趙原鋒 任貴云

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是一種常見的惡性腫瘤，2020年全球發(fā)病率約為4.6%。隨著基礎(chǔ)及臨床研究的進一步深入，頭頸鱗癌的治療手段較以前更加豐富，但5年生存率仍有待提高。這主要是由于大多數(shù)頭頸鱗癌患者早期沒有明顯的臨床癥狀，且此癌種易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，患者確診時往往已至中晚期。因此臨床上迫切需要一種新的早期診斷、治療靶點。隨著遺傳學的研究，有別于傳統(tǒng)遺傳學的表觀遺傳逐漸被人們所重視，表觀遺傳是指在不改變DNA核苷酸序列的情況下引起基因表達的可遺傳性改變，其與生命發(fā)展的各個過程都息息相關(guān)[1]。自20世紀70年代末期在信使RNA（messenger RNA，mRNA）中發(fā)現(xiàn)了N6-甲基腺苷（N6-Methyladenosine，m6A甲基化），RNA甲基化的研究便逐漸成為研究的熱點，有研究發(fā)現(xiàn)m6A作為真核細胞最常見的RNA甲基化，參與了許多的生物學進程，包括mRNA的穩(wěn)定、剪切、出核及翻譯效率等[2]?，F(xiàn)已證明，多種腫瘤m6A甲基化水平較對照組有顯著差異，并且m6A甲基化可以直接或間接調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列生物學進程[3]。本文旨在簡述m6A甲基化對常見惡性腫瘤多種表型的影響以及目前頭頸鱗癌中m6A甲基化的研究進展。

一、m6A甲基化修飾關(guān)鍵酶

m6A修飾是指RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生的甲基化。近些年，隨著檢測手段的發(fā)展，m6A的研究逐漸成為表觀遺傳學的熱點，目前針對m6A甲基化的研究主要集中于mRNA。大量研究表明m6A甲基化特異性的富集于終止密碼子和3’端非編碼區(qū)的固定片段中（RRACH）。除此之外，其他類型RNA同樣存在m6A甲基化的身影。作為真核細胞RNA上最常見的甲基化修飾，m6A甲基化參與了細胞的多種生物學行為，這是一個高度特異性、動態(tài)的、可逆的生物學過程，并涉及三類酶：甲基化轉(zhuǎn)移蛋白（writer）、去甲基化蛋白（eraser）和識別蛋白（reader）。

1.甲基化轉(zhuǎn)移蛋白（writer）

在mRNA中，大部分的m6A甲基化修飾是由甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶3（N6-methyladenosine methyltransferase3，METTL3）和甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶14（N6-methyladenosine methyltransferase14，METTL14）組成的多亞基復(fù)合物以高度特異性的方式添加到序列中，少量的m6A甲基化修飾由甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶16（N6-methyladenosine methyltransferase16，METTL16）催化形成。目前多認為METTL3和METTL14為甲基化轉(zhuǎn)移蛋白的核心蛋白。但是METTL3和METTL14在甲基化過程中的具體交互機制尚不明確，現(xiàn)主要認為METTL3和METTL14共同組成二聚體，其中METTL14是METTL3的變構(gòu)活化劑，單獨的METTL14不具備催化能力[4]。但也有人發(fā)現(xiàn)，敲除METTL3后，細胞的m6A甲基化修飾仍然存在[5]。而甲基化過程中的特異性主要在于維爾姆腫瘤1相關(guān)蛋白（Wilms’tumour 1-associating protein，WTAP為METTL3-METTL14二聚體提供“定位”服務(wù)，使二聚體在細胞核內(nèi)特異性的識別RRACH序列并發(fā)揮功能。

2.去甲基化蛋白（eraser）

目前發(fā)現(xiàn)的去甲基化蛋白酶主要為肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和AlkB同源蛋白5（AlkBhomologue5，ALKBH5），兩者之間有較遠的同源性，其中FTO是首個發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶。但FTO特異性較差，其與N6,2＇-O-二 甲 基 腺 苷（N6,2＇-O-dimethyladenosine，m6Am）修飾的反應(yīng)速率是其與m6A甲基化修飾的100倍，并發(fā)現(xiàn)FTO可能通過影響小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）的m6Am甲基化修飾，調(diào)控剪切過程[6]。ALKBH5是第二個發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，與FTO不同，ALKBH5與m6Am甲基化修飾無反應(yīng)，特異性較好。其主要存在于細胞核中，暗示其主要在核內(nèi)調(diào)控RNA的生物學過程[7]。

