趙建英，張迎昭，李 祥，白 建

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033001）

圣女果又稱櫻桃番茄，含有多種營養(yǎng)素，可以促進(jìn)消化，刺激食欲，治療厭食和食欲不振（白建等，2021）。番茄紅素是番茄里的主要色素，容易被氧化降解，可以作為抗氧化劑使用，清除并殺死自由基，而且番茄紅素還具有補(bǔ)氣生血、延緩衰老和抗肥胖功能。因此成為最受人們歡迎的營養(yǎng)保健品之一（曾敬等，2020）。金炳熔等（2020）通過小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能夠改善哮喘小鼠肺組織病理學(xué)，得到番茄紅素具有抗哮喘作用的結(jié)論。王維等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以預(yù)防心腦血管疾病。李童等（2020）通過試驗(yàn)用番茄紅素提取物制作面膜，所制得的面膜容易涂抹、氣味宜人、并且具有抗衰老能力。Paul等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能有效地幫助恢復(fù)與神經(jīng)退行性疾病、癲癇病、衰老、亞拉克諾德出血、脊髓損傷和神經(jīng)病變相關(guān)的典型行為和病理生理變化。Mirahmadi等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以調(diào)節(jié)信號(hào)通路及其蛋白質(zhì)，用于治療或預(yù)防前列腺癌。Stice等（2018）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能預(yù)防酒精性脂肪肝病和肝細(xì)胞癌發(fā)展。Kilany等（2020）發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有抗肥胖潛力。Ladole等（2018）研究了超聲波和共固定酶對(duì)番茄皮的協(xié)同效應(yīng)，用于番茄紅素提取。陳俊杰等（2020）研究了超臨界CO2技術(shù)來萃取番茄紅素，并對(duì)這種技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。趙芳等（2020）探索了超微粉碎協(xié)同微波技術(shù)對(duì)番茄中的番茄紅素進(jìn)行提取，并得到了比較好的結(jié)果。

本研究以新鮮圣女果為原料，采用乙酸乙酯萃取法，通過單因素試驗(yàn)，確定最優(yōu)參數(shù)范圍，再通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到最適的提取條件，并對(duì)所提取的番茄紅素進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，研究番茄紅素的抑菌效果穩(wěn)定性，為圣女果的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 圣女果購于呂梁市家家利超市；大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌由呂梁學(xué)院生命科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室提供；0.5%山梨酸鉀溶液（分析純），乙酸乙酯（分析純），氫氧化鈉（分析純），無水乙醇（分析純），鹽酸（分析純）。瓊脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），牛肉膏（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），蛋白胨（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），氯化鈉（濟(jì)南坤豐化工有限公司）。

1.2 主要儀器pH計(jì)（FE20K）：梅特勒-托利多儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；紫外可見光分光度計(jì)（UV-1601）：北京瑞利分析儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考王海紅等（2017）的結(jié)論，首先使用蘇丹Ⅰ和無水乙醇以適當(dāng)比例混合，配制出質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12 μg/mL的番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在473 nm處測定番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，通過所記錄的數(shù)據(jù)來制作并繪制番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 番茄紅素提取率測定 將番茄紅素提取液進(jìn)行稀釋，使用分光光度計(jì)測定稀釋后的番茄紅素提取液的吸光度，利用線性回歸方程計(jì)算提取率。番茄紅素提取率計(jì)算公式為：

式中：C為通過線性回歸方程求得的番茄紅素的濃度，μg/mL；V為定容后的體積，mL；N為定容后稀釋的倍數(shù)；m為圣女果糊狀物的質(zhì)量，g。

1.3.3 番茄紅素提取 （1）清洗去皮：將新鮮圣女果進(jìn)行清洗，去除外表皮和果蒂。（2）打糊：將處理后的圣女果放入榨汁機(jī)中打成糊狀。（3）浸提：稱取5 g圣女果糊，加入乙酸乙酯，置于恒溫水浴鍋中浸提。（4）過濾：浸提完成后，用濾紙進(jìn)行過濾。（5）稀釋：取過濾后的提取液5 mL，稀釋10倍，在473 nm處測量吸光度。。

