呂海霞，何玉潔

0 引言

近年來，隨著體外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技術(shù)不斷進(jìn)步，不孕癥患者的臨床妊娠率及活產(chǎn)率得到了提高，但仍有一些患者在進(jìn)行多次胚胎移植后不能成功妊娠，臨床稱之為反復(fù)種植失敗(Recurrent implantation failure，RIF)。RIF采用率最高的定義為：年齡小于40歲的不孕癥婦女在胚胎質(zhì)量良好的情況下,經(jīng)歷至少3次體外受精(Invitrofertilization，IVF)(包括新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植)或胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)而未發(fā)生胚胎著床或臨床妊娠[1]。胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎著床的主要因素。胚胎著床被認(rèn)為是特殊的同種異體基因移植，若子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞數(shù)量或者功能紊亂，母體可能對胚胎產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致種植失敗。

近年來母-胎免疫平衡的研究熱點多集中在NK細(xì)胞、Th1/Th2及Th17/Tregs細(xì)胞平衡：外周血NK細(xì)胞約占外周血淋巴細(xì)胞的5%～10%，具有較高的細(xì)胞毒性，對胚胎著床起消極作用。子宮NK細(xì)胞(uNK cell)為子宮內(nèi)膜的主導(dǎo)免疫細(xì)胞，可分泌一些細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子等)，促進(jìn)血管生成、滋養(yǎng)層浸潤、增加子宮動脈血流、促進(jìn)胎盤發(fā)育，對妊娠起積極作用。RIF患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量增多，uNK細(xì)胞數(shù)量減少[2]。在胚胎種植窗口期，輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1、Th2、Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs 細(xì)胞)對母胎免疫起重要作用。Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生促炎因子,如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)，可增加血栓形成風(fēng)險、抑制滋養(yǎng)細(xì)胞生長，不利于胚胎植入。Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10，抑制Th1細(xì)胞作用，與良好的妊娠結(jié)局相關(guān)。RIF患者和既往自然流產(chǎn)患者體內(nèi)Th1/Th2增高[3]。Th17細(xì)胞可引起免疫性損傷、感染和炎癥，參與母-胎界面的免疫排斥反應(yīng)。Tregs細(xì)胞則具有免疫抑制功能，可分泌多種免疫抑制因子，如IL-9、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)，對抗Th17的細(xì)胞效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。Tregs 細(xì)胞數(shù)量減少或 Th17/Tregs 比值升高，可作為RIF患者妊娠結(jié)局的預(yù)測因素[4]。在分子水平上，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF)、整合素avβ3、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等均對子宮內(nèi)膜容受性的建立起重要作用[5]。

目前，多種免疫治療方法可用于改善 RIF 患者子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局。常用方法：免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A等)、免疫調(diào)節(jié)劑(羥氯喹、靜脈注射球蛋白等)、抗凝治療(阿司匹林、低分子肝素等)、宮腔灌注(粒細(xì)胞集落刺激因子、人絨毛膜促性腺激素、外周血單個核細(xì)胞、富血小板血漿、生長激素)等。宮腔灌注為一種局部給藥方式，可提高子宮局部的藥物濃度。本文就宮腔灌注藥物改善部分RIF患者妊娠結(jié)局的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)

HCG是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，參與妊娠的眾多環(huán)節(jié)：黃體維持與孕酮生成、血管生成、胚胎著床、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖分化及母胎界面的免疫調(diào)節(jié)[6]。近年來多項研究表明，宮腔灌注HCG可改善RIF患者的妊娠結(jié)局，但存在爭議。Gao等[7]的Meta分析表明,宮腔灌注HCG可提高胚胎著床率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率。宮腔灌注HCG的最佳時機為卵裂期胚胎移植前5～12 min，HCG的給藥劑量不少于500 IU，可顯著改善持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率[8]。Mansour 等[9]首次在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中證明，宮內(nèi)注射500 IU HCG在統(tǒng)計學(xué)上顯著提高了IVF/ICSI的著床率和妊娠率，而給予宮內(nèi)注射100 IU或200 IU HCG的不孕患者的妊娠結(jié)局并沒有改善。HCG改善妊娠結(jié)局的作用機制可能為：HCG在子宮內(nèi)膜表面與同源受體絨毛膜促性腺激素受體結(jié)合，促進(jìn)VEGF、LIF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，子宮內(nèi)膜血管生成增加，抑制宮腔內(nèi)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(IGF-BP-1)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)的表達(dá)[10]。接受宮腔灌注HCG的RIF患者，母-胎界面的Tregs細(xì)胞百分比增加，降低母體對胚胎的排斥反應(yīng)，且HCG可調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，也可作為uNK細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子。自體外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)可提高子宮內(nèi)膜容受性，改善妊娠結(jié)局，HCG可用于PBMC的活化，增強PBMC的作用。給予RIF患者宮腔灌注HCG，其胚胎種植窗口期的血清孕酮水平明顯升高，提高胚胎種植窗口期的子宮內(nèi)膜容受性、胚胎種植率及臨床妊娠率[11]。胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的HCG在凍融胚胎過程中可能會有部分損失，因此是否于胚胎解凍周期行宮腔灌注HCG更有意義值得探討。注射用HCG本身很少發(fā)生不良反應(yīng)，偶有惡心嘔吐、腹痛、過敏性皮疹，其安全性尚可[12]。關(guān)于宮腔灌注HCG的適應(yīng)證、改善子宮內(nèi)膜容受性、妊娠結(jié)局的有效性及遠(yuǎn)期安全性仍有待進(jìn)一步研究。

