敖菲，李海英

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，陜西 咸陽(yáng) 712000

盆腔炎性疾?。╬elvic inflammatory disease，PID）是婦科常見(jiàn)病、多發(fā)病，多見(jiàn)于月經(jīng)期婦女，是由于感染引起的女性上生殖道炎癥，臨床以腹痛為主要表現(xiàn)，短期可誘發(fā)輸卵管、卵巢和盆腔膿腫，長(zhǎng)期可誘發(fā)異位妊娠、不孕和慢性盆腔疼痛［1-2］。目前抗生素是治療盆腔炎的主要藥物［3］。研究發(fā)現(xiàn)，早期盆腔炎使用抗生素可基本痊愈，但慢性盆腔炎應(yīng)用抗生素治療具有明顯局限性［4］。隨著臨床研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)抗生素聯(lián)合桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎療效顯著［5-11］。

桂枝茯苓膠囊是目前臨床應(yīng)用較為廣泛的中藥制劑，始載于《金匱要略》，由桂枝、桃仁、牡丹皮、白芍、茯苓組成，方中以桂枝為君，桃仁為臣，牡丹皮、白芍、茯苓為佐，具有活血化瘀、緩消癥結(jié)的功效［12］，臨床被廣泛用于治療盆腔炎性疾病。研究發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓膠囊可緩解盆腔炎性疾病引起的下腹疼痛，縮小盆腔炎性包塊等癥狀、體征［13-16］。然而桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要活性成分和作用機(jī)制研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析藥物在各網(wǎng)絡(luò)模塊中與特定節(jié)點(diǎn)間的相互作用，從系統(tǒng)性、整體性角度探究藥物與潛在靶點(diǎn)間的作用關(guān)系的方法［17-18］。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為切入點(diǎn)，探討桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的有效活性成分及作用靶點(diǎn)，揭示其分子作用機(jī)制，對(duì)桂枝茯苓膠囊科學(xué)內(nèi)涵的闡釋及臨床推廣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 桂枝茯苓膠囊化學(xué)成分篩選運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）探索桂枝茯苓膠囊中各單味藥化學(xué)成分，根據(jù)研究結(jié)果，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（Druglikeness，DL）≥0.18為限制條件進(jìn)行篩選，得到桂枝茯苓膠囊的生物活性成分。

1.2 化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)庫(kù)和盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)庫(kù)構(gòu)建通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索桂枝茯苓膠囊中各單味藥化學(xué)成分靶點(diǎn)，將其靶點(diǎn)與Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中各靶點(diǎn)人類(lèi)基因簡(jiǎn)稱(chēng)進(jìn)行查詢(xún)，獲得桂枝茯苓膠囊可能存在的靶點(diǎn)；使用人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https：//www.genecards.org）以“Pelvin Inflammatory”為檢索詞，獲得盆腔炎相關(guān)靶基因。

1.3 藥物-疾病交集靶基因及藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在R中安裝VennDiagram包，獲得桂枝、桃仁、白芍、茯苓、牡丹皮活性成分與盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖和交集基因。使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因?qū)隨tring（https：//string-db.org）進(jìn)行相互作用蛋白查詢(xún)并構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI），物種設(shè)置為“人（Homo sapiens）”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為中等置信度“medium confidence（0.400）”，設(shè)置隱藏不連接的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶蛋白網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Perl腳本篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶蛋白。

1.5 基因本體論富集分析（gene ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)GO與KEGG（kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析主要用于注釋基因功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能，已被廣泛應(yīng)用于生物基因功能分類(lèi)。運(yùn)用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)Bioconductor對(duì)桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，研究桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要生物過(guò)程和代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓膠囊活性成分及靶點(diǎn)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共篩選出桂枝茯苓膠囊有效成分69個(gè)，其中桂枝7個(gè)，白芍13個(gè)，茯苓15個(gè)，桃仁23個(gè)，牡丹皮11個(gè)。69個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)4364個(gè)相關(guān)靶基因。通過(guò)Uniprot對(duì)靶點(diǎn)和基因信息標(biāo)準(zhǔn)化并去重最終獲得靶基因177個(gè)。見(jiàn)附表1。

2.2 盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得4253個(gè)盆腔炎相關(guān)基因。

2.3 藥物-疾病靶點(diǎn)將桂枝茯苓膠囊177個(gè)作用靶點(diǎn)與4253個(gè)盆腔炎靶點(diǎn)基因進(jìn)行韋恩分析，獲得藥物-疾病交集基因136個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，共有171個(gè)節(jié)點(diǎn)（化合物35個(gè)，靶點(diǎn)136個(gè)），見(jiàn)圖2。

