劉云，徐亞飛，許慧穎

結(jié)腸癌屬于臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率和死亡率顯著升高，目前結(jié)腸癌患者5年生存率低于60%，對(duì)患者生命安全和身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，因此對(duì)于結(jié)腸癌早期明確診斷、了解分期和分化程度對(duì)評(píng)估患者預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義[1]。

微小RNA(microRNA, miRNA)一般是指21～25個(gè)核苷酸組成非編碼RNA，可以通過(guò)和信使RNA結(jié)合造成信使RNA降解或者阻斷其翻譯過(guò)程，對(duì)細(xì)胞分化、增殖與凋亡具有調(diào)控作用，并在胃癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤表達(dá)異常提示miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2]。既往研究[3]發(fā)現(xiàn) miR-625-3p能影響奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌患者的療效，而且miR-625-3p能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在惡性胸膜間皮瘤患者血循環(huán)中 miR-625-3p水平升高。然而miR-625-3p在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確，值得進(jìn)一步研究和探討。本研究分析了本地區(qū)結(jié)腸癌術(shù)后患者微小RNA-625-3P同病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，目的是為結(jié)腸癌治療和評(píng)估療效提供依據(jù)，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取廊坊市人民醫(yī)院2014年1月～2017年1月收治的結(jié)腸癌患者166例，其中男98例，女68例，年齡43～78歲，平均(58.37±2.96)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行結(jié)腸癌根治手術(shù)，術(shù)后病理學(xué)確診結(jié)腸癌；②術(shù)前未接受放化療、生物藥物治療等；③臨床資料完整；④術(shù)后自愿配合隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙；②復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌；③合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心凍存提供的細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA 提取和 qRT-PCR 利用TRIzol試劑分別提取結(jié)腸癌、結(jié)腸癌毗鄰正常組織(癌旁組織)、SW480和SW620細(xì)胞中的總RNA。取含100 ng總RNA按iScript TM cDNA Synthesis Kit 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays 說(shuō)明檢測(cè)成熟 miRNA，以 miR-625-3p 和 U6 為模板，miR-625-3p 和 U6 熒光探針作引物擴(kuò)增，miR-625-3p上游引物：5′-CAACGAGTCCTAACAGTCTGCTGAG-3′，下游引物：5′-TATCCTrGAGGGTCCGAGGTATTC-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CATTGGCTFCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物：5′-CAGGCTTGAA7ITrGCGTGTCATCC-3′。在ABI StepOneTM Real-Time PCR System 中進(jìn)行反應(yīng)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，相對(duì)定量用 2-ΔΔCt法來(lái)分析real-time PCR的結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)后通過(guò)門(mén)診、住院復(fù)查和電話等形式進(jìn)行隨訪。無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free survival, PFS)是指患者從首次治療到觀察到有客觀證據(jù)證實(shí)的疾病進(jìn)展的時(shí)間間隔；總生存期(Overall survival, OS)患者首次治療到由于任何原因死亡的時(shí)間。在隨訪截止日期仍存活的患者將以隨訪截止日期作為截尾數(shù)值進(jìn)行分析[4]。

TNM分期依據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(Union Internationale Contrele Cancer，UICC)提出的專(zhuān)門(mén)用來(lái)在癌癥治療過(guò)程中確定腫瘤病變范圍的分類(lèi)方法，T表示原發(fā)腫瘤大小和范圍，N代表區(qū)域淋巴結(jié)，反映與腫瘤有關(guān)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況， M表示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，用TNM三個(gè)指標(biāo)的組合劃分出不同的時(shí)期[5]。

腫瘤浸潤(rùn)是指病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在腫瘤周?chē)约鞍┡越M織，均可存在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、滲透，也與惡性腫瘤細(xì)胞的活躍程度和侵襲能力密不可分[6]。

腫瘤分化是根據(jù)腫瘤組織的間變程度，包括癌細(xì)胞的分化程度、排列方式、核分裂數(shù)量及局部浸潤(rùn)程度等加以確定的，分為高分化、中分化、低分化，分化程度越低惡性程度越高[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-625-3p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

檢測(cè)結(jié)果顯示，166例患者結(jié)腸癌組織與癌旁組織miR-625-3p相對(duì)表達(dá)水平為0.64(0.44,1.10)與0.36(0.20,0.55)，結(jié)腸癌組織miR-625-3p表達(dá)量比癌旁組織明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 miR-625-3p 在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)水平比較

圖2 內(nèi)參U6與 miR-625-3p 在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的擴(kuò)增曲線 (橫坐標(biāo)為PCR擴(kuò)增的輪數(shù)，縱坐標(biāo)是濃度)

2.2 結(jié)腸癌miR-625-3p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以miR-625-3p均值為臨界值，將患者分為高表達(dá)組(n=98)和低表達(dá)組(n=68)。高表達(dá)組低分化、浸潤(rùn)程度T3～T4、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比高于低表達(dá)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸癌miR-625-3p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 不同miR-625-3p表達(dá)水平的結(jié)腸癌患者預(yù)后

