陳江平，甘力帆，羅宇琴，鐘文峰，馬永富，魏梅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，臨床主要用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等［1］?，F(xiàn)代研究表明，白芷主要含有揮發(fā)油類、香豆素類、微量元素、多糖、黃酮類、生物堿類等多種成分［2］，其中香豆素類成分歐前胡素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等藥理作用［3-6］。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部白芷項(xiàng)下以歐前胡素含量作為白芷藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)［1］。

白芷配方顆粒為白芷飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有免煎煮、攜帶方便、易服用、易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，近年來，中藥配方顆粒得到越來越多的醫(yī)生和患者的選擇［7］。文獻(xiàn)研究表明［8-10］白芷的功效與其含有的揮發(fā)油、香豆素類成分密不可分，而很多成分如歐前胡素、異歐前胡素、白當(dāng)歸素、氧化前胡素等均有文獻(xiàn)報(bào)道遇熱不穩(wěn)定［11-12］，所以有必要對(duì)白芷配方顆粒建立全面的質(zhì)量控制方法。本研究建立了白芷配方顆粒歐前胡素含量測(cè)定方法和UPLC特征圖譜測(cè)定方法，可為白芷配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器Waters H-class超高效液相色譜儀及Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters儀器公司）；ME204E萬(wàn)分之一天平及XP26百萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Direct超純水機(jī)（德國(guó)默克股份有限公司）。

1.2 試劑與試藥歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110826-201616，含量：99.6%）、異歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110827-201611，含量：99.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白當(dāng)歸素（批號(hào)：wkq16031401，含量：98.0%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克股份有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。18批白芷配方顆粒由廣東一方制藥有限公司提供，編號(hào)為S1～S18。

2 方法與結(jié)果

2.1 歐前胡素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備取歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含59.8990 μg的歐前胡素對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備取白芷配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 專屬性考察取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑適量，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 白芷配方顆粒HPLC色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系考察分別精密量取濃度為59.8990 μg/mL的對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL置于10 mL量瓶中，分別加甲醇定容制成每1 mL含1.4974、2.9950、5.9899、14.9748、29.9495、59.8990 μg的對(duì)照品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得歐前胡素線性回歸方程：Y=25615.8274X+4409.6677（r2=0.9999），表明歐前胡素濃度在1.4948～59.8990 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度考察取濃度為5.9899 μg/mL的對(duì)照品溶液適量，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取白芷配方顆粒（S2）樣品適量，照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為2.72%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)取白芷配方顆粒（S2）樣品適量，照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算歐前胡素含量的RSD為1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的白芷配方顆粒（S2）樣品適量，研細(xì)，精密稱取9份，每份約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別加入相當(dāng)于含量50%、100%、150%的歐前胡素對(duì)照品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表1。

表1 歐前胡素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.1.10 樣品檢測(cè)取白芷配方顆粒（S1～S18）樣品，照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 18批白芷配方顆粒樣品中歐前胡素含量（n=3） mg/g

2.2 UPLC特征圖譜建立相關(guān)試驗(yàn)

2.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5.5 min，15%～28%A；5.5～7.0 min，28%～40%A；7.0～9.5 min，40%A；9.5～15.5 min，40%～65%A；15.5～15.51 min，65%～15%A；15.51～18.00 min，15%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；流速：0.35 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備取歐前胡素、異歐前胡素、白當(dāng)歸素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含歐前胡素10.001 μg、異歐前胡素1.835 μg、白當(dāng)歸素14.020 μg的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液制備取白芷配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn)取白芷配方顆粒（S2）樣品適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以4號(hào)峰歐前胡素為參照峰，計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.02%～0.09%、0.15%～0.80%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)取白芷配方顆粒（S2）樣品適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以4號(hào)峰歐前胡素為參照峰，計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.02%～0.15%、0.10%～0.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取白芷配方顆粒（S2）樣品適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)峰歐前胡素為參照峰，計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.02%～0.12%、0.08%～0.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.7 特征圖譜的建立取白芷配方顆粒（S1～S18）樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定得到18批白芷配方顆粒UPLC特征圖譜，以4號(hào)峰歐前胡素為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表3—4。確定了6個(gè)共有峰，與對(duì)照品對(duì)比確定2號(hào)峰為白當(dāng)歸素，4號(hào)峰為歐前胡素，6號(hào)峰為異歐前胡素，見圖2。

圖2 白芷配方顆粒U P LC色譜圖

表3 18批白芷配方顆粒共有峰相對(duì)保留時(shí)間

2.2.8 特征圖譜相似度評(píng)價(jià)將18批白芷配方顆粒的特征圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，生成白芷配方顆粒共有對(duì)照特征圖譜，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見圖3、表5。

表5 18批白芷配方顆粒特征圖譜相似度

圖3 18批白芷配方顆粒的UPLC特征圖譜

表4 18批白芷配方顆粒共有峰相對(duì)峰面積

3 討論

本研究在白芷配方顆粒歐前胡素含量測(cè)定方法建立過程中考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇和乙醇4種溶劑對(duì)歐前胡素含量的影響，結(jié)果表明甲醇、50%甲醇和稀乙醇的提取效果均較好，綜合考慮，選擇稀乙醇作為白芷配方顆粒歐前胡素含量測(cè)定的提取溶劑。也考察了不同提取方法（超聲、水浴回流）、不同溶劑體積（10、20、50、100 mL）和不同提取時(shí)間（15、30、40 min）對(duì)歐前胡素含量的影響，結(jié)果表明超聲提取方法優(yōu)于水浴回流提取方法，溶劑體積和提取時(shí)間對(duì)歐前胡素的含量無(wú)顯著影響。因此，選擇加入20 mL稀乙醇超聲處理30 min作為供試品溶液的制備方法。本研究結(jié)果表明18批白芷配方顆粒的歐前胡素含量范圍為0.411～0.846 mg/g，較為穩(wěn)定，這與原藥材質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定相關(guān)。

文獻(xiàn)表明，白芷總香豆素類成分與總揮發(fā)油類成分合用，具有明顯協(xié)同作用，在減輕炎癥和疼痛方面的藥理作用強(qiáng)于單一成分［8］。因此，僅控制白芷配方顆粒中單一成分的含量不能全面反映白芷配方顆粒的質(zhì)量情況。特征圖譜可較全面反映中藥制劑中所含主要成分與種類，從而達(dá)到對(duì)制劑整體質(zhì)量進(jìn)行控制的目的。本研究采用UPLC法建立了白芷配方顆粒特征圖譜，確定了6個(gè)共有峰，18批白芷配方顆粒樣品的相似度均大于0.9，說明樣品之間質(zhì)量差異小，較穩(wěn)定。可見，本研究建立的白芷配方顆粒歐前胡素含量測(cè)定方法及UPLC特征圖譜測(cè)定方法可較好地用于白芷配方顆粒的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。