曹一欽，文昌暉，△，王秀琳，張玲麗，賈敏，李斌

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550001；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科；3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病［1］，其發(fā)病機(jī)制主要與遺傳、環(huán)境及機(jī)體免疫等因素相關(guān)；典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，局限或廣泛分布，無傳染性，治療困難，常終身帶?。恢饕±肀憩F(xiàn)為以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)為主的多種免疫細(xì)胞共同參與的免疫反應(yīng)引起角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖或關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞發(fā)生炎癥。

消疕湯是貴州省名中醫(yī)賈敏教授經(jīng)驗(yàn)方，在臨床運(yùn)用30來年，用于治療尋常型銀屑病進(jìn)行期中醫(yī)辨證屬血熱風(fēng)燥證者。金銀花、連翹二藥均為消疕湯的君藥，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為金銀花、連翹均有抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)免疫等作用［2-3］?，F(xiàn)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理探究金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病的分子通路及作用機(jī)制。

1 中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)等［4］，構(gòu)建關(guān)于金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病作用機(jī)制的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究銀屑病發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥治療提供思路。

1.1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1.1 金銀花-連翹化學(xué)成分和潛在作用靶標(biāo)收集依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版），通過TCMSP平臺(tái)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php，中國(guó)藥科大學(xué)）在中藥信息設(shè)定界面對(duì)“金銀花”“連翹”進(jìn)行檢索并收集其所有化學(xué)成分，同時(shí)按照篩選標(biāo)準(zhǔn)［5］口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30.0%和藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18選取有效成分，建立金銀花-連翹化學(xué)成分信息數(shù)據(jù)庫。通過TCMSP平臺(tái)Related Targets信息數(shù)據(jù)檢索界面，分別收集金銀花-連翹潛在作用靶標(biāo)，建立金銀花-連翹活性成分與潛在作用靶標(biāo)的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 銀屑病靶標(biāo)收集通過GeneCards平臺(tái)（https：//www.genecards.org），以銀屑病的英文名稱“Psoriasis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集到疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫中目前已知的銀屑病治療靶點(diǎn)作為金銀花-連翹藥對(duì)的候選治療靶標(biāo)，靶標(biāo)信息主要包括治療銀屑病藥物的名稱、療效、臨床應(yīng)用、作用靶標(biāo)的基因及蛋白質(zhì)等相關(guān)信息。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息（PPI）通過TCMSP整合了String平臺(tái)（https：//string-db.org/cgi/input.pl）等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息。以置信度得分大于0.4為篩選參數(shù)分析金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI，并通過Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值，根據(jù)度值的排序確定核心靶點(diǎn)。

1.1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析通過網(wǎng)絡(luò)綜合分析，構(gòu)建藥對(duì)潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間的PPI信息網(wǎng)絡(luò)特征值，運(yùn)用Cytoscape軟件的MCODE插件篩選蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的蛋白模塊，篩選關(guān)鍵蛋白模塊。取中藥靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，以度值=2、節(jié)點(diǎn)=2和最大深度=100作為篩選參數(shù)，選取藥對(duì)潛在靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)［6］。通過基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路，挖掘分析金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)疾病關(guān)鍵靶標(biāo)及其對(duì)應(yīng)的活性成分，并構(gòu)建“中藥-核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”的網(wǎng)絡(luò)通路圖，進(jìn)一步明確金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病的主要分子作用機(jī)制。

