林榕燕，鐘淮欽，陳藝荃，方能炎，孔 蘭，葉秀仙*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福州 350013；2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003)

石斛(Dendrobiumspp.)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，根據(jù)開(kāi)花時(shí)間和花序著生位置常將其分為春石斛和秋石斛[1]。秋石斛在秋季開(kāi)花，花序著生于假鱗莖頂端，著花數(shù)5～20朵，其花姿優(yōu)雅、花色艷麗、花期長(zhǎng)，是觀賞蘭花中的重要切花和盆花，在國(guó)際花卉市場(chǎng)上扮演著重要角色[2]。秋石斛原產(chǎn)地為東南亞和西太平洋島嶼等熱帶亞熱帶地區(qū)，其在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)溫度較為敏感，不適宜的溫度會(huì)導(dǎo)致秋石斛花朵的產(chǎn)量與質(zhì)量的下降，甚至停止生長(zhǎng)。而在中國(guó)大部分地區(qū)，低溫仍是限制秋石斛生長(zhǎng)發(fā)育的重要逆境因子之一[3]。因此，提高秋石斛的抗寒性以降低低溫傷害是秋石斛產(chǎn)業(yè)急需解決的主要問(wèn)題，而獲得高抗寒性的秋石斛品種則是解決該問(wèn)題的關(guān)鍵。其中開(kāi)展秋石斛抗寒基因的挖掘與鑒定，是培育高抗寒性秋石斛新品種的一項(xiàng)重要工作。

鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK/CPK)是一類在植物中廣泛存在的依賴鈣離子的 Ser/Thr 型蛋白激酶，是一類重要的鈣感受器，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答脅迫反應(yīng)中具有重要作用[4]。目前，模式植物和一些作物的CDPK基因家族成員已經(jīng)被分離和鑒定，擬南芥[5]中存在34個(gè)CDPK基因家族成員，玉米[6]中存在40個(gè)CDPK基因家族成員。此外，鐵皮石斛[7]、廣東桑[8]和番茄[9]等多種植物中的CDPK基因也陸續(xù)被報(bào)道[10-13]。隨著對(duì)CDPKs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)識(shí)別和參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)響應(yīng)低溫、干旱、高鹽等多種逆境脅迫的生物學(xué)功能，如過(guò)表達(dá)BnCPK5能增強(qiáng)油菜的干旱脅迫耐受性[14]；玉米ZmCDPK6被證實(shí)不僅相應(yīng)高溫脅迫，還受到鹽脅迫和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[15]；蝴蝶蘭PaCDPK1在應(yīng)答低溫、機(jī)械損傷和病原菌侵染時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平提高[16]。

鑒于CDPK基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中的重要性，特別是在應(yīng)對(duì)低溫脅迫方面，推測(cè)秋石斛CDPK中可能有相似的生物學(xué)功能。因此，本研究中通過(guò)克隆秋石斛CDPK基因，對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，并對(duì)其在低溫脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行研究，有助于后續(xù)秋石斛CDPK基因的功能驗(yàn)證，為探明秋石斛抗寒的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以生長(zhǎng)狀況良好的秋石斛品種‘水芙蓉’為供試材料，取適量葉片于液氮速凍后進(jìn)行RNA提取，用于CDPKs基因克隆。分別取‘水芙蓉’的根、莖、葉、花用于CDPKs基因的組織表達(dá)分析；分別取長(zhǎng)勢(shì)相近的4個(gè)秋石斛品種(‘三亞陽(yáng)光’、‘四面佛’、‘水芙蓉’及D128)葉片用于基因的表達(dá)分析和相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定。取長(zhǎng)勢(shì)相近的‘水芙蓉’分別于0 ℃和8 ℃條件下處理12 h，以置于資源圃常規(guī)條件(25 ℃)下的植株作為對(duì)照，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取葉片用于檢測(cè)低溫脅迫下基因的表達(dá)情況及相對(duì)電導(dǎo)率變化情況。

表1 秋石斛CDPK基因克隆及熒光定量PCR所用引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秋石斛總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成參照林榕燕等[17]的方法，采用通用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke)進(jìn)行秋石斛總RNA提取，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。

