姚經(jīng)經(jīng) 黃晗丹 喻錦鈴 高 穎 張惠利 劉志輝

牙髓病是口腔疾病中發(fā)病率較高的一類疾病，主要包括可復性牙髓炎、不可復性牙髓炎和牙髓壞死。牙髓是位于牙髓腔內(nèi)的富含細胞、神經(jīng)和血管的疏松結締組織，具有形成、營養(yǎng)、感覺和防御的功能[1]。當細菌感染、物理或化學刺激導致牙髓組織發(fā)生炎癥反應、壞死甚至進一步累及根尖區(qū)組織時，牙髓便喪失了生理功能，并出現(xiàn)劇烈疼痛、牙根發(fā)育停止、根尖區(qū)骨吸收等臨床癥狀，最終造成牙齒的缺失。如何有效地促進受損牙髓的恢復和功能性牙髓的再生成為牙髓治療的熱點和難點。

濃縮生長因子（concentrated growth factor,CGF）是從自體血液中提取的最新一代血小板濃縮物，有良好的生物相容性和生物安全性，多孔的纖維蛋白網(wǎng)絡中鑲嵌著豐富的生長因子和細胞成分，是一種理想的生物支架和生長因子儲存庫，廣泛用于骨、神經(jīng)、血管、肌肉、上皮等組織的修復和再生[2，3]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)CGF在牙髓治療中具有重要作用。本文就CGF的生物學特性及其在牙髓病不同發(fā)展階段中的作用和機制進行綜述。

一、CGF的生物學特性

CGF是將血液樣品變速離心后獲得的淡黃色、不透明且富有彈性的纖維蛋白凝膠，在肉眼下類似于富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF），但其拉伸強度更高；與PRF相比，電鏡下CGF的纖維蛋白有著更規(guī)則、致密的網(wǎng)絡結構，生長因子和細胞成分也更穩(wěn)定，同時具有良好的粘附性[4]。致密的纖維蛋白網(wǎng)絡不僅為嵌入內(nèi)部的細胞和生長因子提供保護，使其釋放接近生理模式，并且還為細胞遷移和增殖提供三維空間和機械支持[5]。變速離心增加了血小板碰撞幾率，激活后釋放出大量生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-basic,FGF-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）等[3]，調(diào)控細胞增殖、分化和膠原合成，抑制炎癥反應[6]，是CGF發(fā)揮作用的基礎。CGF中的細胞成分主要包括血小板、紅細胞、成纖維細胞樣細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞，可以產(chǎn)生細胞因子并調(diào)節(jié)其釋放，同時發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[7]。最新的研究發(fā)現(xiàn)CGF中可能還含有內(nèi)皮祖細胞[8]和多能干細胞[3]，具有良好的分化能力，參與血管和骨組織的形成。因此，CGF中的纖維蛋白網(wǎng)絡、生長因子和細胞成分三者協(xié)同作用，在組織修復和再生中有巨大的應用潛力。

二、CGF應用于活髓保存治療的作用與機制

當牙髓病變局限或可逆時，通常選用蓋髓術和牙髓切斷術，將蓋髓劑置于近髓牙本質(zhì)或露髓口，發(fā)揮抗菌活性的同時，刺激牙本質(zhì)中的生物活性分子釋放，驅(qū)動第三期牙本質(zhì)形成，以修復受損牙髓并保存正常牙髓組織[1]。但臨床上常用的蓋髓材料如氫氧化鈣、三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate,MTA），存在著細胞毒性、牙本質(zhì)橋形成缺陷、材料溶解和牙冠變色等缺點，因此有必要尋找一種更加安全、高效的新型蓋髓材料，最大限度地保留牙髓活力。

1.體外研究

CGF可以釋放多種生長因子，創(chuàng)造一種修復微環(huán)境，是潛在的蓋髓材料。其中發(fā)揮作用的生長因子主要有TGF-β1、VEGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic proteins,BMP-7），調(diào)節(jié)炎癥反應，刺激牙源性干細胞增殖及成牙本質(zhì)向分化，誘導牙髓牙本質(zhì)復合體的形成[9]。Tian等[10]發(fā)現(xiàn)，CGF在體外可以促進牙髓細胞粘附、增殖和遷移，上調(diào)牙髓細胞的成牙本質(zhì)向分化標志物水平,并通過骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2（bone morphogenetic proteins,BMP-2）/Smad5信號通路促進牙髓細胞的礦化。Dou等[11]將人牙髓細胞與CGF、氫氧化鈣、MTA、i Root BP plus等傳統(tǒng)蓋髓材料浸提液分別共培養(yǎng)后，顯示氫氧化鈣抑制牙髓細胞的增殖并促進其壞死和凋亡，有一定的細胞毒性，而CGF、MTA和i Root BP plus對牙髓細胞的遷移和礦化具有相似的促進作用，且CGF對牙髓細胞的促增殖作用更為顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與MTA[12]或者i Root BP plus[13]相比，CGF能調(diào)控人牙髓細胞的細胞周期，增加S期細胞百分比，減少細胞凋亡，顯著增加堿性磷酸酶、牙本質(zhì)涎磷蛋白、骨鈣蛋白等成骨/成牙相關基因表達水平，更有利于牙髓牙本質(zhì)復合體的形成。

