張歡歡，曾麗盈，李莉

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲之前出現(xiàn)閉經(jīng)，伴促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高，雌激素（estradiol，E2）水平降低，并伴有一定圍絕經(jīng)期癥狀。散發(fā)性POF在小于40歲女性中發(fā)生率為1%，小于30歲女性為0.1%，小于20歲女性為0.01%［1-3］。其病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。西醫(yī)治療大多選用激素替代療法，遠(yuǎn)期療效不佳且有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)無“卵巢早衰”病名，按照其發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，可歸于“血枯”“閉經(jīng)”“婦人臟躁”等范疇。

中醫(yī)認(rèn)為腎藏精、主生殖，腎中精氣的盛衰與“腎-天癸-沖任-胞宮軸”的功能狀態(tài)密切相關(guān)，腎精氣虧虛、天癸早竭是本病的主要病機(jī)。治療應(yīng)以補(bǔ)腎填精為法，多項(xiàng)臨床研究表明二仙湯及仙茅-淫羊藿藥對能有效治療POF，曾活等［4］研究認(rèn)為二仙湯治療POF較常規(guī)西藥治療更具優(yōu)勢，能夠改善患者臨床癥狀，調(diào)節(jié)其內(nèi)分泌激素，而仙茅、淫羊藿兩者為此方君藥。仙茅為石蒜科多年生草本植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn的干燥根莖，具有補(bǔ)腎助陽、補(bǔ)益精血、強(qiáng)壯筋骨、行血消腫功效，主要用于腎陽不足、虛勞內(nèi)傷和陽虛冷瀉等病癥［5］。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿E.brevicornumMaxim.的全草，味辛、甘，具有補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨功效［6］。由于中藥及其復(fù)方并非由單一藥物、單一成分組成，其具有“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”的協(xié)同作用特點(diǎn)，療效往往取決于其中有效成分的綜合作用。但目前藥理研究大多分析了單藥成分作用機(jī)制，而本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法有助于進(jìn)一步探討仙茅-淫羊藿藥對治療POF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 POF疾病靶點(diǎn)的獲取以關(guān)鍵詞“Premature ovarian failure”在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫Gene Cards（https：//www.genecards.org）和Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）兩個(gè)疾病靶點(diǎn)篩選數(shù)據(jù)庫檢索獲取與POF相關(guān)靶標(biāo)基因，合并所獲得的數(shù)據(jù)，去除重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.2 仙茅與淫羊藿化學(xué)成分和成分靶點(diǎn)信息獲取使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）及數(shù)據(jù)庫（version 2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平臺，設(shè)定藥物成分口服生物利用度（oral bioavailability，OB≥30%）和 類 藥 性（drug-likeness，DL≥0.18）分析篩選出仙茅、淫羊藿中具有良好OB和DL的化合物及其靶點(diǎn)。將TCMSP篩選出的成分靶點(diǎn)全稱輸入DrugBank和UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取基因簡稱和Uniprot ID。

1.3 共同靶點(diǎn)獲取使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics（http：//bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）匹配映射藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)，繪制維恩圖獲得仙茅-淫羊藿活性成分治療POF的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape軟件（Version 3.6.2，http：//www.cytoscape.org）構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)（node）代表疾?。≒OF）、仙茅（XM）-淫羊藿（XLP）藥種、藥物活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；邊（edge）用來連接單味藥與活性成分、活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、疾病與其對應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)展示藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病之間的聯(lián)系。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）獲得PPI蛋白互作圖，通過Cytospace軟件制作hub圖。

1.6 基因本體論富集分析（gene ontology,GO）與KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析使用DAVID數(shù)據(jù)庫功能注釋工具（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）對獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，選擇P＜0.05結(jié)果分析仙茅-淫羊藿藥對發(fā)揮藥理作用的主要生物過程及信號通路，并利用ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）平臺以氣泡圖的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 POF疾病靶點(diǎn)基于GeneCards，Drugbank數(shù)據(jù)庫收集POF相關(guān)靶點(diǎn)基因，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，共收集到POF疾病作用靶點(diǎn)3254個(gè)，得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名和Uniprot ID的標(biāo)準(zhǔn)化。

2.2 仙茅-淫羊藿活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件檢索的仙茅潛在活性成分7個(gè)，淫羊藿潛在活性成分23個(gè)，見表1。

表1 仙茅-仙靈脾中潛在活性成分及其OB、DL值

2.3 仙茅-淫羊藿成分治療POF的潛在作用靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索仙茅-淫羊藿符合條件的潛在活性成分及其靶點(diǎn)，去重后，得到仙茅活性成分作用靶點(diǎn)61個(gè)，淫羊藿活性成分靶點(diǎn)217個(gè)。使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺將藥物潛在作用靶點(diǎn)基因同疾病基因進(jìn)行匹配并繪制維恩圖，獲得共同基因41個(gè)，見表2。