1.2.2 秋石斛CDPK基因cDNA序列擴(kuò)增從NCBI上下載大花蕙蘭、鐵皮石斛的CDPK基因序列，根據(jù)同源克隆的原則設(shè)計(jì)了CDPK基因序列特異引物CDPK-F/CDPK-R(表1)，以合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，包含了2×PCR buffer for KOD Fx 12.5 μL、2.0 mmol/L dNTP 5 μL，1 U/μL KOD Fx 0.5 μL，ddH2O 4 μL，100 ng/μL cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 30 s，53 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖(1%)電泳進(jìn)行檢測(cè)后，回收目的片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆送至測(cè)序公司測(cè)序完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析將測(cè)序獲得的序列翻譯成氨基酸序列后，利用ExPASy、CBS Prediction Servers、WoLF PSORT、Conserved Domain Search、SOPMA、DNAMAN、MEGA5.0等軟件進(jìn)行CDPKs 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、序列多重比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.4 秋石斛DenCDPKs基因定量表達(dá)分析以秋石斛不同品種不同處理材料的cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參基因，利用引物(表1)，采用TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒在7500 Real-Time PCR System儀(美國(guó)ABI公司)上檢測(cè)DenCDPKs基因在不同材料中的表達(dá)情況。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含TB Green Premix Ex Taq 5 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL，上、下游引物0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

1.2.5 秋石斛葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定以秋石斛不同品種不同處理?xiàng)l件下的葉片為材料，對(duì)其相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定，具體方法參照徐新娟等[18]的方法，并做適當(dāng)修改。先測(cè)量材料處于室溫下浸泡24 h后的電導(dǎo)率(E1)，而后將其置于100 ℃ 沸水浴中20 min，待冷卻至室溫后，再次測(cè)量電導(dǎo)率(E2)，相對(duì)電導(dǎo)率(REC/%)=E1/E2×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Execl 2007軟件進(jìn)行分析，顯著性分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋石斛CDPK基因序列的獲得

經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別得到約2 000、2 000和2 300 bp左右的特異性條帶(圖1)。測(cè)序完成后，將結(jié)果提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線Blast，發(fā)現(xiàn)獲得的序列與鐵皮石斛的CDPK1、CDPK2、CDPK3基因序列的一致性分別達(dá)96.64%、95.89%和94.49%，說(shuō)明所得片段序列為秋石斛CDPK1、CDPK2、CDPK3基因序列，命名為DenCDPK1(GenBank登錄號(hào)為MZ322902)、DenCDPK2(GenBank登錄號(hào)為MZ322903)、DenCDPK3(GenBank登錄號(hào)為MZ322904)。DenCDPK1基因片段大小為1 934 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 605 bp的完整開(kāi)放閱讀框(219～1 823)，編碼534個(gè)氨基酸。DenCDPK2基因片段大小為1 971 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 626 bp的完整開(kāi)放閱讀框(220～1 845)，編碼541個(gè)氨基酸。

M. DL2000；1. DenCDPK1；2. DenCDPK2；3. DenCDPK3圖1 秋石斛CDPK基因的克隆Fig.1 Cloning of CDPK gene in Dendrobium spp.

DenCDPK3基因片段大小為2 302 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 611 bp的完整開(kāi)放閱讀框(410～2 020)，編碼536個(gè)氨基酸。

2.2 秋石斛DenCDPK蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

秋石斛DenCDPK1、DenCDPK2、DenCDPK3蛋白質(zhì)的理論分子量分別為59.59、60.49和60.44 kD，等電點(diǎn)分別為6.03、6.14和6.62，分子式分別為C2643H4182N714O808S22、C2648H4222N764O806S26和C2680H4269N747O803S20，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)分別為-0.447、-0.480和-0.509，說(shuō)明三者均為親水蛋白質(zhì)，且三者均不具有跨膜結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，三者二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋(44.01%、47.87%和45.34%)和無(wú)規(guī)則卷曲(36.70%、34.57%和36.38%)為主，β-轉(zhuǎn)角(10.30%、9.61%和9.51%)和延伸鏈(8.99%、7.95%和8.77%)所占比率較低。

此外，DenCDPK1中Lys所占比重較大，比例達(dá)8.2%，Trp含量最低，僅為0.7%；定位于葉綠體的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為42.55，表明它是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。DenCDPK2中Gly所占比重較大，比例達(dá)9.2%，Trp含量最低，僅為1.1%；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為44.88，表明它是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。DenCDPK3中Lys所占比重較大，比例達(dá)9.7%，Trp含量最低，僅為0.9%；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大；該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為35.18，將其歸為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 秋石斛DenCDPK蛋白質(zhì)序列一致性比對(duì)與進(jìn)化分析

Blast比對(duì)結(jié)果顯示，DenCDPK1氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，AGA83664.1)的一致性為97%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020577380.1)的一致性為92%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA45643.1)的一致性為84%。DenCDPK2氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，XP_020684921.1)的一致性為99%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020594551.1)的一致性為96%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA50602.1)的一致性為91%。DenCDPK3氨基酸序列與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale，AGI21023.1)的一致性為97%，與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris，XP_020574779.1)的一致性為94%，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica，PKA49856.1)的一致性為87%。利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)不同植物的CDPK之間具有較高的一致性，且這些序列都具有 CDPK 家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，從氨基末端開(kāi)始有STKc_CAMK結(jié)構(gòu)域(Ser/Thr蛋白激酶區(qū))和4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域(圖2)。

