胡濤

（阿拉善右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 阿拉善 750300）

1 牛布魯菌病概述

1.1 臨床癥狀

該病常發(fā)地區(qū)的牛感染后一般多為慢性經(jīng)過，臨床上幾乎看不到癥狀。潛伏期2周～6個(gè)月，奶牛最明顯的癥狀是流產(chǎn)，可發(fā)生于妊娠母牛的任何時(shí)期，但多發(fā)于妊娠后6～8個(gè)月，多見胎衣停滯?；寂６酁閹Ь?，奶牛產(chǎn)奶量下降。大多數(shù)感染母牛只流產(chǎn)1次，如果改善飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，可達(dá)到自然痊愈的效果。公牛常見睪丸炎和附睪炎，急性期病牛睪丸腫痛，并可能伴有中度發(fā)熱，食欲減退，精液中含有大量布魯菌。慢性期病牛精液排菌量少，但是常呈間歇性排菌，有的牛排菌可持續(xù)數(shù)年。這類病牛還常見關(guān)節(jié)炎和滑液囊炎。

1.2 病理變化

1.2.1 剖檢變化。妊娠母牛子宮與胎膜的病理變化比較突出。流產(chǎn)前數(shù)天陰唇及陰道黏膜充血、水腫，流出惡臭的淡紅色黏液。子宮絨毛膜間隙中有污灰色或黃色惡臭膠樣滲出物。絨毛膜因充血而呈紫紅色，表面覆蓋有黃色壞死物和污灰色膿汁，常見深淺不一的糜爛面。胎膜因水腫而肥厚，呈膠樣浸潤(rùn)外觀。由于母體胎盤與胎兒胎盤的炎癥及壞死等因素，影響胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致死亡，出現(xiàn)流產(chǎn)，但是胎兒胎盤與母體胎盤粘連，引起胎衣滯留。如果繼發(fā)化膿菌感染，可發(fā)生化膿性子宮炎。病原菌長(zhǎng)期潛伏，可發(fā)展為慢性子宮炎。外觀子宮體積增大，黏膜肥厚，并形成波紋狀皺褶，有時(shí)還可見局灶性壞死和潰瘍，或有息肉狀增生物形成。輸卵管腫大、變粗，黏膜增厚而有彈性。卵巢初期表現(xiàn)為漿液-纖維性炎，其后卵巢組織硬化，有時(shí)形成卵巢囊腫。乳腺常表現(xiàn)為間質(zhì)性乳腺炎或繼發(fā)性萎縮及硬化。乳腺切面多見黃色小結(jié)節(jié)。公?；疾剪斁r(shí)，可發(fā)生化膿-壞死性睪丸炎、附睪炎和精囊炎。睪丸顯著腫大、變硬，由于被膜粘連而不能滑動(dòng)，切面下可見灰色干涸壞死和灰黃色膿性軟化灶。慢性病例還可見關(guān)節(jié)炎和腱鞘炎。

1.2.2 組織學(xué)變化。顯微鏡下觀察，可見母牛子宮絨毛膜充血、出血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞變性、壞死或發(fā)生膿性崩解。滲出物中含有脫落的上皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、組織壞死崩解產(chǎn)物及大量病原菌等。子宮固有層中有彌漫性或局灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，乳腺間質(zhì)中有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)及結(jié)締組織增生。鏡檢公?？梢姶蟛糠志」馨l(fā)生萎縮，失去其多層結(jié)構(gòu)，精原與精母細(xì)胞壞死、崩解，一些精小管內(nèi)充滿崩解脫落的各類精細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)失去管狀結(jié)構(gòu)。有的散有大量嗜中性粒細(xì)胞滲出、崩解，形成大小不等的囊腫。在囊腫周圍的間質(zhì)中，除有浸潤(rùn)的嗜中性粒細(xì)胞外，可見淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞增殖，有上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)和增生性結(jié)節(jié)。

1.3 病原學(xué)

