孫郁婷, 呂仁龍, 王燕茹, 袁秉琛, 程 誠, 周漢林, 楊虎彪*
(1.海南大學熱帶作物學院,海南???570228;2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所,海南???571101;3.海南大學林學院,海南儋州 571737;4.中國熱帶農業(yè)科學院試驗場,海南儋州 571737;5.中國熱帶農業(yè)科學院湛江實驗站,廣東湛江 5240134)
豬屎豆(Crotalaria pallida)為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬一年生草本植物,具有耐瘠、耐旱、粗生易長的特點,其植株生物量高,營養(yǎng)價值豐富,目前主要用于綠肥,植株所含有的生物堿可應用于抗癌等方面。研究發(fā)現(xiàn),豬屎豆(野生品種)初花期粗蛋白質21.00%、粗纖維20.70%、粗脂肪2.30%、粗灰分7.00%、鈣1.36%、磷0.48%,營養(yǎng)參數(shù)具有作為飼用植物推廣應用的巨大潛能(鄒知明等,2008)。另一方面,豬屎豆中含有非營養(yǎng)物質野百合堿(Crotaline)(Verdoom等,1992),在動物利用方面存在一定風險,因此制約了飼用化發(fā)展。Duke等(1981)的研究發(fā)現(xiàn),豬屎豆鮮葉中的生物堿在經過曬干后完全被降解,這暗示了合理的加工處理可能會有效分解豬屎豆中的毒性物質。
研究表明,不同豬屎豆資源含量的差異較大,且在整個生長周期內僅有少量增高。在眾多豬屎豆資源中,存在一些野百合堿含量極低或未檢出的品種,如光萼豬屎豆和三尖葉豬屎豆(張新蕊,2011)。Metha等(2021)試驗表明,在反芻動物飼糧中添加豬屎豆屬的菽麻青貯飼料可顯著提高干物質(DM)、有機物(OM)和粗蛋白質(CP)在瘤胃內的消化率,同時顯著提高瘤胃內丙酸產量。在前期工作中,研究團隊從300余份資源中帥選了12份未檢出野百合堿的豬屎豆樣本,這些資源具有作為飼用材料廣泛種植的潛力,本研究目的是針對篩選出的12份資源,進行集中栽培,評價其營養(yǎng)參數(shù)及在瘤胃內對干物質消化和瘤胃發(fā)酵的影響,探討其作為新型蛋白飼料的可行性。
1.1 栽培管理 供試材料由國家熱帶牧草種質資源中期(備份)庫提供。庫中保存300余份來自不同國家和地區(qū)的豬屎豆資源,委托武漢邁特維爾生物科技有限公司,經代謝物靶向檢測,篩選出未檢測到野百合堿和光萼野百合堿的12份資源作為本試驗對象,各資源采集地如表1所示。
表1 試驗材料
在農業(yè)科學院熱帶作物牧草基地(N19°31′22.63″,E109°34′36.00″)選定2塊試驗田,設定36個小區(qū)(5 m×6 m)。2021年9月4日將篩選出的12份材料種子經過挑選切種后用80℃熱水浸泡2 h,待種子吸漲后,播種至裝有育苗基質的育苗杯中。9月6日種子出苗,而后根據(jù)幼苗生長狀況進行補苗,待幼苗生長到10 cm高左右時,移栽至試驗田中(每個資源分別移栽至3個小區(qū)中),行距35~40 cm。植株生長期間,定時施肥4次(平均每30 d施肥一次,施肥量約為15 g復合肥/株)。自出苗日起,以各個小區(qū)為單位分別觀察各植株有20%開花時,進行刈割。將收割的樣品置于80℃烘箱烘干48 h,磨成粉樣,用于營養(yǎng)分析。本試驗期間天期情報來源于海南氣象信息服務網(wǎng)數(shù)據(jù),如表2所示。本試驗所栽培的各資源根據(jù)不同植株從出苗到初花期所用天數(shù)分成3個小組(表3)進行試驗統(tǒng)計分析。
表2 2021年9~12月儋州市天氣概況
表3 不同品種豬屎豆生長天數(shù)分組及莖葉比
1.2 株高及莖葉比測定 刈割前,在每個小區(qū)內隨機取10株,測量其從地面到植株最高部位的絕對高度,取平均值為株高。刈割的植株將莖和葉部分離,分別放入80℃烘箱進行48 h烘干,測定干物質含量并計算莖葉比(干物質基礎)。