3.識別蛋白（reader）

m6A甲基化修飾對mRNA的影響主要是通過識別蛋白（reader）來實現(xiàn)，分為直接閱讀器和間接閱讀器。目前的研究主要集中于前者，包括含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白家族、METTL3和真核翻譯起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3），YTH家族蛋白主要分為YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTH domain-containing protein，YTHDC）1/2、YTH結(jié)構(gòu)域同源蛋白（YTH domain-containing family protein，YTHDF）1/2/3五種，其中DC1位于細胞核，而DF1/2/3位于細胞質(zhì)，DC2既可位于細胞核也可位于細胞質(zhì)[8]。研究發(fā)現(xiàn)他們的功能各不相同：DC1優(yōu)先結(jié)合非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）中的m6A位點，并影響mRNA的剪切與出核；DC2和DF3影響mRNA翻譯與降解；DF1優(yōu)先結(jié)合細胞質(zhì)中mRNA的m6A位點并促進mRNA的翻譯；DF2可以通過p結(jié)構(gòu)促進mRNA的降解；METTL3可以和eIF3在細胞質(zhì)中與mRNA 5＇UTR中m6A位點結(jié)合促進mRNA翻譯效率[9]。

而間接閱讀器，通過一種被稱作“m6A開關(guān)”的機制影響目的RNA的生物學功能[10]，即m6A甲基化程度高的RNA結(jié)構(gòu)上更趨向于線性，更利于RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，導(dǎo)致間接閱讀器被動地募集到RNA附近并與之結(jié)合，參與調(diào)控RNA的剪切、出核等過程，包括異質(zhì)性胞核核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC）和新發(fā)現(xiàn)的胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP）家族，其中HNRNPC優(yōu)先結(jié)合ncRNA，并可能與mRNA上的m6A結(jié)合影響其剪切[11]；IGF2BP家族同m6A結(jié)合力較弱，結(jié)合后可以增加m6A mRNAs的穩(wěn)定性[12]。

二、m6A甲基化對腫瘤多種表型的影響

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細胞失去極性和細胞間連接向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，這個過程增加了細胞的活動性，并促進了侵襲性表型的發(fā)展。整個過程受到EMT轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控，主要包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（snail family zinc finger 1，snai1）、Twist相關(guān)蛋白（Twist related protein，TWIST）和鋅指結(jié)合蛋白（Zinc-finger E-box binding homeobox，ZEB）家族。這些轉(zhuǎn)化因子在癌癥增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中均有重要作用。盡管目前對于EMT的認識存在一定的爭議，但肯定的是，EMT在促進腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖、侵襲中具有重要作用[13]。

目前的研究證明，通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)mRNA的m6A甲基化修飾水平可以影響其生物學進程。在Hela細胞中，Lin X等人的研究表明[14]，EMT過程中m6A水平會升高，人為降低細胞m6A水平會抑制腫瘤細胞遷移、侵襲和EMT，進一步通過體外RIPPCR實驗發(fā)現(xiàn)，甲基化識別酶YTHDF1可以特異性的識別EMT調(diào)控因子Snai1 mRNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)m6A甲基化位點，并隨著甲基化水平降低，減少真核翻譯延伸因子2（eukaryotic translation elongation factor 2，eEF-2）與mRNA的結(jié)合，從而降低Snai1 mRNA的蛋白翻譯延伸效率，間接影響腫瘤遷移、侵襲和EMT。Li J等人的研究得出了相似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)敲除METTL3可以增加轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）mRNA的表達量，延長mRNA半衰期，減短蛋白質(zhì)半衰期，減少LTBPs（TGF-β前置物），抑制TGF-β激活，抑制TGF-β的自身誘導(dǎo)自身效應(yīng)，最終抑制EMT過程[15]。而在肺癌中，敲除METTL3會降低EMT調(diào)控因子JUNB的mRNA表達、m6A甲基化修飾以及mRNA的半衰期，從而抑制腫瘤增殖、遷移、侵襲和EMT[16]。在卵巢癌中，敲除METTL3會降低EMT調(diào)控因子AXL受體酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase，AXL）的甲基化水平并抑制其mRNA表達，并發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)中的METTL3可以促進AXL的蛋白翻譯效率，從而間接調(diào)控卵巢癌EMT[17]。在胃癌中，CDH1的表達降低與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、惡性程度上升、預(yù)后不良相關(guān)[18]。最新的研究證明，METTL3在體外可以上調(diào)鋅指MYM1型（zinc finger MYM-type 1，ZMYM1）mRNA的甲基化并通過閱讀器RNA結(jié)合蛋白人類抗原R（human antigen R，HuR）增強mRNA穩(wěn)定性，最終ZMYM1通過募集CtBP/LSD1/CoREST復(fù)合物抑制CDH1啟動子的活性，從而促進胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[19]。