牛種布魯菌是奶牛布病的主要病原，在羊布病流行區(qū)偶爾也感染羊種布魯菌，牛感染豬種布魯菌的病例則少見。各種生物型的牛種布魯菌對(duì)奶牛都有致病性，動(dòng)物品種和性別對(duì)該病的感染沒有明顯區(qū)別，但是年齡和懷孕與否區(qū)別明顯。一般來說，犢牛和老齡牛對(duì)該病的感受性較低，而處在青春期的牛則較易感，懷孕奶牛的感染性最高。流產(chǎn)是該病的主要癥狀，產(chǎn)出死胎或軟弱犢牛，而且在產(chǎn)后排出大量病原菌，是引起畜間暴發(fā)和流行的主要根源。

成年健康牛對(duì)布魯菌具有相對(duì)高的易感性，高于幼畜但低于孕畜。幼畜由于生殖系統(tǒng)還未成熟和可以通過哺乳從母畜獲得抗體，所以對(duì)布魯菌的易感性低。老齡動(dòng)物一方面由于它們的生殖功能已經(jīng)衰退，對(duì)布魯菌不敏感；另一方面這些動(dòng)物在其生命活動(dòng)中或多或少地獲得了傳染后的免疫作用，所以對(duì)布魯菌的易感性也很低。

1.4 發(fā)病機(jī)制

流產(chǎn)材料如胎衣、胎兒和陰道排出物等含有大量病原菌，母牛乳汁和公牛精液中也有布魯菌存在。在自然感染情況下，布魯菌通過消化道、呼吸道、皮膚、黏膜和生殖道進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。病菌進(jìn)入牛體后先在入侵部位短時(shí)間存活，然后經(jīng)淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)。如果病菌不被機(jī)體消滅，則在淋巴中生長(zhǎng)繁殖，然后進(jìn)入血流，引起菌血癥，導(dǎo)致體溫升高。進(jìn)入血流中的布魯菌擴(kuò)散到各個(gè)器官中，在停留的器官中引起病理變化。隨著病理過程向慢性化發(fā)展，菌血癥出現(xiàn)的機(jī)會(huì)減少。

2 血清布病抗體檢測(cè)方法

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）

該試驗(yàn)又稱班氏孟加拉紅平板凝集試驗(yàn)。由于所用的抗原是酸性（pH 3.6～3.9）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中IgM類抗體的凝集活性，檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該反應(yīng)的特異性。該方法簡(jiǎn)便、快捷且容易操作，適用于基層大面積檢疫[1]。

2.2 試管凝集試驗(yàn)（SAT）

該試驗(yàn)又稱萊特凝集試驗(yàn)。將奶牛血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 4 個(gè)稀釋度。 被檢奶牛血清凝集價(jià)為1∶100及以上時(shí)判定為陽(yáng)性；血清凝集價(jià)為1∶50時(shí)判定為可疑[2]。該方法特異性較好，敏感性也高，但試驗(yàn)步驟繁雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于基層大面積檢疫，僅適用于實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)確診。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

該試驗(yàn)分為間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （iELISA）和競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）2種方法。該方法具有敏感、特異和快速等特點(diǎn)。試驗(yàn)用ELISA檢測(cè)儀讀取數(shù)值，相比試管凝集和虎紅平板凝集降低了主觀判斷的隨機(jī)性和不確定性。

3 奶樣布病抗體檢測(cè)方法

3.1 全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）

3.1.1 原理。當(dāng)乳汁中存在特異性布魯菌凝集抗體時(shí)，部分抗體被乳汁中的脂肪球吸附，與加入的帶色布魯菌抗原結(jié)合出現(xiàn)凝集反應(yīng)，由于乳脂比重小而浮在乳汁表層，因此在乳脂層中形成帶色環(huán)狀帶，而其他部分無色。

3.1.2 試驗(yàn)程序。取新鮮牛乳或混合奶1 mL置于小試管內(nèi)，加入1滴乳環(huán)抗原（30～50 μL）充分混勻，置于37℃溫箱1 h后判定結(jié)果。