1.3 土壤采集與成分分析 在試驗田中隨機選擇10個點,分別取0~20 cm土樣和20~40 cm土樣,分別過40目篩,各土壤樣品參照《土壤農業(yè)化學常規(guī)分析方法》測定速效鉀、有效磷、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮有機質和全氮含量(表4)。
表4 試驗地土壤理化性質及營養(yǎng)成分
1.4 豬屎豆營養(yǎng)成分測定 將干燥粉樣參照Van Soest等(1991)的方法,分析中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗蛋白質、磷(P)、鉀(K)、粗纖維(CF)、粗脂肪(EE)及粗灰分(CA)含量。
1.5 體外培養(yǎng)試驗 體外培養(yǎng)方法參考呂仁龍等(2019)的試驗。選用4只平均體重15.5 kg的海南黑山羊,單獨飼養(yǎng)在代謝籠中。按照山羊營養(yǎng)能量維持標準進行飼喂,每日8:30和16:00分別飼喂(粗飼料與精飼料的比例為5:5,粗飼料部分選用新鮮的王草),自由飲水、礦鹽。早晨飼喂2 h后,分別抽取4只山羊的瘤胃液,保存于玻璃密封瓶中,39℃水浴條件下帶回實驗室。再通過四層紗布過濾,過濾后的瘤胃液等比例混合后再與緩沖液按1:2的比例混合(緩沖液在使用前應置于39℃水浴中,通入CO2去除溶液中的空氣)。在50 mL玻璃培養(yǎng)瓶中稱取培養(yǎng)樣品約0.3 g,再抽取30 mL培養(yǎng)液緩慢注入瓶中。通入CO2排凈瓶中的空氣使其處于厭氧狀態(tài)。密封后,將樣品置于39℃水浴搖床中連續(xù)培養(yǎng)6 h,振蕩頻率為50次/min。
1.5.1 干物質消化率 采用過濾法測定干物質消化率(NRC,2001)。用抽濾瓶和布氏漏斗將培養(yǎng)液和殘渣泵入濾紙上,將有殘渣的濾紙放入100℃烘箱烘干12 h,取出稱量。計算公式如下:
1.5.2 瘤胃發(fā)酵特性 培養(yǎng)結束后,用一個微量注射器從瓶口處注入100 μL福爾馬林溶液停止反應。用玻璃注射器測定培養(yǎng)瓶內氣體總量,使用雷磁PHS-3C精密pH計測定培養(yǎng)液的pH。培養(yǎng)液各揮發(fā)性脂肪酸(VFA)組成含量采用高效氣相色譜儀(GC,安捷倫,7890B)測定。GC設定條件為:色譜柱為HP-INNOWAX(19091N-133)毛細管柱,30 m×0.25 mm×0.25 μm;柱溫為160℃,汽化室溫度為200℃,氮氣流速為30 mL/min,氫氣流速為60 mL/min,空氣流速為360 mL/min,進樣量為1 μL。利用苯酚次氯酸鈉比色法對揮發(fā)性氨態(tài)氮的含量進行分析,取1 mL培養(yǎng)液稀釋液,加入4 mL的0.2 mol/L鹽酸溶液,再加入苯酚和次氯酸鈉混勻后放入60℃水浴鍋中加熱,顯色10 min后冷卻,用波長設定為560 nm的分光光度計測定吸光度。
1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件(SAS,2004)進行統(tǒng)計分析,各品種豬屎豆營養(yǎng)成分和體外發(fā)酵特性等采用單因素方差進行分析,以P<0.05作為差異顯著性標準。
2.1 不同豬屎豆的生長周期 不同的豬屎豆品種在相同栽培條件下從出苗到初花期時間不同。其中T1、T3和T9材料的平均用時72 d。T4、T7、T8和T12樣品,平均用時87 d。T2、T5、T6、T10和T11樣品,平均用時97 d。莖葉比方面,各品種都表現(xiàn)出葉片部分干物質量顯著大于莖部。在12個品種中,T1莖葉比值最低,約為0.18。T6莖葉比值最高,約為0.59。在株高方面,第一組T1(78.3 cm),第二組的T4(89.8 cm)和T12(91.4 cm)和第三組的T2(89.4 cm)和T10(88.3 cm)在各分組中表現(xiàn)最高。