2.4 藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將仙茅、淫羊藿兩味藥物與POF的共同靶點(diǎn)及其對應(yīng)的化合物導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)共包含74個(gè)節(jié)點(diǎn)，667條邊。仙茅-淫羊藿30個(gè)活性成分直接與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因相連的有26個(gè)。見圖1—2。

圖1 POF疾病靶點(diǎn)基因與仙茅-淫羊藿靶點(diǎn)基因匹配情況

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)通過STRING數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，選取其中度值（Degree）較高的前10位基因，利用Cytoscape

3.2.1 繪制hub蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3—4。

圖2 藥物（仙茅-淫羊藿）-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)-疾病（POF）網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 Hub關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)圖

2.6 GO與KEGG通路富集分析GO功能富集結(jié)果顯示，仙茅-淫羊藿活性成分作用于POF的41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因涉及139個(gè)GO Terms，富集的生物學(xué)過程主要為藥物反應(yīng)（response to drug），RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter），DNA模板（positive regulation of transcription，DNA-templated），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction），對E2的反應(yīng)（response to estradiol），對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide），RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始（transcription initiation from RNA polymeraseⅡpromoter），細(xì)胞增殖的正調(diào)控（positive regulation of cell proliferation），凋亡過程（apoptotic process），腺苷酸環(huán)化酶活性的激活（activation of adenylate cyclase activity），對有毒物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance），肽基絲氨酸磷酸化（peptidyl-serine phosphorylation），老化（aging），ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade），血管生成（angiogenesis），化學(xué)性突觸傳遞（chemical synaptic transmission），細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（cell-cell signaling），細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控（negative regulation of cell proliferation），提示仙茅-淫羊藿可能通過調(diào)節(jié)上述主要生物學(xué)過程而發(fā)揮治療POF的作用。見圖5。

圖5 仙茅-淫羊藿活性成分治療POF共同靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過程富集分析

KEGG通路富集分析顯示，仙茅-淫羊藿的活性成分作用于POF的41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因有60個(gè)GO Terms，其主要富集相關(guān)通路為癌癥途徑、cAMP信號通路、病毒致癌、血清素能突觸、鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路、多巴胺能突觸、癌癥中的蛋白多糖、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞凋亡、p53信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、腫瘤壞死因子信號途徑、MAPK信號通路等，提示仙茅-淫羊藿的活性成分靶點(diǎn)可能通過上述通路作用于POF，可作為未來研究仙茅-淫羊藿藥對治療POF療效的重要方向。見圖6。

圖6 仙茅-淫羊藿活性成分治療POF共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討論

二仙湯是由張伯訥教授創(chuàng)制的經(jīng)驗(yàn)名方，以仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母為藥物組成，全方陰陽并用，以溫腎陽藥物仙茅、淫羊藿為主，故名“二仙湯”，臨床廣泛用于治療卵巢早衰、圍絕經(jīng)期綜合征、不孕癥等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明仙茅具有改善生殖軸功能以促生殖的作用，淫羊藿具有雌性激素樣作用［7-8］。