1.1.5 關(guān)鍵靶標(biāo)分析及通路富集結(jié)合TCMSP和String數(shù)據(jù)庫信息，整合GO（http：//www.gene ontology.org）和KEGG（http：//www.kegg.jp）資源，直接提取靶標(biāo)基因或蛋白質(zhì)分子功能、細(xì)胞內(nèi)定位及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路，運(yùn)用R軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)，將金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病的關(guān)鍵作用靶標(biāo)進(jìn)行基因功能和通路富集分析，以P值降序的方式將GO和KEGG計(jì)算分析的結(jié)果排列顯示，并應(yīng)用R軟件繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 金銀花-連翹藥對(duì)化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集得到金銀花活性成分236個(gè)，主要為有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類；連翹化合物150個(gè)，主要為苯乙醇苷類、木脂素類、萜類、黃酮類及揮發(fā)油類、生物堿類。按OB≥30.0%和DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)篩選后，金銀花-連翹藥對(duì)化合物與銀屑病相關(guān)的成分共28個(gè)，金銀花成分15個(gè)，連翹成分17個(gè)，兩藥相同成分4個(gè)：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol），藥對(duì)度值≥20個(gè)共6個(gè)，占21.43%。由此可見，“金銀花-連翹”中的候選化合物分子可能多靶標(biāo)、多途徑作用于整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，提示金銀花和連翹在共性靶標(biāo)之間存在明顯潛在加成作用。見表1。

表1 “金銀花-連翹”藥對(duì)干預(yù)銀屑病的28個(gè)活性成分

對(duì)“金銀花-連翹”藥對(duì)活性成分通過TCMSP平臺(tái)進(jìn)行作用分析，取Degree排名前20，得到候選靶標(biāo)具有的基因功能信息涉及：前列腺素G/H合酶1和2、半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspase）-3和9、胰蛋白酶-1、間質(zhì)膠原酶、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu2，核受體輔激活劑、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑，鈉通道蛋白型5亞基α，β-2腎上腺素能受體、聚乙二醇腎上腺素能受體、雌激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ、雄激素受體，鉀電壓門控通道亞科H成員，γ-氨基丁酸受體亞基α-1、轉(zhuǎn)錄因子AP-1、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子等。

2.2 “金銀花-連翹”藥對(duì)治療銀屑病的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)共獲得銀屑病相關(guān)差異基因3601個(gè)，藥對(duì)共同作用靶點(diǎn)127個(gè)，其中金銀花115個(gè)，連翹121個(gè)，兩藥相同的靶標(biāo)112個(gè)。

通過TCMSP的PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“金銀花-連翹”藥對(duì)的潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，取排名前30，得到候選靶標(biāo)基因，Akt1、ALB、IL6、VEGFA等靶標(biāo)排名靠前?；蚬δ苄畔⑸婕埃捍萍に厥荏w(estrogen receptor，ESR)、核激素受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)受體，調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，抑制活化巨噬細(xì)胞、輔助T細(xì)胞的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)新陳代謝、血管生成、脂肪分解，促炎細(xì)胞因子、炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)蘇氨酸激酶、酪氨酸蛋白激酶、受體酪氨酸激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞外刺激引起的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，EGF受本信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、SAP/JNK信號(hào)通路、胸腺-磷酸（MAP）激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路等。由此可知銀屑病的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)病理環(huán)節(jié)的不同分子作用過程。見圖1。

圖1 “金銀花-連翹”藥對(duì)的潛在靶標(biāo)（前30名）

2.3 金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病關(guān)鍵靶標(biāo)的GO基因功能分析通過GO功能分析“金銀花-連翹”藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)基因功能，獲得138個(gè)條目，具有顯著意義的有127個(gè)條目（P＜0.01），采用P值降序和基因富集數(shù)量綜合過濾，對(duì)其進(jìn)行排序，前20名的生物學(xué)功能主要涉及：核受體的活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體活性、受體配體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶整合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白磷酸酶整合、四吡咯整合、激素受體結(jié)合、核激素受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、整合蛋白結(jié)合、BH功能點(diǎn)位整合，見表2、圖2。

圖2 “金銀花-連翹”藥對(duì)候選靶標(biāo)具有的功能信息氣泡圖（前20名）

表2 “金銀花-連翹”藥對(duì)候選靶標(biāo)具有的功能信息

2.4 “金銀花-連翹”藥對(duì)治療銀屑病KEGG的通路富集分析KEGG通路富集分析共獲得155條通路，具有顯著意義的有145條通路（P＜0.01），采用P值降序和基因富集數(shù)量綜合過濾，前20名干預(yù)銀屑病的主要作用通路涉及：糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、前列腺癌、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、膀胱癌、蛋白多糖在癌癥中的作用、南美錐蟲?。乐掊F蟲?。⒁认侔?、C型凝集素受體信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、內(nèi)分泌抗性、結(jié)腸直腸癌、甲型流感、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路、麻疹，其中PI3K-Akt信號(hào)通路的度值最高（Degree=31）。見圖3—4、表3。