2.體內(nèi)研究

在體內(nèi)實驗中，有學者將CGF、MTA和氫氧化鈣分別置于比格犬機械露髓的牙髓表面，3個月后各組牙髓斷面均形成了牙本質(zhì)橋，髓腔變窄，根管內(nèi)牙本質(zhì)層增厚，MTA和氫氧化鈣組的牙髓組織中纖維增生、充血，成牙本質(zhì)細胞消失，但CGF組的牙髓樣組織周圍可見排列規(guī)則的成牙本質(zhì)細胞和前期牙本質(zhì)的形成[10]，提示CGF有利于牙髓牙本質(zhì)復合體的再生。CGF用于活髓保存的臨床研究較少，但有系統(tǒng)評價[14,15]顯示，PRF等血小板濃縮物與MTA、氫氧化鈣在人體內(nèi)具有相似的蓋髓效果，成功率達88%～100%，臨床表現(xiàn)和影像學檢查均未見明顯異常。綜上所述，CGF用于活髓保存的體內(nèi)研究和臨床研究數(shù)量少，且各個實驗的異質(zhì)性高，難以進行統(tǒng)計學分析，需要大量的動物研究明確其在活髓保存治療中的作用效果，為臨床應用奠定基礎。

三、CGF應用于再生性牙髓治療的作用與機制

當牙髓病變是不可逆或無法修復時，臨床上通常選用根管治療，但根管治療后的牙齒由于缺少血管、神經(jīng)的滋養(yǎng)，牙體組織變脆，易折裂，且無感覺功能，而再生性牙髓治療旨在通過組織工程學原理，生成新的牙髓樣組織，恢復牙齒的生理功能，成為一種新的治療選擇。再生性牙髓治療的方法主要包括牙髓血運重建術、細胞移植技術和細胞歸巢技術。牙髓血運重建術是目前唯一用于臨床的牙髓再生技術，但再生組織為骨樣和牙周樣組織，并非真正意義上的牙髓再生[16]；細胞移植技術需要遵循復雜的干細胞選擇、擴增、儲存、運輸?shù)瘸绦?，存在病原體傳播和免疫排斥的風險，臨床應用較為困難；而細胞歸巢技術是利用生物信號分子使內(nèi)源性干細胞遷移、增殖和分化，可規(guī)避上述風險，易操作和實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[17]。

1.體外研究

CGF作為一種富含生長因子的天然支架，主要通過細胞歸巢的策略實現(xiàn)牙髓組織的再生。FGF-2是牙髓再生治療中研究最多的生長因子，已被證明參與牙髓組織修復和再生的所有階段，包括牙源性干細胞的遷移、增殖、細胞干性的維持以及血管和神經(jīng)形成，其中FGF-2通過BMP和Wnt信號通路調(diào)節(jié)牙源性干細胞的成牙本質(zhì)向分化；通過刺激血管內(nèi)皮細胞增殖及增強牙髓干細胞的特性以促進新生血管的形成；FGF-2不僅是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，還誘導牙髓干細胞分化為神經(jīng)元細胞，有利于神經(jīng)的修復和再生[18]。

促進牙髓再生的干細胞主要有牙髓干細胞和根尖乳頭干細胞[19]。Jin[20]等用不同濃度（5%、10%、20%、50%和80%）的CGF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓干細胞，發(fā)現(xiàn)CGF促進牙髓干細胞增殖且成劑量依賴性，但是較低濃度（10%和20%）的CGF對牙髓干細胞的遷移和礦化作用更為明顯，原因可能為高濃度的CGF中含有較多的炎癥因子從而產(chǎn)生了負性作用。Xu[21]等用脂多糖和CGF條件培養(yǎng)基共同培養(yǎng)牙髓干細胞，與對照組相比，CGF對炎癥狀態(tài)下的牙髓干細胞仍具有顯著的促增殖和遷移作用，并上調(diào)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、骨鈣蛋白等成牙/成骨相關基因水平，為臨床上牙髓炎癥時CGF的應用提供了理論支持。與牙髓干細胞相似，CGF對根尖乳頭干細胞的增殖、遷移同樣具有明顯的促進作用，上調(diào)堿性磷酸酶、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1等基因的表達[22，23]，提示當牙髓完全壞死缺乏牙髓干細胞時，CGF作用于根尖乳頭干細胞發(fā)揮功能。