1.3.4 番茄紅素抑菌作用 （1）制作培養(yǎng)基：取牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl若干制作培養(yǎng)基。（2）滅菌：將經(jīng)過高溫煮沸的培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，用棉花堵口，放入滅菌鍋，進(jìn)行滅菌。（3）倒平板：將經(jīng)過濕熱高溫滅菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入經(jīng)過高溫蒸汽滅菌的平板中。（4）制菌懸液：分別刮取試管斜面上的菌種入無菌生理鹽水中，并將其稀釋成菌懸液備用。（5）接種：等平板凝固后進(jìn)行接種。（6）平板劃線：進(jìn)行平板劃線，標(biāo)明不同濾紙片在平板中所在的位置。（7）放濾紙片：將浸泡了不同溶液的濾紙片放入平板中，并相隔一定距離。（8）培養(yǎng)：將放入濾紙片的平板放入恒溫箱中培養(yǎng)24 h。（9）測量抑菌圈直徑：觀察濾紙片周邊的情況，對(duì)抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。

1.4 單因素試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)：設(shè)定圣女果與乙酸乙酯料液比為1:3，提取溫度45℃，提取時(shí)間3 h，浸提pH為4，對(duì)番茄紅素的提取進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。分別研究不同料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL），不同提取溫度（25、35、45、55、65℃），不同浸提時(shí)間（1、2、3、4、5 h），不同浸提pH（2、4、6、8、10）對(duì)番茄紅素提取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用單因素試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，進(jìn)行BBD響應(yīng)面法試驗(yàn)（張環(huán)宇等，2020），以A提取時(shí)間、B提取溫度、C料液比、D浸提pH作為四個(gè)影響因素，以番茄紅素提取率為考察指標(biāo)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.6 抑菌試驗(yàn)

1.6.1 番茄紅素的抑菌試驗(yàn) （1）配制培養(yǎng)基：按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱取制作培養(yǎng)基的材料，加熱煮沸后將培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，先用棉花封口，再用報(bào)紙進(jìn)行包扎。（2）滅菌與倒平板：將裝有處理過的培養(yǎng)基的錐形瓶放入滅菌鍋，進(jìn)行滅菌操作，滅菌完成后，在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行倒平板操作。（3）制菌懸液：在無菌條件下制作菌懸液，吸取5 mL無菌水，將無菌水放到菌種斜面，用接種環(huán)慢慢刮下菌苔，塞上棉塞，并振蕩片刻。（4）取最佳提取條件提取所得的番茄紅素溶液備用。（5）取直徑6 mm的圓形濾紙片若干，取4個(gè)圓形濾紙片放入番茄紅素溶液中，取另外4個(gè)圓形濾紙片放入乙酸乙酯中，再取4個(gè)圓形濾紙片放入無菌水中，最后取4個(gè)圓形濾紙片放入山梨酸鉀溶液中。（6）待平板凝固后進(jìn)行接種，取一個(gè)平板不進(jìn)行接種，做空白對(duì)照，編號(hào)為1，另外分別取0.3 mL不同菌的菌懸液倒入另外3個(gè)平板中，用涂布棒抹勻，并將接種了大腸桿菌的平板編號(hào)為2，將接種了金黃色葡萄球的平板編號(hào)為3，將接種了枯草芽孢桿菌的平板編號(hào)為4。（7）在編號(hào)為1、2、3、4的平板中分別放入1個(gè)含有番茄紅素溶液的圓形濾紙片，1個(gè)含有乙酸乙酯的圓形濾紙片，1個(gè)含有無菌水的圓形濾紙片，1個(gè)含有山梨酸鉀溶液的圓形濾紙片，每個(gè)紙片間相隔較大距離。（8）將上述4個(gè)平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，間隔一定距離并培養(yǎng)24 h。每組做三個(gè)平行試驗(yàn)。（9）測量抑菌圈直徑：觀察濾紙片周邊抑菌圈的情況，對(duì)抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。

1.6.2 番茄紅素抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.6.2.1 不同溫度對(duì)番茄紅素抑菌效果的影響選用濾紙片法，將番茄紅素溶液分別于20、40、60、80、100℃下，加熱0.5 h，而后放入平板中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，選擇未處理的番茄紅素溶液作為對(duì)照，觀察濾紙片周圍透明抑菌圈情況，記錄數(shù)據(jù)。

