濮 丹，張靜亞，雷 蕾，尚慶茂，董春娟

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

黃瓜(CucumissativusL.)是世界上最主要的蔬菜種類之一，也是中國(guó)種植面積最大、產(chǎn)量最高的果菜類蔬菜之一。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)顯示，2020年中國(guó)黃瓜種植面積126.04萬hm2，產(chǎn)量7 283.30萬t，分別占全世界的56.61%和79.81%，面積和產(chǎn)量均位居世界第一。嫁接在黃瓜栽培生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用，選擇合適的南瓜砧木進(jìn)行嫁接，可以有效克服土壤連作障礙、增強(qiáng)黃瓜嫁接苗的耐逆性和抗病性、提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。國(guó)內(nèi)外常用的黃瓜嫁接方法包括靠接法、插接法和單子葉貼接法等[3-4]。采用單子葉貼接法進(jìn)行嫁接時(shí)，用刀片沿一定角度切去砧木一個(gè)子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)，接穗在子葉下方約1 cm處以相同角度斜切下胚軸，之后將砧木和接穗沿切面緊貼對(duì)齊，用嫁接夾固定[3]。單子葉貼接法因操作工序簡(jiǎn)單，對(duì)幼苗標(biāo)準(zhǔn)化程度要求低，更利于機(jī)械化嫁接操作，且嫁接成活后萌蘗少，在黃瓜嫁接中已廣泛推廣應(yīng)用[5]。

黃瓜和南瓜均屬于雙子葉植物，子葉對(duì)其生長(zhǎng)具有重要作用。隨著生長(zhǎng)發(fā)育，子葉從單純的貯存器官轉(zhuǎn)變?yōu)橛酌缟L(zhǎng)初期最主要的光合器官，子葉中貯存的以及光合產(chǎn)生的碳水化合物是植物早期生長(zhǎng)所需的主要能量來源[6]。在黃瓜中，將5 d齡幼苗的1片子葉去除，幼苗干質(zhì)量減少50%以上，而將2片子葉全部去除，幼苗干質(zhì)量將減少約70%[7-9]。在單子葉貼接中往往會(huì)保留一片砧木子葉，從而為嫁接接合部提供激素和能量物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞分裂形成愈傷組織，進(jìn)而促進(jìn)嫁接愈合和嫁接苗生長(zhǎng)[10-11]。然而，近年來穴盤育苗已成為黃瓜育苗的主要方式。南瓜砧木子葉較大，而穴盤育苗空間有限，在育苗時(shí)常會(huì)導(dǎo)致砧木子葉相互遮擋、堆疊，影響葉片光合效率，并易引發(fā)葉部病害，因此生產(chǎn)中多采用將砧木子葉部分剪除以減少不利影響[12]，但是砧木子葉的去留如何影響黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)，目前仍鮮見報(bào)道。

糖在黃瓜嫁接愈合和嫁接苗生長(zhǎng)發(fā)育過程中十分關(guān)鍵[10-11]。淀粉是葉片中糖的主要貯存形式[13]。淀粉合成是通過一系列酶促反應(yīng)，把淀粉合成的前體物質(zhì)ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADPG)轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸鄣倪^程，ADPG焦磷酸化酶(ADP glucose pyrophosphorylase，AGPase)、顆粒結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)、淀粉合成酶(starch synthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(debranching enzyme，DBE)是淀粉合成過程的關(guān)鍵酶，其中AGPase負(fù)責(zé)合成前體物質(zhì)ADPG，GBSS參與直鏈淀粉合成，SS、SBE和DBE參與支鏈淀粉的合成[14-17]。淀粉還可在β-淀粉酶(β-Amylase，β-AL)等酶的作用下水解形成麥芽糖，并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，為植物生長(zhǎng)提供碳源[18]。在單子葉貼接的嫁接苗中，砧木子葉是重要的貯存性器官，淀粉作為其中糖的主要貯存形式，其代謝如何變化，對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)如何影響，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究測(cè)定了黃瓜單子葉貼接嫁接苗砧木子葉的形態(tài)指標(biāo)和淀粉代謝變化，分析了嫁接后去除砧木子葉對(duì)黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響，明確了砧木子葉淀粉代謝在黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)中的作用，為黃瓜嫁接苗的壯苗培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種‘中農(nóng)18號(hào)’購(gòu)自中蔬種業(yè)(北京)有限公司，南瓜品種‘京欣砧5號(hào)’購(gòu)自京研益農(nóng)(北京)種業(yè)科技有限公司。播種用平盤規(guī)格為540 mm×270 mm×60 mm(長(zhǎng)×寬×高)，購(gòu)自臺(tái)州隆基塑業(yè)有限公司；育苗營(yíng)養(yǎng)缽上口徑70 mm，下口徑50 mm，高55 mm，購(gòu)自北京順莉科技有限公司。蛭石和珍珠巖為園藝級(jí)，粒徑3～5 mm，購(gòu)自河北靈壽縣騰達(dá)礦產(chǎn)品加工廠；石英砂為20～40目，購(gòu)自青島綠生生物科技有限公司。