2.2 不同品種豬屎豆的營養(yǎng)成分變化 由表5可知,在第一組中(平均栽培期72 d),T1、T3和T9之間,除酸性洗滌纖維和磷含量以外,其他營養(yǎng)參數(shù)含量沒有顯著差異。T9的磷(0.18% DM)和酸性洗滌纖維(20.8% DM)含量,顯著高于其他兩個品種,其中,磷含量高約16%、酸性洗滌纖維高出約73 %(P<0.05)。第二組中(平均栽培期87 d),T12的中性洗滌纖維含量約為42.9% DM,高出其他品種約16%(P<0.05),粗蛋白質含量中,T4和T8表現(xiàn)最高,約為38.5% DM,顯著高于其他品種含量17%左右(P<0.05),T4的酸性洗滌纖維(15.1% DM)和鉀(5.39% DM)含量分別顯著高于其他品種約19%和24%。第三組品種中(平均栽培期97 d),各品種的粗蛋白質和中性洗滌纖維含量沒有顯著差異。
表5 不同品種豬屎豆莖葉混合營養(yǎng)成分
2.3 體外培養(yǎng)后對不同品種豬屎豆干物質消化率和發(fā)酵參數(shù)的影響 由表6可知,12份經過培養(yǎng)后的豬屎豆資源,培養(yǎng)液發(fā)酵參數(shù)未見異常。在第一組中(平均栽培期72 d),T1和T3的干物質消化率約為36.4% DM,二者之間沒有顯著差異,但高于T9(31.5% DM)約16%左右(P<0.05),各品種的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量沒有顯著差異,產氣量方面,T1和T3之間無顯著差異,平均為19.5 mL/g,略高于其他品種。T9(21.2%)的丙酸含量顯著低于T1(23.4%)和T3(23.3%)(P<0.05)。在第二組中(平均栽培期86 d),T4和T12的干物質消化率無顯著差異,但高于T7和T8(P<0.05)。T4的揮發(fā)性氨態(tài)氮含量最高,約為0.60 mg/100 mL,顯著高于T7、T8和T12,且三者之間無顯著差異(P>0.05)。揮發(fā)性脂肪酸方面,T4(67.2%)和T12(68.7%)的乙酸含量顯著高于其他兩個品種,而T12(20.8%)的丙酸含量顯著低于其他品種10%左右(P<0.05)。第三組品種中(平均栽培期97 d),T5的干物質消化率最高,為37.5%。各資源的揮發(fā)性氨態(tài)氮濃度沒有表現(xiàn)出顯著差異。T11(69.1%)的乙酸含量在同組中最高(P<0.05),顯著高于其他品種,丙酸(20.5%)含量相比其他品種含量顯著偏低約15%(P<0.05)。
表6 不同品種豬屎豆莖葉混合體外培養(yǎng)產氣、pH及瘤胃發(fā)酵情況
牧草的株高、莖葉比及營養(yǎng)成分等是判定生產性能的主要參數(shù)(謝金玉,2018)。不同品種和來源地影響植株的生長和營養(yǎng)特征(郝振帆,2021),氣溫、光照和降雨量也是影響植物生長性能的重要因素(Lv等,2021)。本試驗期間,11月開始以后的氣溫較低,這可能直接影響了植物株高,在秋冬季節(jié)栽培豬屎豆可能生產效率會大大降低,與此同時,11~12月的降雨量嚴重不足,這也直接導致作物生長緩慢。海南地區(qū),柱花草作為常見豆科牧草在部分地區(qū)被種植,蔣亞君等(2017)測得柱花草的自然株高均值為55.9 cm,顯著低于豬屎豆(本試驗平均植株高度為81.2 cm)。另一方面,植物根系的發(fā)達程度直接影響?zhàn)B分的吸收與合成,截至目前,鮮見關于豬屎豆根系研究,明確根系生理和生長狀態(tài),更便于篩選更為高效的品種進行推廣栽培(強勝等,2006)。牧草的莖葉比影響全株營養(yǎng)組成以及對反芻動物適口性和采食率(趙明坤,2006),研究對比了幾種常見牧草資源的莖葉比情況,其中,苜蓿草約為1.10(柴鳳久,2005)、紫色象草約為0.98(易顯鳳,2015)以及王草約為0.78(陳勇,2009),都遠遠大于豬屎豆(0.37)。植物的主要營養(yǎng)幾乎都集中在葉片部分(Konrad等,2001),豬屎豆繁茂的葉量更加凸顯了作為優(yōu)質牧草的巨大優(yōu)勢。