1.6.2.2 不同pH對(duì)番茄紅素抑菌效果的影響 選用濾紙片法，使用0.5 mol/L的NaOH或HCl溶液將番茄紅素溶液（pH）分別調(diào)節(jié)為2、4、6、8、10，以對(duì)應(yīng)未經(jīng)處理的番茄紅素溶液和對(duì)應(yīng)pH的NaOH或HCl溶液作為對(duì)照，常溫1 h后，進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，觀察濾紙片周圍透明抑菌圈情況，記錄數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 使用Office Excel 2019整理數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism 8制圖。用SPSS 22.0進(jìn)行正交試驗(yàn)的方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 利用配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長473 nm處對(duì)吸光度進(jìn)行測定，可以發(fā)現(xiàn)吸光度Y與番茄紅素濃度X之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其關(guān)系為Y=0.1049X-0.0011386，R2=0.9966（圖1），可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)番茄紅素含量進(jìn)行分析。

圖1 番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 不同料液比對(duì)番茄紅素提取率的影響結(jié)果圖2表明，料液比對(duì)圣女果中番茄紅素的浸提提取率有十分明顯的影響，當(dāng)料液比為1:1～1:3時(shí)，番茄紅素的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，在1:3時(shí)達(dá)到最大提取率。由此可知在料液比1:3時(shí)，番茄紅素的提取率達(dá)到峰值，料液比為1:3～1:5時(shí)，番茄紅素提取率趨于穩(wěn)定?？赡苁橇弦罕葹?:3時(shí)，番茄紅素已經(jīng)全部被提取出來。

圖2 不同料液比對(duì)提取率的影響

2.2.2 不同浸提溫度對(duì)番茄紅素提取率的影響結(jié)果 由圖3可以看出，在25～45℃，提取率與浸提溫度成正相關(guān)，這可能是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)增快，圣女果中番茄紅素溶解速度加快。但溫度超過45℃時(shí)，浸提提取率變小，可能是因?yàn)闇囟冉咏釀┑姆悬c(diǎn)，導(dǎo)致浸提劑揮發(fā)，番茄紅素分解，不能穩(wěn)定存在。由此可知，在進(jìn)行番茄紅素的提取時(shí)，浸提溫度選擇45℃比較合適。

圖3 不同浸提溫度對(duì)提取率的影響

2.2.3 不同浸提時(shí)間對(duì)番茄紅素提取率的影響結(jié)果 從圖4可以看出，浸提時(shí)間對(duì)圣女果中番茄紅素的提取率有影響，當(dāng)提取時(shí)間為1～4 h時(shí)，提取率明顯呈現(xiàn)上升趨勢，并且在4 h時(shí)番茄紅素的提取率達(dá)到峰值，但提取時(shí)間為4～5 h時(shí)，番茄紅素的提取率有下降趨勢，可能是由于浸提時(shí)間超過最大限度，色素不能穩(wěn)定存在。

圖4 不同浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.4 不同浸提pH對(duì)番茄紅素提取率的影響結(jié)果 從圖5可以看出，浸提pH為2～6時(shí)，隨著浸提pH的增加，番茄紅素的提取率逐漸上升，當(dāng)pH＞6時(shí)，番茄紅素的提取率相較于之前有明顯的下降?？赡苁且?yàn)樵趶?qiáng)堿環(huán)境下，由于發(fā)生未知反應(yīng)導(dǎo)致番茄紅素不能穩(wěn)定存在，導(dǎo)致提取率變低。另外當(dāng)浸提pH＜4時(shí)，提取率有較大幅度的下降，可能是在強(qiáng)酸條件下，番茄紅素不能穩(wěn)定存在。

圖5 不同浸提pH對(duì)提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

從表2的數(shù)據(jù)可以得出，最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D2，即圣女果與乙酸乙酯的料液比為1:4，浸提溫度45℃，提取時(shí)間5 h，提取pH為6。其中，料液比、提取時(shí)間和提取溫度引起的番茄紅素提取率的改變較大，而提取環(huán)境pH引起的番茄紅素提取率的改變較小。從表3的各項(xiàng)數(shù)據(jù)可以得出，料液比和浸提時(shí)間引起的提取率變化呈極顯著差異，浸提溫度引起的提取率變化達(dá)到顯著水平。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

另外，通過正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差與方差分析可得，浸提劑的多少是影響提取率的重要因素之一，而通過單因素試驗(yàn)可知料液比1:3和料液比1:4的差距較小，從經(jīng)濟(jì)角度來看，選用料液比1:3更加合理。而在浸提時(shí)間的選用方面，在單因素試驗(yàn)中，提取時(shí)間為4 h和提取時(shí)間為5 h的提取率相比較接近，沒有明顯差異，所以為了節(jié)省提取時(shí)間，可以把浸提時(shí)間設(shè)置為4 h。其次，浸提溫度是影響提取率的一個(gè)重要因素，在浸提溫度為45℃時(shí)提取率達(dá)到最大，但當(dāng)溫度大于45℃后，提取率開始減小。因此，溫度選擇45℃比較合適。最后，在浸提pH的選擇上，通過單因素試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在pH為2或pH為10的條件下，番茄紅素的提取率與其他條件下相差較大，可能是由于這兩種條件下提取液中發(fā)生未知反應(yīng)導(dǎo)致番茄紅素不能穩(wěn)定存在于浸提劑中，導(dǎo)致提取率變低。因此可以得出進(jìn)行番茄紅素提取的最優(yōu)pH為6。