1.2 幼苗培養(yǎng)與嫁接

試驗(yàn)所需幼苗在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南區(qū)玻璃溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。選取飽滿一致的黃瓜和南瓜種子，5% NaClO消毒10 min，蒸餾水充分沖洗后，置于30 ℃恒溫箱中催芽。待種子露白后，挑選萌發(fā)一致的種子，接穗種子播于裝有蛭石和珍珠巖(1∶1，V/V)混合基質(zhì)的育苗平盤中，每盤播種約150粒；砧木種子播于裝有蛭石和石英砂(5∶1，V/V)混合基質(zhì)的育苗營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽1粒，播種后覆蓋1.5 cm厚的蛭石，充分澆水至平盤或營(yíng)養(yǎng)缽底部排水孔有水滴出現(xiàn)。待接穗幼苗長(zhǎng)至子葉平展、砧木幼苗長(zhǎng)至第一片真葉露心時(shí)，進(jìn)行嫁接。

嫁接試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)砧穗組合，分別為黃瓜/南瓜(C/P)和南瓜/南瓜(P/P)，以不嫁接的南瓜自根苗(P)和去除一片子葉的南瓜苗(-/P)為對(duì)照。采用單子葉貼接法進(jìn)行嫁接。選取長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的幼苗，將砧木幼苗軸向30°切去生長(zhǎng)點(diǎn)及一片子葉，接穗在子葉下方1 cm處以相同角度斜切，切面長(zhǎng)約0.5 cm，將兩切面緊貼對(duì)齊，用嫁接夾固定。嫁接后將幼苗立即移入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，愈合期環(huán)境設(shè)置參照趙加欣等進(jìn)行分段設(shè)置[11]。嫁接后8 d(the 8 days after grafting，8 dag,下同)將幼苗移入玻璃溫室自然溫光條件下培養(yǎng)至25 dag。幼苗培養(yǎng)過程用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行灌溉。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)至少100株嫁接苗。

為了分析砧木子葉去留對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，分別于0、1、3、5、7、10、13、18 dag上午10:00去除C/P和P/P嫁接苗的砧木子葉，嫁接苗繼續(xù)培養(yǎng)至25 dag，培養(yǎng)條件同上，以不去除砧木子葉的C/P和P/P嫁接苗為對(duì)照。

1.3 嫁接苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 砧木子葉面積和鮮質(zhì)量分別于0、1、3、5、7、10、13、18、25 dag下午14：00取砧木子葉，稱量、記錄子葉鮮質(zhì)量，對(duì)子葉進(jìn)行掃描，采用萬深LA-S植物圖像分析軟件計(jì)算子葉面積。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株。

1.3.2 接穗和砧木生長(zhǎng)指標(biāo)于25 dag選取嫁接苗，分為接穗和砧木兩個(gè)部分，參照褚群等[11]的方法，分別測(cè)定接穗部分鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉片面積，以及根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株。

1.4 根系活力測(cè)定

根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定[19]。將幼苗根系清洗并吸干水分后放入含有5 mL 0.4% TTC、5 mL磷酸鹽緩沖液(0.06 mol·L-1，pH 7.0)混合溶液中，使根系完全浸沒，37 ℃黑暗孵育1.5 h后，加入2 mL硫酸溶液(1 mol·L-1)終止反應(yīng)，將根系清洗后在無水乙醇中充分浸提3 h，浸提液于波長(zhǎng)490 nm下比色，測(cè)定三苯基甲臜(TTF)含量，以單位時(shí)間內(nèi)還原產(chǎn)生的TTF量表示根系活力(mg·g-1·h-1)。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株。