2 自體外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)

外周血單個核細(xì)胞由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等組成。這些細(xì)胞可以產(chǎn)生許多細(xì)胞因子及趨化因子，提高子宮內(nèi)膜容受性。2006年，Yoshioka等[13]首次發(fā)現(xiàn)宮腔灌注自體PBMCs可提高反復(fù)種植失敗患者的著床率和臨床妊娠率。有動物實驗表明，胚胎著床障礙組小鼠的LIF和VEGF的表達(dá)與正常妊娠組相比均顯著降低，給予胚胎著床障礙組小鼠宮腔灌注PBMCs后，子宮內(nèi)膜上LIF和VEGF的表達(dá)均升高[13]。Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在解凍周期移植前2 d給予實驗組的RIF患者宮腔灌注0.4 ml PBMCs培養(yǎng)液，其臨床妊娠率明顯高于對照組(34.4%vs. 23.4%)。宮腔灌注后IL-6水平明顯升高，TNF-α水平明顯降低，且子宮內(nèi)膜細(xì)胞上LIF及整合素avβ3表達(dá)增高[13]。宮腔灌注PBMCs改善妊娠結(jié)局的機制可能是:使一些細(xì)胞因子發(fā)生變化，調(diào)節(jié)機體Th1/Th2平衡；促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移、血管形成，利于胚胎種植。對3次以上植入失敗的患者，宮腔灌注PBMCs可改善其胚胎著床率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率。對于種植失敗次數(shù)<3次的IVF患者，宮腔灌注PBMCs并不能明顯改善活產(chǎn)率[15]。相對于皮下注射受孕者丈夫或其他人PBMCs，宮腔灌注自體外周血單個核細(xì)胞無注射部位疼痛、全身排斥反應(yīng)，感染風(fēng)險低，來源簡單，安全，更易被接受[16]。目前關(guān)于PBMCs治療后不良反應(yīng)的相關(guān)研究較少，暫無重大不良事件報道，其安全性還需大量臨床試驗來檢驗。

3 粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)

G-CSF可由骨髓細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等特異性造血細(xì)胞產(chǎn)生，一些非造血細(xì)胞也可表達(dá)G-CSF受體，如內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和顆粒黃體細(xì)胞[17]。RIF患者及薄型子宮內(nèi)膜患者由于子宮內(nèi)膜功能紊亂，其本身產(chǎn)生G-CSF的能力被削弱。宮腔灌注G-CSF可作為一種新型免疫治療方法，對子宮內(nèi)膜起免疫調(diào)節(jié)作用，改善子宮內(nèi)膜容受性，因此在RIF患者的治療中受到越來越多的關(guān)注。一項隨機對照試驗表明，在使用HCG促進(jìn)卵子最終成熟及排卵前每日對實驗組RIF患者宮腔灌注G-CSF 30 mIU 1次，對照組給予生理鹽水，結(jié)果顯示,接受宮腔灌注G-CSF的RIF患者每周期的臨床妊娠率均高于對照組(37.8%vs. 26.75%,P=0.137)[18]。在Xie 等[19]研究的動物實驗中，給予大鼠一側(cè)宮角灌注95%乙醇誘導(dǎo)其子宮內(nèi)膜變薄，再給予大鼠宮腔灌注30 μg/kg的G-CSF后，大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白-19(Cytokeratin 19,CK19)、波形蛋白(Vimentin,Vim)、VEGF及LIF表達(dá)增加，子宮內(nèi)膜厚度增加。宮腔灌注G-CSF改善妊娠結(jié)局的機制可能為：使Th1/Th2與Th17/Treg向Th2及Treg轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生免疫耐受；宮腔灌注G-CSF可使VEGF表達(dá)增加，促進(jìn)胚胎血管生成，增加子宮內(nèi)膜厚度；可能抑制外周血NK細(xì)胞的數(shù)量和功能，對子宮內(nèi)膜容受性起正向調(diào)節(jié)；上調(diào)子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物的表達(dá)如LIF、整合素avβ3等[20-21]。給予RIF患者皮下注射G-CSF同樣可提高胚胎種植率及臨床妊娠率。一項Meta分析提示：皮下注射G-CSF對RIF患者妊娠結(jié)局的影響明顯優(yōu)于宮腔灌注。有研究表明，宮腔灌注G-CSF聯(lián)合皮下注射G-CSF相較于單純皮下注射G-CSF更能顯著提高RIF患者的臨床妊娠率及活產(chǎn)率[22-23]。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的不良反應(yīng)普遍較輕微，如注射30 min內(nèi)的發(fā)熱、頭痛、骨骼肌肉酸痛、食欲不振、一過性肝功能異常、過敏樣反應(yīng)等，可自行緩解。罕見反應(yīng)有變態(tài)反應(yīng)、支氣管痙攣、心力衰竭等。宮腔灌注G-CSF的藥物毒性和致畸性尚缺乏研究，但不能完全排除嚴(yán)重不良反應(yīng)的可能性[24]。目前針對RIF患者G-CSF的給藥方式、給藥時間、給藥劑量、給藥次數(shù)等的研究較少，暫無統(tǒng)一定論，尚需更多的研究為臨床應(yīng)用提供參考。