Den.秋石斛；Do.鐵皮石斛；As.深圳擬蘭；虛線為Ser/Thr蛋白激酶區(qū)；實(shí)線為4個(gè) EF-hand 結(jié)構(gòu)圖2 秋石斛與其他植物CDPK氨基酸序列多重比對(duì)Den. Dendrobium spp.; Do. Dendrobium officinale; As. Apostasia shenzhenica; Dotted lines indicate Ser/Thr protein kinase domain; Solid lines indicate four EF-hand structuresFig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of CDPK among Dendrobium spp. and other plants

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥的34個(gè)CDPK蛋白質(zhì)序列及鐵皮石斛的3個(gè)CDPK蛋白質(zhì)序列，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建CDPK系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。參照洪旭升等[19]的研究報(bào)道，將構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分為4個(gè)組，其中DenCDPK1先與DoCPK1聚為一類，并于AtCDPK9和AtCDPK33的親緣關(guān)系較近，位于第Ⅱ組；DenCDPK2先與DoCDPK3聚為一類，并與AtCDPK13的親緣關(guān)系較近，DenCDPK3先與DoCPK3聚為一類，并與AtCDPK14和AtCDPK32的親緣關(guān)系較近，且DenCDPK2和DenCDPK3位于第Ⅲ組。

Den.秋石斛；Do.鐵皮石斛；At.擬南芥圖3 DenCDPK系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Den. Dendrobium spp.; Do. Dendrobium officinale; At. Arabidopsis thalianaFig.3 Phylogenetic tree of DenCDPK

2.4 秋石斛CDPK基因表達(dá)分析

以秋石斛‘水芙蓉’根、莖、葉、花的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達(dá)水平(圖4)。DenCDPK1和DenCDPK3基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為葉>根>花>莖，DenCDPK2基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為葉>莖>根>花，三者在葉中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量，其中DenCDPK3基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量是其在莖中的10倍。

不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)，下同圖4 秋石斛DenCDPK在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Different normal letters represented significant difference (P<0.05); the same as belowFig.4 Expression levels of DenCDPK in different tissues of Dendrobium spp.

以秋石斛不同品種‘水芙蓉’、‘三亞陽(yáng)光’、D128和‘四面佛’葉片的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達(dá)水平(圖5)。DenCDPK1基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為‘水芙蓉’>‘四面佛’>‘三亞陽(yáng)光’>D128，其中‘水芙蓉’葉片中該基因的相對(duì)表達(dá)量是D128的12倍。DenCDPK2基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為‘水芙蓉’>D128>‘三亞陽(yáng)光’>‘四面佛’，其中‘水芙蓉’葉片中該基因的表達(dá)量是‘四面佛’的100倍。DenCDPK3基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為‘四面佛’>D128>‘水芙蓉’>‘三亞陽(yáng)光’，其中‘四面佛’葉片中該基因的表達(dá)量是‘三亞陽(yáng)光’的88倍。

圖5 秋石斛DenCDPK在不同品種中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Expression levels of DenCDPK in different varieties of Dendrobium spp.

以秋石斛‘水芙蓉’在常規(guī)條件(25 ℃，對(duì)照組)和低溫處理(8 ℃、0 ℃)12 h后的葉片cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DenCDPKs基因的表達(dá)水平(圖6)。DenCDPK1和DenCDPK2基因的相對(duì)表達(dá)量隨著處理溫度的降低表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，在處理溫度為8 ℃時(shí)，基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和0 ℃處理組。DenCDPK3基因的相對(duì)表達(dá)量隨著處理溫度的降低表現(xiàn)為不斷上升的趨勢(shì)，在處理溫度為8 ℃時(shí)，DenCDPK3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；在處理溫度為0 ℃時(shí)，DenCDPK3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和8 ℃處理組。

圖6 秋石斛DenCDPK在不同條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Expression levels of DenCDPK under different conditions of Dendrobium spp.

2.5 不同條件下秋石斛葉片中相對(duì)電導(dǎo)率的比較

通過(guò)比較秋石斛不同品種葉片在常溫下的相對(duì)電導(dǎo)率(圖7)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)電導(dǎo)率在4個(gè)品種中的大小依次為‘四面佛’、‘三亞陽(yáng)光’、D128和‘水芙蓉’，且各品種間的相對(duì)電導(dǎo)率呈顯著差異。

圖7 不同品種秋石斛葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.7 Relative electrical conductivity of leaves in different varieties of Dendrobium spp.