1.5 砧木子葉淀粉和可溶性糖含量測(cè)定

砧木子葉中淀粉采用酸水解法提取，淀粉含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[11]。根系中可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[11]。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株。

1.6 砧木子葉淀粉代謝相關(guān)酶的提取和活性測(cè)定

選取0、3、7、10、25 dag的砧木子葉凍存樣品，用于淀粉合成酶(starch synthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和β-淀粉水解酶(β-amylase，β-AL)的活性測(cè)定。SS的活性采用可溶性淀粉合成酶(SSS)活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定，以每克樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為1個(gè)酶活性單位(U·g-1)；SBE的活性采用淀粉分支酶檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定，以波長(zhǎng)660 nm的吸光度下降百分率表示，每克樣品在反應(yīng)體系中每降低1% 碘藍(lán)值為1個(gè)酶活性單位(U·g-1)；β-AL的活性采用β-水解酶活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定，以每克樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mg還原糖為1個(gè)酶活力單位(U·g-1)。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株。

1.7 根系RNA提取和基因表達(dá)水平測(cè)定

根系總RNA采用EasyPure Plant RNA Kit(全式金，北京)試劑盒提取，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用Nano Drop One(Thermo Scientific，USA)測(cè)定RNA濃度。采用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金，北京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和cDNA第一鏈合成。所得cDNA用于Real-time PCR定量分析，試劑盒為Transstart?Top Green qPCR Kit(全式金，北京)，儀器為L(zhǎng)ightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞典)。

Real-time PCR反應(yīng)體系(15 μL)為：cDNA模板0.8 μL，TransStart?Top Green qPCR SuperMix 7.5 μL，基因上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，ddH2O 6.1 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃ 180 s；95 ℃ 5 s，54 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共50個(gè)循環(huán)。以南瓜持家基因CmoActin作為Real-time PCR的內(nèi)參基因[20]，基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算[21]，設(shè)定目標(biāo)基因在0 dag的表達(dá)水平為1.0。待測(cè)目的基因及內(nèi)參基因特異性擴(kuò)增引物序列見表1。每個(gè)樣品3次重復(fù)，每次重復(fù)15株幼苗。

表1 Real-time PCR所用引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Microsoft Excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPS 26 軟件最小差異法進(jìn)行顯著性差異分析(α= 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

圖1，A、B顯示，相較于南瓜自根苗P，單子葉貼接的黃瓜/南瓜嫁接苗(C/P)和南瓜/南瓜嫁接苗(P/P)中砧木子葉的面積和鮮質(zhì)量均顯著增加，且C/P嫁接苗的增加量顯著高于P/P；在嫁接后25 d，C/P砧木子葉的鮮質(zhì)量和面積分別是P/P的1.29倍和1.12倍；去除一片子葉的南瓜幼苗(-/P)的子葉面積和鮮質(zhì)量均增加，且增加量顯著高于C/P和P/P嫁接苗。

同時(shí)，圖1，C、D進(jìn)一步比較了砧木子葉在嫁接后不同時(shí)期鮮質(zhì)量和面積的凈增長(zhǎng)量。其中，C/P砧木子葉的鮮質(zhì)量主要在嫁接愈合期1～7 dag顯著增長(zhǎng)，占總增長(zhǎng)量的73.70%，此外其在10～18 dag期間也有增長(zhǎng)；P/P砧木子葉的鮮質(zhì)量在嫁接愈合期0～1 dag的增長(zhǎng)占總增長(zhǎng)量的49.08%；而-/P幼苗的子葉除在0～3 dag期間顯著增長(zhǎng)外，在生長(zhǎng)后期(10～25 dag)還有一個(gè)更大幅度的增長(zhǎng)；P幼苗的子葉則僅在0～1 dag時(shí)快速增長(zhǎng)(圖1，C)。各砧木子葉面積的增長(zhǎng)模式與其鮮質(zhì)量增加模式略有差異，所有處理在0～1 dag時(shí)均有一個(gè)快速增大的過程(圖1，D)；此外，C/P嫁接苗的砧木子葉面積在1～7 dag、10～18 dag有顯著增大，P/P嫁接苗的砧木子葉面積僅在3～7 dag時(shí)顯著增大；-/P幼苗子葉面積有兩個(gè)增大期(1～7 dag、10～25 dag)，而P幼苗的子葉面積有一個(gè)增大期(1～3 dag)。