表3 “金銀花-連翹”藥對(duì)候選靶標(biāo)參與的通路信息

圖3 “金銀花-連翹”藥對(duì)候選靶標(biāo)參與的通路信息氣泡圖（前20名）

圖4 “金銀花-連翹”藥對(duì)干預(yù)銀屑病關(guān)鍵靶標(biāo)通路信息

3 討論

消疕湯有清熱疏風(fēng)、涼血止癢功效。研究發(fā)現(xiàn)：消疕湯可以降低銀屑病患者血清中促炎細(xì)胞因子水平（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-17、IL-22、IL-23等），升高抑炎因子（TGF-β1、SOD、IL-10等）水平，升高血清Treg細(xì)胞比例，使得Th17/Treg水平趨于平衡，以調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)、控制炎癥反應(yīng)［7-10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，消疕湯可以抑制銀屑病模型組大鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞的角化不全及角化過度，并減少炎癥細(xì)胞在皮損部位的浸潤(rùn)［11］。銀屑病屬中醫(yī)學(xué)“白疕”范疇，多因素體營(yíng)血虧虛，血熱內(nèi)蘊(yùn)，化燥生風(fēng)，肌膚失養(yǎng)而成。李斌教授［12-13］認(rèn)為尋常型銀屑病的病機(jī)為血熱陽浮，以熱為主，病位在血分，血熱是根本病機(jī)，宜“從血論治”，并使用辛散宣發(fā)或輕清宣透之品，使伏藏的邪氣或由表或由上而解，或由里達(dá)外而解。金銀花、連翹二藥為消疕湯中的君藥，性味輕揚(yáng)宣散，有清熱涼血、發(fā)散宣透功效。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為：金銀花、連翹有抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)免疫作用［2-3］。金銀花-連翹藥對(duì)度值最高的化學(xué)成分是槲皮素、木犀草素，均為黃酮類?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為槲皮素是一種黃酮類抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用［14］，可減少（IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10、G-CSF、TNF-α和VEGF）等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［15］，增加抗炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10和TGF-β1等）水平［16］，還可以抑制TGF-β1過度表達(dá)［17］，從而發(fā)揮抗炎作用。WILLIAMS等［18］研究發(fā)現(xiàn)：槲皮素是廣泛的激酶抑制劑，可作用于PI3K-Akt通路，調(diào)節(jié)酪氨酸激酶、蛋白激酶C（PKC）和絲裂原活化蛋白激酶水平。木犀草素有消炎、抗過敏、降尿酸、抗菌、抗病毒等作用［3］。

目前認(rèn)為銀屑病的發(fā)生發(fā)展與T輔助細(xì)胞（Th）、樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞（MC）、角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）及其分泌的細(xì)胞因子之間復(fù)雜的相互作用密切相關(guān)。喬菊等［19］認(rèn)為TNF-α信號(hào)通路、IL-17通路在銀屑病發(fā)病機(jī)制中有重要作用。丁琦等［20］發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清Th17和IL-17水平上升，Treg表達(dá)下降，進(jìn)一步證實(shí)了Th17/Treg失衡是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因素。銀屑病的重要病理改變是皮損區(qū)微循環(huán)異常及血管內(nèi)皮功能受損，予改善血管內(nèi)皮功能及調(diào)節(jié)微循環(huán)的藥物治療后可緩解病情［21-22］。角質(zhì)形成細(xì)胞過速增殖也是其病理特征之一，其機(jī)制尚不清楚。張淼等［23］認(rèn)為：PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)研究銀屑發(fā)病機(jī)制有一定指導(dǎo)作用。