綜上所述，進(jìn)行提取的最優(yōu)條件是圣女果與乙酸乙酯的料液比為1:3，溫度為45℃，浸提時(shí)間為4 h，提取pH為6。根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)行三次試驗(yàn)，所得到的提取率為56.19 μg/g，優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 番茄紅素抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，在作為對(duì)照的平板1中放入帶有各種溶液的濾紙片，抑菌圈直徑均為6 mm，說明未接種菌種的平板中濾紙片周圍未形成透明抑菌圈。平板2、3、4中放有無菌水濾紙片，乙酸乙酯濾紙片的抑菌圈直徑為6 mm，說明帶有這兩種溶液的濾紙片周圍未形成透明抑菌圈，由此可知無菌水、乙酸乙酯對(duì)這三種菌類沒有抑制作用。而番茄紅素濾紙片和山梨酸鉀濾紙片的抑菌圈直徑均大于6 mm，說明這兩個(gè)濾紙片周圍有透明抑菌圈形成?？梢钥闯觯鸭t素和山梨酸鉀對(duì)這三種菌類均有一定的抑制作用。

表4 各個(gè)平板內(nèi)的濾紙片抑菌圈直徑

2.4.2 番茄紅素抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2.1 不同溫度對(duì)番茄紅素抑菌穩(wěn)定性的影響由表5可知，通過改變溫度，當(dāng)溫度在20～60℃時(shí)，番茄紅素試驗(yàn)組的抑菌圈直徑與對(duì)照組之間并無明顯差距；而當(dāng)溫度在80～100℃時(shí)，番茄紅素試驗(yàn)組的抑菌圈直徑明顯小于對(duì)照組；這說明番茄紅素的抑菌效果在20～60℃比較穩(wěn)定，而當(dāng)溫度升高到60℃以上時(shí)番茄紅素的抑菌效果會(huì)降低，可能是由于溫度過高，番茄紅素不能穩(wěn)定存在。

表5 溫度對(duì)番茄紅素抑菌穩(wěn)定性的影響mm

2.4.2.2 不同pH對(duì)番茄紅素抑菌效果的影響由表6可知，不同pH對(duì)番茄紅素的抑菌效果有比較明顯的影響，當(dāng)pH在4～8時(shí)，試驗(yàn)組番茄紅素的抑菌圈直徑與對(duì)照組番茄紅素的抑菌圈直徑相比無明顯差異；但是當(dāng)pH為2或10時(shí)，試驗(yàn)組番茄紅素的抑菌圈直徑與對(duì)照組番茄紅素的抑菌圈直徑相比有明顯的減小，可能是因?yàn)樵趶?qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下，番茄紅素的活性被破壞，導(dǎo)致番茄紅素抑菌效果降低。由此可以得出，在pH在4～8時(shí)，番茄紅素的抑菌效果比較穩(wěn)定；在pH為2或10時(shí)（有沒考慮強(qiáng)酸或強(qiáng)堿本身這三種菌就不適合生長，pH設(shè)在中性左右，間隔也可小些，間隔1或0.5），可能由于發(fā)生未知反應(yīng)，導(dǎo)致番茄紅素的抑菌效果不穩(wěn)定。

表6 pH對(duì)番茄紅素抑菌效果的影響mm

3 結(jié)論

該試驗(yàn)以圣女果為原料，通過單因素試驗(yàn)，分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過綜合分析，得出的最佳提取條件為：料液比1:3，提取溫度45℃，浸提時(shí)間4 h，浸提pH 6。根據(jù)該條件進(jìn)行提取，番茄紅素提取率可達(dá)56.19 μg/g；同時(shí)通過抑菌試驗(yàn)，對(duì)其抑菌作用進(jìn)行研究，得到了番茄紅素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。在20～60℃、pH為4～8條件下，番茄紅素的抑菌效果有良好的穩(wěn)定性。