C/P. 黃瓜/南瓜嫁接苗；P/P. 南瓜/南瓜嫁接苗；-/P. 去除一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)的南瓜自根苗；P. 南瓜自根苗；dag. 嫁接后天數(shù)。同一處理內(nèi)不同小寫字母表示生長(zhǎng)不同時(shí)期間差異顯著(P < 0.05)；下同圖1 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的生長(zhǎng)情況C/P. Cucumber/pumpkin grafted seedling；P/P. Pumpkin/pumpkin grafted seedling；-/P. Pumpkin seedling with one cotyledon and apical meristem removed；P. Intact pumpkin seedling. dag. Days after grafting. Different normal letters within each treatment indicate the significant differences among various times at 0.05 level (P < 0.05); The same as belowFig.1 Growth of rootstock cotyledon in C/P and P/P grafted seedlings

上述結(jié)果表明，在單子葉貼接后，各嫁接苗的砧木子葉均迅速生長(zhǎng)，并以C/P嫁接苗砧木子葉的增長(zhǎng)量高于P/P嫁接苗，且兩者增長(zhǎng)時(shí)期分布也存在差異，C/P的砧木子葉在嫁接后的早期和后期均有增加，而P/P的砧木子葉僅在嫁接后早期有顯著增加。

2.2 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的淀粉含量變化

淀粉是葉片光合作用產(chǎn)物的主要貯存形式[22]。圖2顯示，C/P嫁接苗砧木子葉淀粉含量在1 dag和3 dag時(shí)下降，之后逐漸升高，至愈合期結(jié)束時(shí)(7 dag)是嫁接前(0 dag)的2.36倍，并在10 dag和13 dag時(shí)達(dá)到最高，之后隨著幼苗生長(zhǎng)迅速降低。與C/P嫁接苗表現(xiàn)類似，P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量在嫁接愈合期1～5 dag時(shí)顯著降低，并在7 dag和10 dag時(shí)達(dá)到最高，7 dag時(shí)較0 dag顯著升高約70%，之后隨著幼苗生長(zhǎng)逐漸降低；P/P嫁接苗砧木子葉淀粉含量幾乎始終低于同期C/P嫁接苗。與嫁接苗不同，自根苗P和-/P的子葉淀粉含量隨著幼苗生長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，P幼苗子葉淀粉在10～13 dag時(shí)達(dá)到最高，而-/P幼苗子葉淀粉含量在18 dag時(shí)達(dá)到最高。

圖2 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量隨生長(zhǎng)的變化Fig.2 Changes of starch content in cotyledons during growth of C/P and P/P grafted seedlings

2.3 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉代謝相關(guān)酶的活性變化

首先，C/P嫁接苗砧木子葉中可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性在0 dag時(shí)最高，之后逐漸降低，至7 dag時(shí)達(dá)到最低，在10 dag時(shí)有所升高，并于25 dag時(shí)再次降低；P/P嫁接苗砧木和-/P自根苗子葉中SSS活性變化規(guī)律與C/P類似，但在7 dag時(shí)SSS活性高于C/P；P自根苗子葉中SSS活性呈持續(xù)降低的趨勢(shì)，在25 dag時(shí)活性最低，只有0 dag時(shí)的15.13%(圖3，A)。

其次，C/P嫁接苗砧木子葉中淀粉分支酶(SBE)活性在3 dag時(shí)降低，并在7 dag時(shí)升高，至10 dag時(shí)達(dá)到最高，但在25 dag時(shí)再次明顯降低；P/P嫁接苗砧木子葉中SBE活性在3～7 dag時(shí)維持在較低水平，在10 dag時(shí)有所升高，但仍顯著低于同期C/P嫁接苗；-/P自根苗子葉中SBE活性在3～7 dag時(shí)逐漸降低，而在10～25 dag時(shí)逐漸升高；P自根苗子葉中SBE活性在0～10 dag時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，但在25 dag時(shí)顯著降低，只有0 dag時(shí)的44.04%(圖3，B)。