PI3K-Akt信號(hào)通路：目前研究表明PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞存活的重要通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、血管新生、細(xì)胞能量代謝和腫瘤細(xì)胞侵襲等多個(gè)過程，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等功能中起重要作用［24］，Akt是PI3K的下游靶蛋白，也是PI3K信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，通過磷酸化其下游FoxO、mTOR等蛋白來調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡。國(guó)內(nèi)外研究表明，銀屑病的發(fā)生涉及一個(gè)未知的環(huán)境因素，它作用于遺傳易感性宿主，從而觸發(fā)炎性和免疫性級(jí)聯(lián)反應(yīng)［25-27］。應(yīng)激化角質(zhì)細(xì)胞釋放出一系列因子激活真皮層樹突細(xì)胞，后者隨后進(jìn)入淋巴結(jié)釋放出IL-12和IL-23，促進(jìn)T細(xì)胞分化為Th1和Th17細(xì)胞，并通過趨化因子和黏附分子轉(zhuǎn)移至真皮層和表皮層，之后激活的T細(xì)胞在真皮層激活巨噬細(xì)胞并釋放出眾多的炎性細(xì)胞因子（包括TNF-α、IFN-γ和IL-17），繼而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的活化和增殖，臨床表現(xiàn)為銀屑病斑塊。Akt是PI3K信號(hào)通路下游直接的靶蛋白，Akt活性增強(qiáng)可引起角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖和真皮乳頭血管增生［28］。

IL-17信號(hào)通路：在外界刺激下DC過度分泌TNF-α和IL-23（包括IL-12），IL-23誘導(dǎo)幼稚T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IL-22水平升高。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞是一種CD4+T淋巴細(xì)胞亞群在不同條件下分化生成，分別介導(dǎo)免疫耐受與炎癥反應(yīng)，兩者在功能上相互拮抗。在銀屑病起始階段，未知的環(huán)境刺激或耐受性喪失（例如自身抗原活化）導(dǎo)致TNF的產(chǎn)生和隨后皮膚樹突細(xì)胞的活化，來自皮膚樹突細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-23大量增加，隨后刺激Th17細(xì)胞、CD4+輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加，產(chǎn)生大量IL-17、IL-22和TNF-α［29］，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-1β、IL-6和TNF-α以及表皮角質(zhì)細(xì)胞的依賴性增殖。IL-17與其相應(yīng)受體結(jié)合后激活下游p38MAPK信號(hào)通路［30］，繼而上調(diào)IL-6表達(dá)，直接刺激銀屑病患者表皮增生［31］；IL-17可上調(diào)IKKα/β磷酸化，通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)趨化因子、細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α、COX-2），導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集移行并聚集于銀屑病皮損之中，IL-17還可誘導(dǎo)生成VEGF，從而誘發(fā)或加重銀屑病皮損。Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IFN-γ水平升高，抑制性Treg細(xì)胞數(shù)量減少，分泌的抑制性細(xì)胞因子IL-10含量減低，可誘發(fā)皮損區(qū)炎癥細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞聚集浸潤(rùn)、增生，致使銀屑病久治不愈［29-32］。

TNF信號(hào)通路：TNF-α是一種重要的促炎癥性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的作用，可引起機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［33］。TNF-α可直接促進(jìn)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞增生［34］。TNF-α能通過激活銀屑病相關(guān)基因與IL-17協(xié)同活化角質(zhì)形成細(xì)胞，募集嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，過度分泌的TNF-α反作用于DC刺激異常免疫反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行［35］，TNF-α可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞來表達(dá)VEGF，促進(jìn)銀屑病患者真皮乳頭層毛細(xì)血管的擴(kuò)張和扭曲，以及斑塊的形成［36］。TNF-α參與全身過敏反應(yīng)，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子表達(dá)［37］，從而促進(jìn)血管增生，加重銀屑病皮損。

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)金銀花-連翹藥對(duì)干預(yù)銀屑病的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和分子通路機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究消疕湯干預(yù)銀屑病提供了思路。由于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)不全，且忽略了中藥成分含量、相互作用以及體內(nèi)其他藥代動(dòng)力學(xué)影響等，具體機(jī)制有待臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究，因此本研究尚有一定局限性。