圖2 桂枝茯苓膠囊-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-盆腔炎網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因篩選將136個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，運(yùn)用Perl腳本統(tǒng)計(jì)蛋白相互作用節(jié)點(diǎn)，將連接節(jié)點(diǎn)前30位基因進(jìn)行可視化，由圖可知，桂枝茯苓膠囊主要通過(guò)調(diào)控靶基因v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1，Akt1），白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），胱天蛋白酶3（recombinant Caspase 3，CASP3），JUN原癌基因（jun proto-oncogene，JUN），髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因（myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC），表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF），前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prosta-glandin-endoperoxide synthase2，PTGS2），雌激素受 體1基因（estrogen receptor1，ESR1），促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1），促分裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8），白細(xì)胞介素1B（interleukin 1B，IL1B），基質(zhì)金屬肽酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9），周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1），F(xiàn)OS基因（fos protooncogene，F(xiàn)OS），熱休克蛋白90Daα（heat shock protein 90kDa alpha，HSP90AA1），趨化因子（C-C基元）配 體2（chemokine（C-C motif）ligand 2 CCL2），基質(zhì)金屬肽酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2），過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT），白血病病毒癌基因同源物2（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ERBB2），人V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（human V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA），雄激素受體（androgen receptor，AR），細(xì)胞間黏附因子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1），胱 天 蛋 白 酶8（recombinant caspase 8，CASP8），一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3），過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor，gamma，PPARG），絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，進(jìn)化枝E（微管連接蛋白，纖溶酶原激活因子抑制因子型1），成員1（serpin peptidase inhibitor，clade E（nexin，plasminogen activator inhibitor type 1），member 1，SERPINE1），BCL2樣1（BCL2-like 1，BCL2L1），血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）抑制盆腔炎的發(fā)生發(fā)展。見(jiàn)圖3。

圖3 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎核心基因

2.6 GO功能分析通過(guò)Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果顯示桂枝茯苓膠囊主要與脂多糖、細(xì)菌來(lái)源分子、金屬離子、抗生素、活性氧、類(lèi)固醇激素等結(jié)合。細(xì)胞定位結(jié)果顯示桂枝茯苓膠囊主要集中在包膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡、核染色質(zhì)等方面。見(jiàn)圖4—5。

圖4 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點(diǎn)的GO富集分析“生物學(xué)功能”（前20）

分子功能結(jié)果顯示桂枝茯苓膠囊主要通過(guò)調(diào)控DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子激活、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類(lèi)固醇受體活性、氧化還原酶活性、組蛋白激酶活性影響疾病進(jìn)程。見(jiàn)圖6。

圖6 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點(diǎn)的GO富集分析“分子生物學(xué)功能”（前20）

2.7 KEGG通路富集分析通過(guò)Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，篩選出158條信號(hào)通路，選取前20條信號(hào)通路，可以看出，桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的靶點(diǎn)主要參與AGE-RAGE糖尿病并發(fā)癥、前列腺癌、動(dòng)脈粥樣硬化、皰疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、TNF信號(hào)、IL-17等信號(hào)通路。見(jiàn)圖7。

圖7 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎通路信息柱狀圖

2.8 基因-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建借助Cytoscape 3.7.2軟件將桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的136個(gè)靶基因及前20條通路進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“基因-通路”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有171個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)136個(gè)，通路20個(gè)），其中度值表示連接到1個(gè)節(jié)點(diǎn)的線(xiàn)條數(shù)，用來(lái)評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性。節(jié)點(diǎn)越大表明度值越大。見(jiàn)表2，圖8。

圖8 桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息

表2 桂枝茯苓膠囊活性成份治療盆腔炎通路基本信息（前20條）

圖5 桂枝茯苓膠囊-盆腔炎靶點(diǎn)的GO富集分析“細(xì)胞學(xué)組分”（前20）

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的“藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，得到35個(gè)活性成分，136個(gè)靶基因，158條信號(hào)通路。主要涉及靶基因Akt1、IL-6、VEGFA、CASP3、Jun、MYC、EGFR、EGF、PTGS2、ESR1、MAPK1、MAPK8、IL-1，IL-1B、MMP9、FOS等。GO富集和KEGG通路富集結(jié)果提示，AGE-RAGE糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路、前列腺癌通路、動(dòng)脈粥樣硬化通路、皰疹病毒感染通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路可能與桂枝茯苓膠囊干預(yù)盆腔炎的作用機(jī)制一致。其中，AGE-RAGE主要通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激作用于下游JNK、ERK1/2、Akt以調(diào)控炎性因子釋放。TNF信號(hào)通路主要通過(guò)作用于下游JNK、ERK干預(yù)炎性因子釋放。IL-17信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)控下游MAPK誘發(fā)炎性因子釋放。乙型肝炎、丙型肝炎主要通過(guò)PI3K/Akt和細(xì)胞凋亡途徑誘發(fā)細(xì)胞損傷。可見(jiàn)，PI3K/Akt、MAPK信號(hào)通路廣泛分布于各種細(xì)胞且在桂枝茯苓膠囊干預(yù)盆腔炎的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。桂枝茯苓膠囊可通過(guò)激活PI3K/Akt、MAPK信號(hào)通路抑制盆腔組織炎性因子及凋亡因子釋放。LI等［19］發(fā)現(xiàn)Akt、MAPK、1L-1β及IL-6在盆腔炎中高表達(dá)，提示Akt、MAPK誘發(fā)的炎癥反應(yīng)途徑是盆腔炎的重要發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3在盆腔炎患者中高表達(dá)［20-21］，提示細(xì)胞凋亡是盆腔炎的重要發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，盆腔炎是以結(jié)構(gòu)和功能改變?yōu)樘卣鞯亩嘁蛩丶膊?，越?lái)越多的研究證實(shí)中藥治療盆腔炎的有效性。探究中藥治療盆腔炎的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制對(duì)于盆腔炎的防治至關(guān)重要。本研究通過(guò)生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎的主要生物活性成分及其藥理作用機(jī)制進(jìn)行了分析，證實(shí)桂枝茯苓膠囊可能主要通過(guò)PI3K/Akt及MAPK信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，從而減輕盆腔炎。