另外，C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的β-淀粉酶(β-AL)活性變化規(guī)律相似，均在3 dag時(shí)升高，并在7 dag時(shí)降低，在25 dag時(shí)活性最低，只有0 dag時(shí)的約53.86%；在10 dag時(shí)，C/P砧木子葉中β-AL活性有一個(gè)顯著升高的過程，且顯著高于同期P/P嫁接苗。-/P自根苗子葉中β-AL活性在3 dag時(shí)迅速降低，之后維持在27.11 U·g-1左右，而自根苗P子葉中β-AL活性在0～7 dag時(shí)比較穩(wěn)定，在10 dag時(shí)顯著降低(圖3，C)。

圖3 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉代謝相關(guān)酶活性變化Fig.3 Enzyme activities related to starch metabolism in the rootstock cotyledon of C/P and P/P grafted seedlings

2.4 去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗生長(zhǎng)以及根系活力和相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)通過單子葉貼接的C/P和P/P嫁接苗，分別在嫁接后不同時(shí)間去除砧木子葉，進(jìn)一步觀測(cè)砧木子葉去留對(duì)嫁接苗(25 dag)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果(表2)顯示，P/P嫁接苗接穗和根系的生長(zhǎng)(生物量、總?cè)~面積)受到砧木子葉去留的影響較小，而C/P嫁接苗生長(zhǎng)受到嫁接后砧木子葉去留的影響較大，尤其是嫁接后早期去除砧木子葉顯著抑制嫁接苗接穗和根系生長(zhǎng)，并以0 dag去除砧木子葉的抑制作用最強(qiáng)。其中，與對(duì)照(保留砧木子葉)相比，C/P嫁接苗接穗部分的鮮質(zhì)量在0～3dag、干質(zhì)量在0～5 dag、葉片總面積在0～13 dag均顯著降低，降幅分別為17.99%～21.08%、18.44%～23.15%、12.46%～36.57%，而其砧木部分的鮮質(zhì)量在0～13 dag、干質(zhì)量在0～5 dag均顯著降低，降幅分別為32.0%～42.0%、28.80%～39.16%。

2.4.2 根系活力及其可溶性糖含量嫁接后去除砧木子葉對(duì)各嫁接苗(25 dag)根系活力有不同的影響(圖4)。其中，各個(gè)時(shí)期去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗的根系活力均無顯著影響，而對(duì)于C/P嫁接苗根系活力產(chǎn)生不同影響，且去除時(shí)間越早受到影響越嚴(yán)重。C/P嫁接苗根系活力以對(duì)照最高，在0～10 dag去除砧木子葉均會(huì)導(dǎo)致嫁接苗根系活力顯著降低，并以0 dag時(shí)去除子葉的影響最大(根系活力只有對(duì)照的30.64%)；在1～10 dag時(shí)去除砧木子葉根系活力降低了約45%；在13～18 dag時(shí)去除砧木子葉對(duì)根系活力的影響較小，根系活力降低不到10%。

不同小寫字母表示處理時(shí)間之間在0.05 水平差異顯著(P < 0.05);下同圖4 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系活力的影響Different normal letters indicate the significant differences in different treatment times at 0.05 level (P < 0.05)；The same as belowFig.4 Effects of removing rootstock cotyledon on root vigor of C/P and P/P grafted seedlings

表2 嫁接后不同時(shí)間去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

同時(shí)，嫁接后去除砧木子葉對(duì)嫁接苗根系可溶性糖含量也有相似的影響(圖5)。其中，各時(shí)期去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗根系中可溶性糖含量均無顯著影響，而對(duì)于C/P嫁接苗根系可溶性糖含量產(chǎn)生不同影響，并在0～10 dag時(shí)去除砧木子葉均引起顯著降低，此時(shí)根系可溶性糖含量約為對(duì)照的66%左右，而在18 dag時(shí)去除砧木子葉根系可溶性糖含量與對(duì)照無顯著差異。

圖5 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of removing rootstock cotyledon on the soluble sugar content in roots of C/P and P/P grafted seedlings