4 富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)

PRP是新鮮全血梯度離心后獲得的自體血液制品，其血小板濃度為普通血漿的4倍，富含多種生長因子和細(xì)胞因子，如VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、IGF-I、血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、IL-8等[25]。子宮內(nèi)膜環(huán)境中充滿大量生長因子受體。自2015年起，給予IVF患者宮內(nèi)輸注PRP的臨床試驗開展，結(jié)果顯示，接受宮腔灌注PRP治療后，患者子宮內(nèi)膜厚度增加，妊娠結(jié)局得到改善[26]。宮腔灌注PRP后，子宮內(nèi)膜欠佳的不孕婦女的子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜血管信號數(shù)量顯著增加，周期取消率降低[27]。在 Aghajanova等[28]的研究中，活化的PRP可最大程度促進(jìn)子宮內(nèi)膜所有細(xì)胞(子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞)的增殖和遷移。不論活化或非活化的PRP均在一定程度上增加了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1、MMP3、MMP7和MMP26的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生。第一次自體PRP注射于子宮內(nèi)膜黃體轉(zhuǎn)化日前3天，每隔3 d可重復(fù)1次，宮腔灌注最大次數(shù)僅限于3次。宮腔灌注PRP有助于促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，增加子宮血流，并緩解子宮內(nèi)膜炎，改善子宮內(nèi)膜容受性，不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。經(jīng)PRP治療后不良反應(yīng)主要為發(fā)熱、短暫性水腫、瘙癢、疼痛等。所有癥狀都是輕微的，可自我緩解，無嚴(yán)重不良事件發(fā)生[29]。目前，PRP細(xì)胞和分子水平上的研究和基礎(chǔ)研究仍較少，具體作用機制仍需大量研究闡明。

5 生長激素(Growth hormone,GH)

GH 是垂體前葉分泌的一種由191 個氨基酸組成的肽類激素，具有調(diào)節(jié)生長、新陳代謝和繁殖的生理功能。生長激素在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要用于改善卵巢功能，提高卵子質(zhì)量。近年研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上也存在GH受體和IGF-1的表達(dá)[30]。宮腔灌注GH后，子宮內(nèi)膜厚度與子宮內(nèi)膜容積明顯增加，A型(三線型)及B型(等回聲型)子宮內(nèi)膜比例增高，子宮內(nèi)膜血流阻力降低，血流增加，能改善子宮內(nèi)膜容受性，提高薄型子宮內(nèi)膜患者的胚胎著床率及臨床妊娠率[31]。GH改善子宮內(nèi)膜容受性及IVF妊娠結(jié)局的機制尚不清楚，可能直接或通過IGF-1介導(dǎo)促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖及血管生成，并上調(diào)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的基因表達(dá)，如VEGF和整合素β3。在動物實驗中經(jīng)GH治療的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞LIF、整合素avβ3和子宮內(nèi)膜中的MMP-9表達(dá)增加[31-32]。Sbracia等[33]發(fā)現(xiàn)，GH在黃體功能不足的女性子宮內(nèi)膜上的表達(dá)降低，提示GH在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)可能與孕激素有關(guān)[34]。GH增加子宮內(nèi)膜厚度、提高臨床妊娠率的積極效應(yīng)對于年齡≥35 歲的不孕婦女更顯著，也可能是通過提高卵母細(xì)胞質(zhì)量達(dá)到了積極的臨床效應(yīng)[35]。目前研究表明，RIF患者、薄型子宮內(nèi)膜患者及年齡較大的正常反應(yīng)者可能從GH治療中受益。肌注 GH或?qū)m腔灌注GH均可促進(jìn)子宮內(nèi)膜的再生和修復(fù),增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率,宮腔灌注GH的治療效果優(yōu)于皮下注射GH[36]。重組人生長激素治療的不良反應(yīng)有水鈉潴留，如眼瞼及顏面浮腫水腫、關(guān)節(jié)炎、糖耐量異常、甲狀腺功能低下、股骨頭滑脫、脊柱側(cè)彎、色素痣、腺樣體肥大、手腳變大等。目前尚無證據(jù)表明生長激素治療會增加新發(fā)腫瘤或腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險，不會導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生[37]。目前針對GH的兩種給藥方式、基礎(chǔ)研究及作用機制研究較少，且對于患者及其后代的長期安全性仍需進(jìn)一步研究及說明。

