性。