2.4.3 根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平比較去除砧木子葉嫁接苗根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平(圖6)發(fā)現(xiàn)，P/P嫁接苗根中CmoCWIN1、CmoCWIN6和CmoHXK2基因表達(dá)水平在去除砧木子葉后均未受到顯著影響，僅嫁接苗根系CmoHXK1的表達(dá)水平在3 dag去除砧木子葉處理中略有降低；而C/P嫁接苗根中CmoCWIN1、CmoCWIN6、CmoHXK1和CmoHXK2基因的表達(dá)水平在嫁接后各時(shí)期去除砧木子葉后均不同程度降低，并均以0 dag時(shí)去除砧木子葉處理的表達(dá)水平最低，分別比對(duì)照顯著降低52.35%、46.51%、23.76%和46.50%。以上結(jié)果說明在C/P中和去除砧木子葉引起嫁接苗根系中糖代謝水平降低，導(dǎo)致根系活力降低。

圖6 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of removing rootstock cotyledon on CWIN and HXK genes expression in roots of C/P and P/P grafted seedlings

3 討 論

黃瓜是重要的蔬菜作物，嫁接可以有效克服土壤連作障礙、增強(qiáng)抗逆性和抗病性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)[23-26]。單子葉貼接因其嫁接成活率高、便于機(jī)械化操作等優(yōu)點(diǎn)，是黃瓜嫁接的主要方法之一[4]。嫁接砧穗間互作是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，包括砧木對(duì)地上部接穗的影響以及接穗對(duì)砧木的反饋調(diào)控[11, 27-28]。砧木子葉作為嫁接苗早期生長(zhǎng)最主要的源器官，目前對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)及其對(duì)接穗和根系生長(zhǎng)的影響仍缺乏了解。

本研究發(fā)現(xiàn)，-/P自根苗以及C/P和P/P嫁接苗中，砧木子葉的面積和鮮質(zhì)量迅速增大，且子葉增加量表現(xiàn)為-/P > C/P > P/P > P。黃瓜和南瓜均為雙子葉植物，子葉是早期幼苗進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，較大的葉表面積可以最大限度地接受光照、增加光合效率[29]，去除其中一片子葉，植物為提高源器官的強(qiáng)度，勢(shì)必會(huì)引起另一片子葉顯著增大，這與Mayoral等[30]的報(bào)道一致。在本研究中，對(duì)于不同砧穗組合的幼苗砧木子葉增大的時(shí)期不同。對(duì)于南瓜自根苗P，子葉在0～1 dag時(shí)期明顯增大，表明南瓜幼苗子葉在此時(shí)(即出苗后5～6 d)生長(zhǎng)基本完成；對(duì)于自根苗-/P，子葉在早期(0～7 dag)和后期(10～25 dag)都有顯著增大；嫁接苗P/P砧木子葉隨時(shí)間的增長(zhǎng)模式與P自根苗相似，而C/P嫁接苗砧木子葉的增長(zhǎng)模式則介于P/P和-/P之間，這可能與異源嫁接苗的愈合速率慢于自體嫁接苗有關(guān)[31]。這些結(jié)果表明，單子葉貼接后，嫁接苗砧木子葉顯著增長(zhǎng)，且增長(zhǎng)幅度與時(shí)期因接穗不同而異。

淀粉作為植物中碳水化合物的一種主要貯存形式，在調(diào)節(jié)植物源-庫(kù)關(guān)系中起重要作用[13]。本研究中C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量在嫁接愈合期(1～7 dag)顯著降低。在嫁接愈合初期，砧穗間尚未連通，砧木子葉是嫁接苗最主要的源器官，子葉中淀粉水解可為嫁接愈合提供所需的能量[10]。砧木子葉中淀粉的減少與淀粉合成酶SSS和SBE活性降低、淀粉水解酶β-AL活性升高一致。SSS和SBE協(xié)同負(fù)責(zé)淀粉的合成[32]。嫁接愈合期弱光、高濕的環(huán)境引起SSS和SBE活性顯著降低，這與已有研究報(bào)道一致。在木薯、大豆等植物中，遮蔭和弱光處理可顯著抑制葉片中SS、SBE等淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)和酶活性[33-35]。β-AL負(fù)責(zé)從淀粉分子的非還原性末端依次切割α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生β-麥芽糖，是植物葉片中淀粉水解的關(guān)鍵酶[36]。水分脅迫可促進(jìn)黃瓜子葉中β-AL活性升高，增加子葉中蔗糖含量，蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，保護(hù)子葉細(xì)胞免受脅迫傷害[37]。β-AL的基因表達(dá)和酶活性也受糖信號(hào)誘導(dǎo)。對(duì)擬南芥蓮葉片施加蔗糖、葡萄糖或果糖后，β-AL基因表達(dá)和活性都有顯著升高[38]。在嫁接愈合期，切削引起砧木子葉失水導(dǎo)致β-AL活性升高，而嫁接愈合的高能量需求引起蔗糖、葡萄糖等升高，進(jìn)一步促進(jìn)了β-AL基因表達(dá)和活性升高。