本試驗中,各資源的粗蛋白質含量都表現(xiàn)了豆科植物的優(yōu)越性,其含量均在30%以上,特別是T1、T4、T8,均超過38%。這也遠遠高于目前熱帶地區(qū)常見粗飼料資源,紫花苜蓿(17%~18%)(萬素梅,2004)、木薯莖(20.0%~36.4%)(Castellanos等,1994)、柱花草(14%~18%)(賴志強,2012)及王草(7%~9%)(譚文彪,2008)。研究表明,早期收割的牧草可以得到較高濃度的粗蛋白質含量(Lv等,2017),本試驗中,第一組(75 d)的粗蛋白質平均含量38.1%,第二組(87 d)為35.6%,第三組(97 d)為33.6%,呈現(xiàn)了相同的趨勢。
本試驗測得豬屎豆的中性洗滌纖維含量為35%~40%,酸性洗滌纖維的含量為13%~16%,符合1級牧草的中酸性洗滌纖維分級標準(陳谷,2010)。脂肪為動物提供了必需氨基酸(王定發(fā),2016),本試驗各品種選材脂肪含量(6.0%~9.5%)也顯著高于木薯莖葉(4.17%~8.28%)(周璐麗,2016),因此對豬屎豆的脂肪酸組成進行評價,探究其作為粗飼料資源的潛在價值具有重要意義。
在體外發(fā)酵過程中,產氣總量反映了飼料的降解程度和微生物的活動狀況。產氣總量越高,可發(fā)酵營養(yǎng)物質含量越高(Sun等,2014)。本研究中,瘤胃液的發(fā)酵情況沒有發(fā)生異常。一般情況下,干物質消化率與產氣量呈正相關關系(陳艷琴,2011),在本研究中,很多品種并不完全呈現(xiàn)這樣的相關性,這可能是由于不同品種間的豬屎豆中的單寧含量存在差異,植物中的丹寧可以顯著抑制瘤胃產氣量(米見對,2011)。
植物葉片部分集中了更多的營養(yǎng)并且容易被反芻動物消化利用(陸景陵,2003),通過莖葉比和干物質消化率的數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn),莖葉比比值較低的品種,基本呈現(xiàn)干物質消化率顯著偏高現(xiàn)象,如T1的莖葉比為0.18,其干物質消化率可達32.2%,而T6的莖葉比為0.59,其干物質消化率僅為25.5%,這表明了葉比莖更易消化,莖葉比越低,飼用價值可能越好(余成群,2010)。因此,在篩選品種過程中,可以通過莖葉比情況快速推定其飼用價值。
揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物的主要能量來源,其產量和比例顯著影響反芻動物飼糧中營養(yǎng)物質的吸收和利用(黃雅莉,2014)。本試驗中,所有豬屎豆品種的乙酸、丙酸含量均略高于李文娟等(2017)試驗中柚子皮的脂肪酸含量,說明飼喂豬屎豆時,反芻動物瘤胃微生物對有機物的發(fā)酵更為徹底。乙酸/丙酸的值與能量利用效率成線性關系(鄒彩霞,2011),本研究中乙酸/丙酸的值(2.93)略低于何香玉(2015)(苜蓿草,3.21),這反應了豬屎豆可以提供充足的能量來作為反芻動物飼料。氨態(tài)氮是評價瘤胃內環(huán)境的一個重要指標,過高或過低時都對微生物的生長繁殖不利(李文娟,2017),同時也可反映蛋白質的利用率,本試驗第一組中的T3和T9,第二組中的T4以及第三組中除T6的其他品種可能有著較高的蛋白質利用率。
作為一種新型飼料資源,有必要長期深入地評價其安全性能、營養(yǎng)變化、平均生物量等指標。豬屎豆作為豆科植物,其高蛋白的巨大特性應被充分挖掘利用,在未來研究中,還將對其蛋白質組成及在反芻動物體內代謝情況進行試驗,掌握豬屎豆資源作為動物日糧的最高效利用方法,最終應用于生產加工中。
本研究結果表明,T1(云南玉元)、T3(廣西廉江)、T4(海南??冢┖蚑5(海南瓊山)蛋白質含量和干物質消化率較高,品種優(yōu)勢較為明顯,具有作為優(yōu)質豬屎豆資源進一步評價的潛力和作為粗飼料資源的可行性。