圖3 不同miR-625-3p表達(dá)水平結(jié)腸癌患者PFS時(shí)間

2.4 不同臨床病理參數(shù)患者預(yù)后比較

TNM分期Ⅲ～Ⅳ、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-625-3p低表達(dá)患者5年總生存率明顯低于TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-625-3p低表達(dá)患者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖4 不同miR-625-3p表達(dá)水平結(jié)腸癌患者OS時(shí)間

2.4 結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素

以患者的預(yù)后結(jié)局作為因變量，以TNM分期(Ⅰ～Ⅱ=0、 Ⅲ～Ⅳ=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(否=0、是=1)、miR-625-3p(低表達(dá)=0、高表達(dá)=1)作為自變量，建立多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示， TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-625-3p高表達(dá)水平均是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 不同臨床病理患者預(yù)后比較

表3 結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素

3 討論

結(jié)腸癌屬于國(guó)人中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前結(jié)腸癌發(fā)病在所有惡性腫瘤位居第五位，雖然隨著治療手段的進(jìn)步但是結(jié)腸癌患者死亡率仍居高不下，有學(xué)者報(bào)道結(jié)腸癌患者預(yù)后取決結(jié)腸癌進(jìn)展情況等多種因素，因此對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制和新靶點(diǎn)治療已成為臨床熱點(diǎn)研究話題[8]。微小RNA是22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)過(guò)程，一個(gè)微小RNA可以靶向多個(gè)信使RNA，構(gòu)成生物信息中復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)AXL( Anexelekto)屬于受體酪氨酸激酶亞家族成員之一，可以同配體結(jié)合可激活A(yù)XL 的酪氨酸激酶活性，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞黏附與識(shí)別、細(xì)胞增殖、抗凋亡、凝血、炎癥反應(yīng)等過(guò)程[10]。

本研究分析的miR-625-3p基因已證實(shí)可以直接作用在AXL中對(duì)腫瘤增殖、侵襲和遷移發(fā)揮調(diào)控作用，但是在結(jié)腸癌報(bào)道研究相對(duì)較少[11]。本研究中結(jié)腸癌組織miR-625-3p相對(duì)表達(dá)水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示結(jié)腸癌組織中miR-625-3p表達(dá)升高，既往研究證實(shí)該基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)升高，可以作為預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生發(fā)展，同本研究結(jié)果一致[12]。本研究還顯示，在低分化、浸潤(rùn)程度T3～T4、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者中miR-625-3p表達(dá)更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明miR-625-3p表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)病病理生理相關(guān)，可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素[13]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的細(xì)胞特征表現(xiàn)為侵襲轉(zhuǎn)移和具有無(wú)限的復(fù)制能力，細(xì)胞周期是維持細(xì)胞正常活動(dòng)的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞周期出現(xiàn)異常，通過(guò)阻滯細(xì)胞周期可以發(fā)揮抗腫瘤作用[14-15]。目前有報(bào)道指出應(yīng)用miR-625-3p抑制劑后細(xì)胞G0/G1期比例顯著升高，S期細(xì)胞減少，因此細(xì)胞增殖速度下降，提示了miR-625-3p抑制劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，也進(jìn)一步印證了miR-625-3p抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞周期產(chǎn)生影響對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮阻滯效果，也側(cè)面提示了miR-625-3p對(duì)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換具有促進(jìn)作用[16-19]。

本研究中miR-625-3p高表達(dá)患者PFS時(shí)間和5年無(wú)進(jìn)展生存率同低表達(dá)患者之間存在差異性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示對(duì)患者預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。進(jìn)一步建立Cox模型發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-625-3p表達(dá)水平是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。還有研究證實(shí)了miR-625-3p可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因表達(dá)，后者屬于抗凋亡蛋白，一般在結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可以調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過(guò)程，通過(guò)使用miR-625-3p抑制劑則可以抑制促凋亡蛋白BCL2-Associated X蛋白的表達(dá)，后者可以通過(guò)細(xì)胞色素C途徑對(duì)半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族進(jìn)行激活，造成結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。巴一等[20]分析了結(jié)腸癌組織與對(duì)應(yīng)正常結(jié)腸組織微小RNA(miRNA)的表達(dá)特征和診斷情況，發(fā)現(xiàn)6例結(jié)腸癌及其癌旁結(jié)腸組織中存在132種miRNA，其中47種miRNA在結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中表達(dá)量顯著下降，應(yīng)用PAM法對(duì)9對(duì)結(jié)腸癌組織/遠(yuǎn)端正常結(jié)腸組織進(jìn)行定性判斷的結(jié)果與病理切片診斷結(jié)果基本一致，提示了miRNA與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。

本研究分析了miR-625-3p在結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，重點(diǎn)觀察了該基因同患者預(yù)后具有密切關(guān)系，分析了可能影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為結(jié)腸癌靶向治療、評(píng)價(jià)預(yù)后提供了的新的證據(jù)。但是由于納入病例數(shù)量少，而且選擇的樣本人群可能存在一定的偏倚，而且由于腫瘤調(diào)控的信號(hào)途徑復(fù)雜，目前在腫瘤微環(huán)境miR-625-3p發(fā)揮的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、通過(guò)分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)一步論證。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中miR-625-3p高表達(dá)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征密切相關(guān)，共同影響患者預(yù)后。