蘇 霞，王緒根，李 云，崔榮飛，馮騰壘，楊曉霞，趙金彩

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測(cè)中心 050041；2. 行唐縣畜牧工作總站 050000；3. 行唐縣畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)站 050000；4. 趙縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 050000）

四環(huán)素類抗生素具有廣譜抗菌效應(yīng)，對(duì)多種細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[1]，因此被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，以此來(lái)促進(jìn)畜禽動(dòng)物生長(zhǎng)、改善畜禽飼料利用率、降低動(dòng)物死亡率等[2]。然而，由于部分從業(yè)人員缺乏職業(yè)道德素養(yǎng)，只顧追求經(jīng)濟(jì)利益，致使畜牧業(yè)中四環(huán)素類抗生素過(guò)度使用，導(dǎo)致食用畜禽產(chǎn)品中四環(huán)素類化合物的殘留限量嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重影響人們的身體健康[3]，因此國(guó)內(nèi)外都對(duì)畜禽產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留做了嚴(yán)格規(guī)定。為了遏制四環(huán)素類抗生素濫用現(xiàn)象, 2020年，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部曾發(fā)布公告，禁止將包括土霉素、金霉素在內(nèi)的藥物用作飼料添加劑；在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素和土霉素在畜產(chǎn)品中可以使用，但應(yīng)制定最大殘留限量的藥物，牛/羊奶中的四環(huán)素類抗生素最大殘留限量為100μg/kg，雞蛋中四環(huán)素類化合物的最大殘留限量為400μg/kg[4]。目前，畜禽產(chǎn)品中常用的檢測(cè)四環(huán)素類抗生素殘留的方法有高效液相色譜法（HPLC）[5]、免疫層析分析方法、氣相色譜法（LC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)等[6-10]。本文綜述了目前針對(duì)畜禽產(chǎn)品中殘留對(duì)四環(huán)素類化合物最新的檢測(cè)方法，希望為今后的四環(huán)素殘留檢測(cè)提供方法依據(jù)。

1 氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC- MS）同時(shí)具有氣相色譜的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏性的特點(diǎn)，可用于對(duì)難以區(qū)分的熱穩(wěn)定性好且易揮發(fā)的化合物進(jìn)行分離確證，其可根據(jù)化合物分子的特征離子碎片，準(zhǔn)確鑒定化合物，因此被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)。 但是氣質(zhì)聯(lián)用法的缺點(diǎn)是無(wú)法分析高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差的化合物樣品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，就需要采取液相色譜法或其他分析方法進(jìn)行前處理分析。

倉(cāng)公敖等[11]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，建立了一種對(duì)雞肉、雞 肝、牛肉、河蟹、鰻魚(yú)及蜂蜜等畜禽產(chǎn)品中的土霉素、四環(huán)素的殘留檢測(cè)方法。該方法前處理過(guò)程中，將樣品用異丙醇和乙酸乙酯（40 ∶60）進(jìn)行分離提取，然后再經(jīng)弱陽(yáng)離子交換柱分離后，經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用儀分析確證，該方法回收率達(dá)到60%以上，檢測(cè)限達(dá)到0.05～3.59 mg/kg之間，表明此方法具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏性。

2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）依靠液相色譜系統(tǒng)，將樣品中復(fù)雜的化學(xué)組分進(jìn)行分離，然后通過(guò)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)特征分子離子峰，對(duì)樣品中的化合物進(jìn)行分析測(cè)定。該方法將液相色譜與質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，具有特異性高、靈敏度高的特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、醫(yī)學(xué)等多種分析領(lǐng)域中。