3.1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)。①?gòu)?qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋＋）。乳柱上層乳脂形成明顯紅色環(huán)帶，乳柱白色，臨界分明。②陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋）。乳脂層的環(huán)帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色。③弱陽(yáng)性反應(yīng)（＋）。乳脂層的環(huán)帶顏色較淺，但比乳柱顏色略深。④疑似反應(yīng)（±）。乳脂層的環(huán)帶顏色不明顯，與乳柱分界不清，乳柱不褪色。⑤陰性反應(yīng)（-），乳柱上層沒有任何變化，乳柱顏色均勻。

3.1.4 注意事項(xiàng)。奶牛奶樣必須是新鮮全脂乳，凡腐敗、變酸和凍結(jié)乳不宜作試驗(yàn)用。夏季的乳應(yīng)于當(dāng)天檢測(cè)，保存于2～4℃冰箱內(nèi)的乳7 d內(nèi)可用；患乳腺炎及其他乳房疾患牛所產(chǎn)的乳以及初乳不宜作MRT，脫脂乳及煮沸過的乳也不能用[3]。

3.2 膠體金免疫層析試驗(yàn)（GICA）

該方法屬于新型快速診斷法，也稱為布魯菌抗體快速檢測(cè)卡。方法是向裝有1 mL新鮮奶樣的1.5 mL EP管中滴加 2滴奶樣緩沖液，顛倒混勻后靜置5～10 min，待析出上清，將處理后的奶樣上清加入到檢測(cè)孔中反應(yīng)20 min，與膠體金標(biāo)記的抗原一起沿層析膜移動(dòng)。如果樣品中存在布病抗體，則與檢測(cè)線上的布病抗原結(jié)合而顯色。

4 討論

目前對(duì)奶牛布病監(jiān)測(cè)主要采用血清抗體檢測(cè)，用虎紅平板凝集試驗(yàn)作為初篩試驗(yàn)，用試管凝集試驗(yàn)或競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為血清學(xué)確診試驗(yàn)。3種布病血清抗體檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：虎紅平板凝集試驗(yàn)簡(jiǎn)單快捷成本低，但不能確診，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而且容易因反應(yīng)時(shí)間偏長(zhǎng)造成誤差；試管凝集試驗(yàn)步驟繁瑣，溶液需要在恒溫箱孵育18～24 h，結(jié)果需試驗(yàn)人員肉眼辨別，存在主觀因素；競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，但是成本較高，對(duì)人員的專業(yè)性要求較高。最重要的是對(duì)于基層防疫員來講，開展采集奶牛血樣工作存在以下問題：一是奶牛保定較難；二是基層防疫員專業(yè)水平不高；三是頻繁采血監(jiān)測(cè)對(duì)奶牛產(chǎn)奶會(huì)造成一定影響。全乳環(huán)狀試驗(yàn)和膠體金免疫層析試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快捷，特異性和敏感性都較高。全乳環(huán)狀試驗(yàn)1 h判定結(jié)果,布魯菌抗體快速檢測(cè)卡25 min左右即可判定結(jié)果。最關(guān)鍵的是奶樣相比較血樣更容易采集，這2種試驗(yàn)在基層大面積檢疫和防疫工作中發(fā)揮了重要作用。

5 結(jié)論

要查明一個(gè)地區(qū)的牛群，特別是要確定哪一個(gè)牛群有布病存在，最有效和最準(zhǔn)確的方法是取牛群的混合乳做全乳環(huán)狀試驗(yàn)或膠體金免疫層析試驗(yàn)。每個(gè)牛群的混合乳可以在收奶站或牛奶加工廠收集，也可以在混合乳漿罐運(yùn)走之前收集。通過檢測(cè)混合乳，確定哪一個(gè)牛群有布病后，再用血清凝集試驗(yàn)法逐頭檢查全場(chǎng)牛，了解布病在該場(chǎng)的流行情況。用這兩種方法檢查一個(gè)地區(qū)的牛群布病，比單獨(dú)采用血檢方法逐頭檢查該地區(qū)的全部牛群更高效便捷。