改善局部缺血微環(huán)境和促進神經(jīng)形成是再生性牙髓治療的關鍵環(huán)節(jié)。CGF中富含VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等必要促血管生成因子和內(nèi)皮祖細胞樣細胞，有利于多種血管生成介質(zhì)的表達，增加毛細血管通透性，誘導內(nèi)皮細胞遷移、增殖和小管樣結構的形成[8，19]。分別用含有CGF和VEGF的內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓干細胞7天后，與二者單獨應用相比，CGF和VEGF聯(lián)合應用產(chǎn)生協(xié)同作用，形成了更為廣泛、成熟的小管樣結構[20]。Qin[24]等用CGF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)雪旺細胞，發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因和蛋白表達水平均提高約1.5倍，極大地促進了周圍神經(jīng)的功能性修復。因此，CGF不僅對牙源性干細胞具有趨化、增殖和成牙本質(zhì)向分化的作用，還可以促進血管和神經(jīng)的形成，為CGF在牙髓再生治療的體內(nèi)研究提供了理論基礎。

2.體內(nèi)研究

Xu[21]等將比格犬未成熟前牙摘除牙髓后，CGF導入根管，嚴密封閉，8周后拔除患牙，可見根管壁增厚，根尖正常閉合，根管內(nèi)新形成的牙髓樣組織不僅高表達VEGF和巢蛋白，其周圍還伴有柵欄狀排列的類成牙本質(zhì)細胞，提示功能性牙髓再生的可能。而Zhang[25]等將CGF和血凝塊分別導入人離體牙根管后，植于裸鼠皮下，結果顯示二者誘導的新生組織結構類似，CGF組的神經(jīng)纖維和血管數(shù)量更多，差異有統(tǒng)計學意義，但均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細胞及新生牙本質(zhì)，原因可能為皮下組織的微環(huán)境不利于牙本質(zhì)的形成。CGF能否再生功能性牙髓組織尚存爭議，需要更多高質(zhì)量的動物研究予以證明。

3.臨床研究

Wang[26]等報道了一例CGF用于年輕恒牙牙髓再生的臨床研究，徹底消除根管內(nèi)感染后，將CGF凝膠剪碎置于根管全段，然后用MTA嚴密封閉根管口，術后10個月根尖孔閉合，根尖區(qū)大面積暗影消失，但牙髓活力溫度測試無反應。最新的一項回顧性研究[27]總結了CGF和血凝塊用于因外傷導致牙髓壞死的年輕恒牙的牙髓再生治療，以牙根是否進一步發(fā)育作為評判成功或失敗的標準，結果顯示80.6%的牙齒發(fā)生了牙根的進一步發(fā)育，其中血凝塊成功率明顯高于CGF，牙齒撕脫性損傷的成功率最低，僅為33.3%，提示不同原因?qū)е碌难浪鑹乃罆绊懷浪柙偕男Ч?，不同血小板濃縮物的作用效果也存在差異。目前CGF用于牙髓再生的臨床研究大多為年輕恒牙的病例報道，大部分病例都有牙根的進一步發(fā)育，但未見牙髓活力恢復的報道。

四、CGF應用于根尖區(qū)骨修復的作用與機制

當牙髓病變繼續(xù)發(fā)展累及根尖區(qū)時，若長時間未得到控制則會進展成根尖周炎或根尖周囊腫等疾病，損傷根尖區(qū)牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨，進而造成大面積的骨缺損。臨床上常需輔以根尖手術治療，徹底清除感染，單獨或聯(lián)合填塞骨粉和CGF等血小板濃縮物，以加快根尖區(qū)骨缺損的修復和提升骨再生的質(zhì)量。

1.體外研究

根尖區(qū)結構復雜，CGF可以作用于多種根尖區(qū)細胞實現(xiàn)骨組織的修復，發(fā)揮作用的生長因子主要有TGF-β1、BMP-2、VEGF[28]，已報道的細胞包括成骨細胞[29]、骨髓基質(zhì)干細胞[30]、牙髓干細胞[21]、根尖乳頭干細胞[22]、牙周膜成纖維細胞[31]、牙周膜細胞[32]等。Dong[29]等發(fā)現(xiàn)CGF不僅可以促進成骨細胞的增殖和遷移，還通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路，增加成骨細胞的礦化。Qiao[32]等將不同濃度（1CGF、3CGF、5CGF）的CGF處理牙周膜細胞，TGF-β1和血小板衍生生長因子-AB（platelet derived growth factor,PDGFAB）處理作為陽性對照組，結果發(fā)現(xiàn)取自3 ml全血的CGF，即3CGF組中牙周膜細胞的增殖、堿性磷酸酶活性和Wnt3a基因的表達均明顯高于其他實驗組和陽性對照組，表明CGF中多種活性成分協(xié)同作用，且3CGF成骨作用最為突出。有學者[3]將CGF中提取的原代細胞成骨誘導21天后，茜素紅染色顯示強陽性，矮小相關轉(zhuǎn)錄因子2、骨鈣蛋白等成骨標志物的表達增強7~11倍。以上研究表明CGF不僅可以促進多種根尖周細胞成骨分化，CGF中的原代細胞也具有強大的成骨潛力。另一方面，控制炎癥反應也是根尖周骨修復的重要環(huán)節(jié)。最近的一項研究[33]發(fā)現(xiàn)，CGF可以促進單核細胞遷移，誘導其成熟分化為巨噬細胞，并激活PKB信號通路促進M2型巨噬細胞極化，調(diào)節(jié)機體免疫應答和炎癥反應，為炎癥狀態(tài)下組織的修復創(chuàng)造一個有利微環(huán)境。