劉柏林等[12]建立了一種同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定禽類產(chǎn)品中喹諾酮與四環(huán)素殘留限量的檢測(cè)方法，在該方法前處理過(guò)程中，采用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液絡(luò)合金屬離子，并以鎢酸鈉與鹽酸體系為沉淀劑，使樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)變性，從而除去基質(zhì)中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，固相萃取柱凈化，并將樣品經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測(cè)定。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果表明喹諾酮與四環(huán)素類抗生素藥物殘留在0.1～50.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.05～0.20 μg/kg，回收率達(dá)到60.6%～117.9%。該方法在前處理過(guò)程中降低了樣品中待測(cè)物的損失，適用于批量測(cè)定畜禽產(chǎn)品中喹諾酮和四環(huán)素類抗生素。高志瑩等[13]建立了一種利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS)同時(shí)測(cè)定牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)限量的方法，該方法將樣品用EDTA-2Na-Mcllvaine緩沖液提取分離，然后經(jīng)PLS固相萃取柱凈化，最后用10%甲醇-乙酸乙酯洗脫，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測(cè)定。該方法實(shí)現(xiàn)了在4min內(nèi)可完成四環(huán)素類化合物的完全分離，方法靈敏度高，特異性好，方法回率達(dá)到81.5%～115.1%之間。張崇威等建立了利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋及牛奶中的四環(huán)素類化合物的檢測(cè)方法，該方法樣品基質(zhì)用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取，然后用裝有脫脂棉的HLB固相萃取柱富集凈化后，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。該方法中四環(huán)素類抗生素在5～100 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法檢測(cè)限達(dá)到2μg/kg，定量限則為5μg/kg，方法回收率達(dá)到81.2%～110.0%之間。該方法所得的各項(xiàng)指標(biāo)均符合殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于雞蛋及牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留限量測(cè)定。陳艷等[14]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)鹵肉制品中的四環(huán)素進(jìn)行殘留檢測(cè)，該方法中，四環(huán)素類抗生素在濃度0.1～10 μg/mL之間線性范圍良好，線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上。在3個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收下，該類化合物的平均回收率達(dá)到76.7%～103.7%，相對(duì)平均偏差則為3.2%～4.6%。抽取樂(lè)山地區(qū)部分市售食用畜產(chǎn)品，利用此方法測(cè)定里面的四環(huán)素類藥物殘留限量，結(jié)果表明該類化合物的殘留含量均符合標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法具有選擇性好、靈敏度強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于市售食用畜產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物含量測(cè)定。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是將液體作為流動(dòng)相，并結(jié)合高壓輸液泵，將具有不同極性的流動(dòng)相泵入到色譜柱中，在色譜柱內(nèi)利用各組分的極性不同，進(jìn)行分離，最后進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分析。按其分離機(jī)制的可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子對(duì)色譜法等，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，因此被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品中各種獸藥殘留檢測(cè)分析。

劉文靜等[15]利用固相萃取-高效液相色譜法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳品飲料中四環(huán)素類抗生素的殘留檢測(cè)。該方法中，前處理過(guò)程用乙腈沉淀樣品蛋白，然后采用HLB固相萃取柱分離凈化樣品，以乙腈：甲醇：0.01mol/L草酸溶液（18∶5∶77）作為流動(dòng)相，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)分析。該方法中，四環(huán)素類藥物在0.10～1.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.994，檢出限為2.0～5.0μg/kg，回收率在77.6 %～90.6 %，表明該方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于乳品中四環(huán)素類抗生素藥物殘留檢測(cè)。李桂琴[16]等分別以HLB固相萃取柱、氨基柱和C18柱用于樣品前處理過(guò)程中樣品的分離富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基柱對(duì)乳品的富集凈化效果最理想，因此以氨基柱作為前處理凈化柱，然后以0.1%甲酸-甲醇作為洗脫劑洗脫樣品，以水乙腈（1∶4）為流動(dòng)相，建立了利用超高效液相色譜法測(cè)定牛奶及奶制品中四環(huán)素類抗生素藥物殘留，結(jié)果表明該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度高。高旭東等[17]利用高效液相色譜法，實(shí)現(xiàn)了測(cè)定畜禽肉和三文魚(yú)中的四環(huán)素類化合物的殘留檢測(cè)分析，該方法以Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（pH=4.0）作為提取液，然后用三氯乙酸沉淀樣品，經(jīng)固相萃取柱富集凈化待測(cè)樣品，以0.01 mol/L草酸溶液∶乙腈∶甲醇（73∶17∶10）作為流動(dòng)相。結(jié)果表明該類加標(biāo)回收率達(dá)到74%～90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%～8%之間。表明該方法準(zhǔn)確度高、靈敏度強(qiáng)，適用于檢測(cè)畜禽產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素和金霉素藥物殘留。

4 免疫層析法

免疫分析法主要包括放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、金標(biāo)檢測(cè)試紙法等。免疫分析法操作簡(jiǎn)便、靈敏性高、適用于批量檢測(cè)樣品，被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)。張正英等[18]用熒光免疫層析法，完成了對(duì)青海牦牛肉中四環(huán)素藥物殘留分析，該方法的定量限達(dá)到10μg/kg，樣品回收率達(dá)到80.0%～120.0%，表明該方法準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)。此外，該方法中30 min內(nèi)可完成樣本的前處理工作，10min完成樣品的定量檢測(cè)。陳燕妮[19]等利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，建立了一種對(duì)牛奶和蜂蜜樣品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)方法。該方法中，該類化合物的加標(biāo)回收率達(dá)到89.9%～105.1%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便快速，適用于牛奶樣品四環(huán)素類抗生物的藥物殘留檢測(cè)。

5 小結(jié)

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對(duì)食用畜產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題也越來(lái)越重視，因此需要開(kāi)發(fā)高效、靈敏的畜禽產(chǎn)品中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)。本論文綜述了針對(duì)檢測(cè)畜禽產(chǎn)品中殘留四環(huán)素類抗生素的研究進(jìn)展，其中高效液相色譜法與液質(zhì)聯(lián)用法應(yīng)用廣泛，該方法高效、靈敏、穩(wěn)定可靠，但具有前處理復(fù)雜、操作難等缺點(diǎn)，因此檢測(cè)四環(huán)素類化合物的方法還需進(jìn)一步研發(fā)，以保障人民的食品安全。