除了侵襲、轉(zhuǎn)移、EMT，m6A甲基化同樣影響腫瘤的糖酵解、血管形成及放化療耐藥性等多個生物學過程。Qiang W等人發(fā)現(xiàn)[20]，在胃癌中，m6A甲基化酶METTL3表達量較正常組織上升且提示不良預(yù)后，體外實驗發(fā)現(xiàn)METTL3可以提升肝癌源性生長因子（hepatoma-derived growth factor，HDgF）mRNA的m6A甲基化水平，之后閱讀器IGF2BP3同HDgF mRNA上的甲基化位點直接結(jié)合，增強mRNA穩(wěn)定性，最終核內(nèi)的HDgF通過激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（insulin-responsive glucose transporter 4，GLUT4）和烯醇酶2（enolase 2，ENO2）來促進糖酵解；分泌的HDgF蛋白則促進腫瘤的血管生成。在放化療藥物抗藥性的研究中，m6A甲基化的調(diào)控作用同樣重要。目前已經(jīng)證實m6A甲基化可以通過調(diào)控m6A甲基化位點變異、mRNA穩(wěn)定性、mRNA翻譯、ncRNA甲基化水平等方式影響腫瘤對放化療抗藥性[21]。

總的來說m6A甲基化對腫瘤各種表型的影響起始于甲基化酶和去甲基化酶動態(tài)調(diào)控關(guān)鍵RNA的甲基化水平。接著直接閱讀器與m6A位點直接結(jié)合調(diào)控mRNA的降解、出核、翻譯等過程；或者間接閱讀器通過“m6A開關(guān)”機制影響目的RNA的生物學功能。最終與關(guān)鍵RNA相關(guān)生物學過程，如侵襲、轉(zhuǎn)移、EMT、糖酵解、血管形成、放化療抗藥性等，均會受到影響。

三、m6A甲基化修飾在頭頸鱗癌中的研究進展

頭頸鱗癌是第六大常見腫瘤。隨著免疫療法、手術(shù)、放化療等綜合療法的發(fā)展，頭頸鱗癌的治療較以前已有長足的發(fā)展，但頭頸鱗癌的5年生存率仍不容樂觀，因此，繼續(xù)探究HNSCC腫瘤內(nèi)在機制可能有助于臨床治療策略的制訂以及相關(guān)藥物的開發(fā)。表觀遺傳學研究表明，m6A甲基化在多種腫瘤生長過程中具有重要作用。目前，針對HNSCC的m6A甲基化研究較其他惡性腫瘤少，但仍可以看出m6A甲基化對HNSCC的調(diào)控作用。因此下文將對m6A甲基化調(diào)控HNSCC多種表型的內(nèi)在機制做出討論。

多篇生信研究顯示，m6A相關(guān)基因與HNSCC腫瘤有著千絲萬縷的聯(lián)系。根據(jù)不同的研究方法及待選基因，得出的關(guān)鍵基因有所不同。Zhao X等人分析得出WTAP和METTL14可能是m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子相互作用網(wǎng)絡(luò)的中樞基因[22]。這與其他惡性腫瘤的研究相一致。另一篇研究則認為HNRNPC同樣是關(guān)鍵基因之一[23]。這與Huang G Z等人的觀點不謀而合，他們同樣認可HNRNPC的重要性，并通過體外實驗證實：HNRNPC的過表達會加速口腔鱗癌的EMT過程[24]。但遺憾的是，這篇文章并沒有給出HNRNPC-EMT通路的具體交互機制，這是需要進一步探究的問題。以上結(jié)論暗示我們隨著m6A甲基化的增多不利于HNSCC腫瘤的預(yù)后，但Zhang Y等人得出了相反的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)FTO通過去甲基化鈣粘蛋白相關(guān)蛋白1（cadherinassociated protein beta 1，CTNNB1）使得mRNA穩(wěn)定性增強，間接調(diào)控HNSCC EMT，從而導(dǎo)致預(yù)后不良、腫瘤細胞增殖和遷移[25]。從結(jié)論上來看，一方觀點認為甲基化過程會促進HNSCC的EMT，另一方則認為去甲基化會促進HNSCC的EMT，表面上看是矛盾的，但筆者推測：①由于部分m6A調(diào)控酶并非特異性的只與m6A甲基基團發(fā)生反應(yīng)，存在調(diào)控酶與關(guān)鍵mRNA或蛋白直接發(fā)生作用的可能[26]，例如體外實驗證明METTL3除了調(diào)控RNA甲基化，還可以在細胞質(zhì)內(nèi)直接結(jié)合mRNA調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯過程[17]?；蛘{(diào)控酶除了參與甲基化的調(diào)控，還有其他的生物學功能，例如FTO的發(fā)現(xiàn)是由于其參與了脂代謝。因此針對調(diào)節(jié)酶的研究存在許多“干擾結(jié)果”。②我們對m6A甲基化的了解并不全面，它是通過何種機制來調(diào)控mRNA的穩(wěn)定、半衰期；如何影響蛋白質(zhì)的翻譯；相同甲基化酶對不同惡性腫瘤產(chǎn)生不同的作用結(jié)果是因為什么（在胃癌中，METTL3可以促進癌癥[19]，在肝癌中，METTL3和METTL14則抑制癌癥[29]）；在這個動態(tài)的過程中，甲基化和去甲基化好像博弈雙方，此消彼長中究竟誰在主導(dǎo)，我們知之甚少。③目前對m6A的研究多集中于mRNA，而其他類型RNA同樣存在m6A甲基化，已經(jīng)有研究證明ncRNA同樣通過m6A甲基化機制調(diào)控腫瘤的生長。