2.體內(nèi)研究

CGF作為最新一代的血小板濃縮物，Li[34]等比較了CGF與PRF、貧血小板血漿（platelet-poor plasma,PPP）對新西蘭兔拔牙后骨再生的作用效果，發(fā)現(xiàn)CGF組牙槽骨的吸收明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義，且新生骨小梁比其他組粗大、排列緊密，提示相比于其他血小板濃縮物，CGF有著更加優(yōu)異的骨誘導和骨再生能力。有學者將CGF與納米羥基磷灰石/膠原蛋白支架聯(lián)合或單獨植于兔下頜骨缺損區(qū)，結果顯示二者聯(lián)合應用時新骨生成速度和生成量明顯大于單獨應用，新生骨組織在組織學和影像學表現(xiàn)與正常骨組織相似，且有良好的抗壓強度和彈性模量，復合材料在24周時幾乎完全降解，表明CGF與骨修復材料聯(lián)合應用可以獲得較為理想的骨修復效果[35]。

3.臨床研究

由于CGF優(yōu)異的成骨作用，其在根尖周炎骨修復治療的臨床研究中受到越來越多的青睞。Sureshbabu等[36]報道了患有慢性根尖周炎的4顆前牙行根尖手術后，在根尖骨缺損處放置CGF纖維蛋白塊，并覆蓋CGF膜，6個月后即形成了理想的骨愈合，明顯縮短了廣泛性根尖周病變愈合的時間。Jiang[37]等比較了CGF聯(lián)合根尖刮治術和單一行根尖刮治術治療慢性竇道型根尖周炎的臨床療效，發(fā)現(xiàn)用CGF覆蓋根尖區(qū)創(chuàng)面的患牙，其牙槽骨密度明顯增高，根尖新骨形成量較多，臨床有效率達95%，明顯高于未使用CGF組。當根尖周炎比較嚴重，需要拔除患牙時，CGF仍具有應用價值。Keranmu[38]等將CGF置于因根尖周炎而微創(chuàng)拔除的磨牙牙槽窩底部，然后將第三磨牙移植于牙槽窩，隨訪發(fā)現(xiàn)CGF組顯著減輕了術后疼痛和初期愈合的反應，縮短愈合周期，2年后患者根尖周病變完全愈合，咀嚼功能正常，臨床檢查和影像學檢查均未見異常，移植成功率高達100%。綜上，CGF在根尖周炎骨修復治療中具有良好的臨床效果。

五、總結與展望

CGF來源豐富，制取方便，生物相容性和生物安全性高，免疫原性低，多種生物活性成分協(xié)同作用，在活髓保存、牙髓再生、根尖周炎骨再生中已被證明具有良好的潛能，但仍具有一定的局限性。首先，單純CGF釋放生長因子過快，局部生長因子濃度過低，無法作用于組織修復的全程，特別是修復時間較長的骨組織工程。其次，CGF發(fā)揮作用的機制尚未明確，各種生長因子之間相互作用復雜，再生的組織是否具有生物學功能也存在爭議。最后，CGF中活性成分是否會對全身其他細胞產(chǎn)生作用未見報道，不同患者的內(nèi)源性干細胞活力差異較大，CGF的適用條件及適宜濃度也需要考慮。因此，未來的研究應著重于CGF局部生長因子緩釋系統(tǒng)的構建，并使其在特定部位可以精準調(diào)控生長因子的釋放順序和釋放劑量，滿足不同階段組織修復和再生的需求。雖然目前尚未實現(xiàn)真正意義上的牙髓再生，但不可否認的是生長因子是牙髓再生的關鍵，CGF作為生長因子儲存庫和天然支架，在牙髓治療中有著巨大的應用潛力，應進行更深層次的基礎研究和大量的隨機對照體內(nèi)及臨床實驗，為CGF的臨床應用提供更高質(zhì)量科學證據(jù)，加快再生牙髓病學的發(fā)展。