通過(guò)比較秋石斛‘水芙蓉’在常規(guī)條件(25 ℃，對(duì)照組)和低溫處理(8 ℃、0 ℃)12 h后葉片的相對(duì)電導(dǎo)率(圖8)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫處理12 h后，葉片中的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著提高，且隨著處理溫度的降低，葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，在處理溫度為0 ℃時(shí)，顯著高于對(duì)照組和8 ℃處理組。

圖8 不同處理?xiàng)l件下秋石斛葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.8 Relative electrical conductivity of leaves under different conditions in Dendrobium spp.

3 討 論

鈣依賴蛋白激酶(CDPK)作為鈣結(jié)合蛋白之一，是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要一環(huán)。近年來(lái)，越來(lái)越多的植物CDPKs基因被分離鑒定，并被報(bào)道廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗逆境脅迫的調(diào)控反應(yīng)[20-22]。本研究在秋石斛‘水芙蓉’葉片中克隆獲得了3個(gè)CDPK基因，將其命名為DenCDPK1、DenCDPK2和DenCDPK3，分別編碼534、541和

536個(gè)氨基酸。分析3個(gè)基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)三者的基本理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征極為相似，均為親水蛋白質(zhì)，且存在STKc_CAMK結(jié)構(gòu)域，這與報(bào)道的鐵皮石斛[23]、青花菜[24]等植物的序列結(jié)構(gòu)特征一致。三者的差異在于DenCDPK1定位于葉綠體的可能性最大，而DenCDPK2、DenCDPK3定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，這與在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、染色體和細(xì)胞核中均有 CDPKs存在的現(xiàn)象相符[25]。

CDPKs基因的表達(dá)存在組織特異性，辣椒CaCDPK09、CaCDPK18等基因在各組織中均有較高表達(dá)量，CaCDPK28、CaCDPK04則在各組織表達(dá)量都很低，而CaCDPK02、CaCDPK03等基因只在花芽和花中表達(dá)，CaCDPK07、CaCDPK14等只在根、莖、葉中高表達(dá)[26]。本研究中DenCDPKs在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，DenCDPK1和DenCDPK3基因在葉中高表達(dá)，在莖中低表達(dá)；DenCDPK2基因同樣在葉中高表達(dá)，但在花中低表達(dá)。

CDPKs基因表達(dá)還受溫度、鹽脅迫、植物激素等的影響，羊草LcCDPK在高濃度鹽堿處理?xiàng)l件下上調(diào)表達(dá)[27]；朝鮮淫羊藿EkCDPK在干旱脅迫后15 h內(nèi)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組[28]；馬鈴薯StCDPK基因的表達(dá)量在4℃處理12 h時(shí)出現(xiàn)峰值[29]。本研究中，DenCDPK1、DenCDPK2和DenCDPK3基因分別在處理溫度為8 ℃、8 ℃和0 ℃時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明了DenCDPKs受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)DenCDPKs基因參與到秋石斛低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。

有研究表明，相對(duì)電導(dǎo)率在一定程度上反映了膜脂的損傷程度，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，可在一定程度上體現(xiàn)植物的抗寒性[30]。本研究中葉片的相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度降低呈上升趨勢(shì)，在0℃時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率最大，這一變化趨勢(shì)與DenCDPK3基因在低溫處理下的表達(dá)模式一致，說(shuō)明DenCDPK3基因可能參與秋石斛低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)相對(duì)電導(dǎo)率在4個(gè)品種中的大小為‘四面佛’>‘三亞陽(yáng)光’>D128>‘水芙蓉’，初步判斷4個(gè)秋石斛品種的抗寒性大小為‘水芙蓉’>D128>‘三亞陽(yáng)光’>‘四面佛’，這一結(jié)果與前期通過(guò)LT50評(píng)價(jià)法和隸屬函數(shù)分析法綜合評(píng)價(jià)的秋石斛抗寒性大小一致[31]，也與DenCDPK2基因在不同品種葉片的表達(dá)模式相符，說(shuō)明DenCDPK2基因的表達(dá)與秋石斛的抗寒性有一定的相關(guān)性。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DenCDPK2與AtCDPK13的親緣關(guān)系較近，而前人的研究證實(shí)了AtCDPK13在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)抑制了光誘導(dǎo)的氣孔開(kāi)放，推測(cè)DenCDPK2可能有相似功能[32]。

以上結(jié)果均表明，本研究克隆獲得的DenCDPKs是可能參與秋石斛低溫脅迫應(yīng)對(duì)的鈣依賴型蛋白激酶，特別是DenCDPK2可能在秋石斛抗寒過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但其在低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制和功能還需進(jìn)一步研究，后續(xù)將通過(guò)分子生物學(xué)手段調(diào)節(jié)CDPK基因的表達(dá)，分析下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示CDPK基因的作用機(jī)理，進(jìn)而為研究秋石斛抗寒機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后的品種創(chuàng)新提供基因資源。