隨著研究的深入，越來越多的m6A相關(guān)調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)，例如：mRNA結(jié)合蛋白IGF2BP2被發(fā)現(xiàn)其與多種生命活動相關(guān)，起初僅發(fā)現(xiàn)其對腫瘤的促進作用，但目前已經(jīng)證明，IGF2BP家族的蛋白質(zhì)是一種m6A閱讀器，可以通過改變mRNA的穩(wěn)定性而發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長的作用[30]。在鼻咽癌中，IGF2BP2可以識別由METTL3調(diào)控的Snai1甲基化位點，并降低Snai1的蛋白質(zhì)水平，最終促進腫瘤的EMT進程[31]。而在OSCC中，METTL3可以增加B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1（BMI1 proto-oncogene，BMI1）mRNA 3＇-UTR的m6A修飾，并與IGF2BP1結(jié)合，促進OSCC中BMI1的翻譯[32]。最近的研究表明，IGF2BP2可以識別EMT關(guān)鍵基因鋅指轉(zhuǎn)錄因子2（snail family zinc finger 2，Slug）的m6A位點并改變Slug mRNA的穩(wěn)定性，間接調(diào)控腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[33]。這表明IGF2BP家族在HNSCC腫瘤的重要性[34]。

Li WC等人的研究顯示，頭頸鱗癌中己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）表達量較正常組織的大幅上升，導(dǎo)致腫瘤細胞糖酵解、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學進程的活躍，并發(fā)現(xiàn)HK2的下調(diào)可以降低HNSCC對化療藥物的耐藥性[35]。另一個糖酵解關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）在HNSCC中同樣上調(diào)[36]。同時，已有體內(nèi)體外實驗證明，METTL3可以識別HK2 mRNA 5＇/3＇UTR區(qū)甲基化位點，并通過IGF2BP2或IGF2BP3提高RNA穩(wěn)定性，從而調(diào)控腫瘤的糖酵解[37]。雖然目前沒有針對m6A甲基化與HNSCC糖酵解之間關(guān)系的研究，但可以預(yù)見，m6A甲基化很有可能通過調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶影響HNSCC代謝、糖酵解、化療藥物耐藥性等過程。

除了mRNA，環(huán)狀RNA（circRNA）通過競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機制同樣影響腫瘤的生長，例如circRNA CDR1as通過ceRNA機制負調(diào)控miR-7-5p來促進鼻咽癌細胞的生長和糖代謝[38]。而我們對circRNA m6A修飾的研究剛剛起步。有研究發(fā)現(xiàn)circCUX1在對放射治療不敏感的HPSCC患者中上調(diào)，而進一步試驗證明，METTL3介導(dǎo)circCUX1的m6A甲基化從而延長circCUX1的半衰期，接著circCUX1與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase1）結(jié)合并抑制其表達，導(dǎo)致炎癥因子釋放減少，從而產(chǎn)生了放射治療抗性[39]。

隨著對m6A甲基化研究的深入，其在HNSCC中的關(guān)注度逐漸上升。進一步探索這種表觀遺傳調(diào)控腫瘤模型有助于開發(fā)新的HNSCC診斷/治療靶點，而這也是目前臨床上面對HNSCC的難點。證據(jù)表明，m6A甲基化與HNSCC的多個生物學進程有關(guān)，但這些結(jié)果間是否具有相關(guān)性目前尚不清楚，但可以肯定的是，m6A-EMT通路是HNSCC發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的一個重要機制，針對此處的進一步研究是十分必要的。除此之外，目前研究多集中于編碼蛋白的mRNA，而ncRNA鮮有涉及，但先前的研究證明ncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳修飾通過多種信號通路在HNSCC中發(fā)揮重要作用，因此全面了解m6A甲基化不應(yīng)局限于已知的m6A相關(guān)酶。