隨著嫁接傷口逐漸愈合，能量需求降低，且維管束逐漸連通，接穗葉片補(bǔ)充成為新的源器官，砧木子葉中的光合產(chǎn)物以淀粉形式逐漸積累，淀粉含量迅速升高，且C/P砧木子葉淀粉含量顯著高于P/P。嫁接愈合期結(jié)束后，接穗葉片逐漸成為主要的源器官，接穗新葉和根系是嫁接苗的主要庫(kù)器官，由于C/P嫁接苗接穗和根系的生長(zhǎng)(即庫(kù)的強(qiáng)度)均弱于P/P嫁接苗，C/P砧木子葉中更多的光合產(chǎn)物用于合成淀粉，并貯存在子葉中。與此相一致，砧木子葉中SSS和SBE活性升高，且C/P砧木子葉中SBE活性顯著高于P/P。之后嫁接苗快速生長(zhǎng)，砧木子葉中貯存的淀粉逐漸水解，供接穗和根系生長(zhǎng)所需。綜合上述結(jié)果，在黃瓜單子葉貼接苗中，砧木子葉可作為一個(gè)貯存器官，在嫁接愈合期子葉淀粉水解為接口愈合提供能量，在愈合期結(jié)束后及幼苗生長(zhǎng)早期，子葉中多余的光合產(chǎn)物以淀粉形式儲(chǔ)存起來，并在幼苗生長(zhǎng)后期水解，為嫁接苗接穗和根系的快速生長(zhǎng)提供碳源。

為驗(yàn)證上述結(jié)論，進(jìn)一步分析了嫁接后不同時(shí)期去除砧木子葉對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，嫁接后去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗的生長(zhǎng)和根系活力無顯著影響，而對(duì)于C/P嫁接苗在13 dag之前去除砧木子葉均可顯著抑制嫁接苗生長(zhǎng)和根系活力，并以0 dag時(shí)去除砧木子葉的抑制作用最強(qiáng)。分析其原因，去除砧木子葉后導(dǎo)致子葉中貯存的淀粉無法為C/P嫁接苗接穗和根系生長(zhǎng)提供碳源，生長(zhǎng)受到顯著抑制，而在生長(zhǎng)后期砧木子葉的淀粉已經(jīng)基本被水解利用，因此去除子葉對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用消失。與此結(jié)果一致，去除砧木子葉引起C/P嫁接苗根系可溶性糖含量以及CmoCWIN1、CmoCWIN6、CmoHXK1和CmoHXK2等基因的表達(dá)水平降低。在嫁接后早期去除砧木子葉對(duì)生長(zhǎng)的抑制效果更加顯著，這是由于在早期嫁接苗需要消耗大量能量用于嫁接愈合[10, 39]，而去除砧木子葉需要消耗下胚軸等其他部位的碳源，進(jìn)一步導(dǎo)致供應(yīng)接穗和根系生長(zhǎng)的碳源減少，抑制生長(zhǎng)的效果加劇。對(duì)于P/P嫁接苗，砧木子葉大小和淀粉積累量均顯著低于C/P嫁接苗，砧木子葉中淀粉作為貯存性碳源的作用不顯著，且同源嫁接砧穗愈合更快，南瓜作為接穗，其葉片光合面積大，去除砧木子葉對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)的影響不顯著。

綜上所述，C/P單子葉貼接苗的砧木子葉可作為重要的緩沖器官，在嫁接后早期將光合作用產(chǎn)物以淀粉形式貯存起來，并在后期逐漸水解成葡萄糖等單糖，為嫁接苗接穗和根系的快速生長(zhǎng)提供碳源，在嫁接后早期去除砧木子葉在一定程度上會(huì)抑制嫁接苗的生長(zhǎng)。但是C/P嫁接苗的砧木子葉中為何會(huì)積累更多的淀粉？受哪些信號(hào)調(diào)控？這些信號(hào)在接穗和砧木間如何傳遞？這些問題將是下一步研究的重點(diǎn)。