6 干細(xì)胞療法

干細(xì)胞是一類具有無限自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞，具有發(fā)育的全能性，在醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用上存在免疫排斥及倫理爭議。成體干細(xì)胞具有來源廣泛、低免疫原性、倫理爭議少等特點。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成體干細(xì)胞的重要類型，是目前研究的熱點，在基質(zhì)細(xì)胞再生、母-胎界面血管生成和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[38]。許多研究已經(jīng)在子宮內(nèi)膜基底層和功能層中發(fā)現(xiàn)了子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。HOXA10基因在胚胎著床和子宮內(nèi)膜蛻膜化中發(fā)揮重要作用。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)注入薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型的宮腔內(nèi)，大鼠的子宮內(nèi)膜厚度增加，子宮內(nèi)膜上波形蛋白、細(xì)胞角蛋白、整合蛋白β3、LIF等表達(dá)增加，提示宮腔注入BMSCs可改善薄型子宮內(nèi)膜，可能由于miR-196b對HOXA10基因起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，HOXA10進(jìn)一步促進(jìn)VEGF、LIF及整合素avβ3的表達(dá)[38-39]。有研究對反復(fù)種植失敗的婦女進(jìn)行了宮腔內(nèi)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Endometrial mesenchymal stem cells,eMSC)移植，子宮內(nèi)膜厚度由(5.20±1.24)mm增厚至(9.93±0.77)mm，臨床妊娠率達(dá)79.31%[40]。間充質(zhì)干細(xì)胞可能抑制NK細(xì)胞的增殖和功能，其釋放的前列腺素E2通過上調(diào) Treg細(xì)胞比例、抑制Th1細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)[41]。由于干細(xì)胞強大的增殖分化潛能，且具有低免疫原性、廣譜性，為薄型子宮內(nèi)膜及不孕患者帶來新的希望，但其有效性、安全性、體外誘導(dǎo)和定向增殖所面臨的技術(shù)問題，仍需深入研究。

7 肉毒桿菌毒素A(Botulinum toxin A，BoTA)

肉毒素是一種肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，有A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型7種分型。A型肉毒素既不透過血腦屏障，也不能穿透皮膚，安全且耐受良好，已被廣泛用于整形外科和重建外科等領(lǐng)域。Park等[42]研究發(fā)現(xiàn)，給予BoTA處理的大鼠，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor 1-alpha,HIF-1α)及VEGF的表達(dá)增加，促進(jìn)血管生成。最近研究發(fā)現(xiàn)，BoTA可增加子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平，如整聯(lián)蛋白β3、HIF-1α、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)、vim等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[43]。同時，經(jīng)BoTA治療后，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)標(biāo)志物整合素avβ3、LIF表達(dá)水平增加。適宜濃度的BoTA治療不會誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性或異常細(xì)胞增殖。對子宮內(nèi)膜容受性降低的RIF患者，BoTA有望成為一種安全有效的治療方案。

8 展望

目前，反復(fù)種植失敗的病因、機制尚未完全闡明，一部分患者受益于文中提及的各種治療及新興技術(shù)，但仍有部分患者療效甚微。PRP、PBMC、G-CSF和HCG是4種最常用的宮內(nèi)輸注療法，臨床使用率最高，療效較好。GH研究較少，效果不確切。干細(xì)胞是近年來的研究熱點，干細(xì)胞治療在臨床實踐中尚未被廣泛采用，因其具有侵入性及治療成本昂貴，但骨髓活檢和細(xì)胞存儲，對于部分難治性病例可能成為一種非常具有前景的選擇。也有部分研究表明，宮腔灌注地塞米松、環(huán)孢素A、BoTA等對胚胎著床起負(fù)面作用。總之，宮腔灌注藥物可能提高反復(fù)種植失敗患者妊娠率及活產(chǎn)率，這種對妊娠結(jié)局的積極作用也可能是由于宮腔灌注操作本身對子宮造成局部損傷誘發(fā)。目前，免疫療法的適應(yīng)證、劑量、療程以及療效等尚無大樣本的RCT研究支持，在常規(guī)用于臨床實踐之前，仍需大量的隨機對照試驗支持。