本研究結(jié)果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇3個(gè)活性成分作用于疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)基因最多。其中Degeree前3的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)榍傲邢偎谿/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、核受體共激活劑2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）及前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1），表明以上成分及基因是仙茅-淫羊藿治療POF的重要成分及重要靶點(diǎn)基因，在仙茅-淫羊藿藥對治療POF中有重要意義。β-谷甾醇、豆甾醇屬植物甾醇，是合成固醇類激素的前體，具有類雌激素作用，對雌激素受體具有親和力［9］。β-谷甾醇具有抗炎、調(diào)節(jié)人體甾體激素等作用，亦能夠刺激卵巢顆粒細(xì)胞分化［10-11］。槲皮素屬植源性黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)類似于固醇類雌激素，在體內(nèi)主要與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮弱雌激素樣作用［12］。因此，可認(rèn)為β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是該藥對治療POF的主要活性成分。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS）是合成前列腺素（PGs）的重要限速酶，目前發(fā)現(xiàn)該酶包含結(jié)構(gòu)型PTGS1和誘導(dǎo)型PTGS2兩類，但在組織分布和表達(dá)調(diào)控方面有明顯差異，PTGS1屬組成性表達(dá)，而PTGS2是誘導(dǎo)性酶，通常在炎性反應(yīng)、激素和腫瘤啟動子中被高度誘導(dǎo)［13］。卵巢顆粒細(xì)胞受LH刺激后可誘導(dǎo)PTGS2表達(dá)［14］。而前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是介導(dǎo)LH峰的關(guān)鍵，在卵泡發(fā)育中可直接刺激卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、卵母細(xì)胞成熟和卵子排出，其主要由顆粒細(xì)胞合成，分泌胞外后結(jié)合至卵丘細(xì)胞上的PGE2受體2和PGE2受體4（PTGER2、PTGER4），這兩種受體均通過活化胞內(nèi)偶聯(lián)的Gas蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，增加胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量并促進(jìn)透明質(zhì)酸合酶2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)介導(dǎo)蛋白6的合成，引起卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，因此由PTGS/PGESPGE2-PTGER構(gòu)成的PGE2網(wǎng)絡(luò)涉及卵泡發(fā)育的各個(gè)階段，尤其對細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的調(diào)節(jié)及類固醇的合成，并激活PKC/PKA等信號通路的傳導(dǎo)發(fā)揮了重要作用［15］。故仙茅-淫羊藿藥對可能通過調(diào)節(jié)PTGS2、PTGS1靶點(diǎn)，促進(jìn)PGE2合成，進(jìn)而促使卵泡發(fā)育和成熟。NCOA2屬類固醇受體輔激活因子家族，可與受體相互作用從而以一種配體依賴模式增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性［16］。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)度值較高，且與其他靶點(diǎn)相互作用較密切的有轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3，CASP3）、PTGS2、孕酮受體（progesterone receptor，PGR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARG）、雄 激 素 受體（androgen receptor，AR）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin dependent kinase 2，CDK2）等（顏色越深，度值越高），可視為中藥活性化合物發(fā)揮作用的核心基因。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)可激活CASP3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。PGR可介導(dǎo)孕酮的生理作用，屬于甾體激素核受體家族成員，作為配體活化的轉(zhuǎn)錄因子在生殖活動中以及對介導(dǎo)與調(diào)節(jié)卵巢、子宮、乳腺功能發(fā)揮重要作用［18-20］。AR可參與卵泡生長的調(diào)節(jié)［21］，POF患者中AR基因（CAG）n重復(fù)序列延長，引起AR功能減弱、雄激素活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致雄激素對卵泡生長的調(diào)節(jié)功能異常，從而造成卵巢功能減退，成為卵巢早衰的可能致病因素［22］。本研究通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證了仙茅-淫羊藿藥對中的化合物是通過多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)的方式發(fā)揮作用。

GO富集分析和KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)仙茅-淫羊藿藥對中活性成分可通過參與多種生物過程調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡等，這些靶點(diǎn)主要調(diào)節(jié)甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、TNF、P53、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）等信號通路發(fā)揮治療作用。其中甲狀腺素可恢復(fù)卵巢顆粒層-卵泡膜細(xì)胞上的FSH和LH受體并對內(nèi)源性促性腺素有促進(jìn)作用，從而促進(jìn)卵巢中殘存的始基卵泡發(fā)育［23-24］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）存在于卵母細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細(xì)胞增殖、分化，是細(xì)胞增殖和凋亡最主要的信號傳導(dǎo)通路之一［25］，PI3K-Akt的過度激活可促使原始卵泡過早發(fā)育及卵泡過快凋亡，進(jìn)而發(fā)展成為POF［26］。FSH可結(jié)合至卵巢顆粒細(xì)胞膜上的特異性受體并激活上游的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路繼而激活下游的PI3K/Akt通路和MAPK通路，誘導(dǎo)芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控雌激素和孕激素分泌，促使卵巢顆粒細(xì)胞成熟［27］，這對POF早發(fā)現(xiàn)、早治療甚至恢復(fù)卵巢功能有重要意義。TNF-α在體內(nèi)的含量上升會導(dǎo)致早期卵泡出現(xiàn)凋亡，加快顆粒細(xì)胞（卵巢）凋亡［28-29］。LIANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)p53信號通路可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。MAPK通路能夠調(diào)控基因表達(dá)及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［31］。因此，以上通路很可能是仙茅-淫羊藿藥對治療POF的潛在信號通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)仙茅-淫羊藿藥對中的β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等成分可能通過PTGS2、PTGS1、NCOA2等靶點(diǎn)作用于甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、腫瘤壞死因子信號途徑、P53、MAPK等多條信號通路發(fā)揮作用。因此，仙茅-淫羊藿藥對治療POF的藥理學(xué)機(jī)制可能是通過多組分、多靶點(diǎn)、多通路實(shí)現(xiàn)。但由于數(shù)據(jù)庫信息納入可能不全，中藥煎煮過程中成分的改變及相互作用，人體內(nèi)藥代動力學(xué)的影響等，納入分析的成分不一定能真實(shí)反映人體內(nèi)發(fā)揮治療作用的成分，故本研究存在一定局限性，其復(fù)雜的作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。