任 薇，李曉珺，張 倩，李楚文△

(1.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州 510095；2.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 511436)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦瘤，約占全部腦瘤的80%，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最惡性的腦腫瘤，目前的治療方式有腫瘤切除、化療、放療、抗血管類靶向藥物治療等，但由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長快速，廣泛浸潤?quán)徑X組織，假性壞死和誘導(dǎo)血管生成，且無明顯的作用靶點，阻礙了療效，且膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差，70%的膠質(zhì)瘤患者在第1次術(shù)后10年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。因此，尋找直接且密切相關(guān)的靶點、探索膠質(zhì)瘤的潛在機制、尋找新的治療方法或更好的藥物具有重要意義。近年來，在分子水平上對膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的發(fā)病由異常的病理過程所致，如細(xì)胞周期調(diào)控、信號傳導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)缺陷等[2]。因此，迫切需要在遺傳和分子水平上更好地了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，以確定新的治療策略。

姜黃素是一種天然化合物，具有抗腫瘤作用，對肝癌、乳腺癌均具有抑制增殖、調(diào)節(jié)信號通路等多種作用[3-4]。姜黃素在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物為四氫姜黃素(THC)，其比姜黃素在生理條件下更穩(wěn)定，在水介質(zhì)中更易溶解，而且在血漿中具有良好的穩(wěn)定性，因而具有更高的生物利用度[5-11]。THC具有抗氧化和抗炎作用，以及預(yù)防治療阿爾茲海默癥等功能，對多種癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性。基于此，本研究探討了THC對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，揭示其對過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)/核因子-κB(NF-κB)信號通路調(diào)控的機制，旨在為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新策略，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

來自美國菌種保藏中心(ATCC)的大鼠 C6 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。

1.1.2藥物與試劑

THC購自上海源葉生物科技有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素(分別取100 U/mL-100 μg/mL)購自美國Sigma-Aldrich公司，含 0.25% 1 mmol胰蛋白酶的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液購自美國Thermo Fisher Scientific公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：M5655)，裂解緩沖液(RIPA)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，二氫乙錠(DHE)-活性氧(ROS)檢測試劑盒(MCH100111)購自德國Merck Millipore公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國Merck Millipore公司，Muse?caspase-3/7試劑盒(MCH100108)購自德國Merck Millipore公司，RNA分離試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，SuperScriptTMⅣ一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，SYBR Green預(yù)混液購自美國Applied Biosystems公司，二辛可寧酸Pierce(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Bio-Rad公司，PPARγ、NF-κB、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白(β-actin)均購自美國Cell Signaling Technology公司，增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)測定試劑盒購自美國GE Healthcare公司。

1.1.3主要儀器

酶標(biāo)儀(800TS)購自美國BioTek Instruments公司，流式細(xì)胞術(shù)(Muse?Cell Analyzer)購自德國Merck Millipore公司，StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及THC處理

使用含有10%FBS和1%青鏈霉素雙抗(PS)的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育C6細(xì)胞，于培養(yǎng)瓶中貼壁生長至80%～90%時用含有0.25% 1 mmol/L胰蛋白酶的EDTA溶液分離C6細(xì)胞。加入新鮮配制不同濃度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 μmol/L)的THC藥液至96孔板中，每孔加100 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h，取出96孔板，棄舊培養(yǎng)基，再避光加入0.5 mg/mL新鮮制備的MTT溶液，每孔加100 μL。在黑暗中于培養(yǎng)箱中孵育3 h。棄上清液，將形成的甲臜晶體溶解在100 μL 100%二甲基亞砜(DMSO)中。用酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度值。為計算細(xì)胞活力將未經(jīng)THC處理的細(xì)胞視為對照組，并假設(shè)這些細(xì)胞是100%有活力的。以下公式用于計算未經(jīng)處理和經(jīng)THC處理的C6細(xì)胞的存活率[(THC處理的細(xì)胞吸光度-空白吸光度)∕(未處理細(xì)胞吸光度-空白吸光度)×100%]。根據(jù)MTT結(jié)果，通過相應(yīng)的圖譜確定25%(IC25)、50%(IC50)和75%(IC75)濃度的THC分別為25.0、50.0、75.0 μmol/L，0 μmol/L作為對照組用于后續(xù)分析。

1.2.2細(xì)胞裂解物制備和生化分析

將C6細(xì)胞(5×103)置于96孔板中孵育，并加入25、50、75 μmol/L濃度的THC處理黏性細(xì)胞24 h，用于生化分析。用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌細(xì)胞，再使用胰蛋白酶將黏附的細(xì)胞與96孔板分離，然后置于離心管中4 ℃、1 000 g離心5 min。將沉淀在PBS中洗滌2次，然后將重懸于RIPA中的500 mL放射免疫沉淀測定中的沉淀與RIPA在4 ℃下在軌道振蕩器中溫育20 min。將沉淀物4 ℃、10 000 g離心20 min獲得細(xì)胞碎片。使用ELISA試劑盒測量經(jīng)IC25、IC50、IC75濃度的THC處理的細(xì)胞裂解物中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8-OHdG)和總抗氧化劑(TAS)水平。

1.2.3ROS 生成量檢測

使用DHE-ROS檢測試劑盒檢測經(jīng)25、50、75 μmol/L濃度的 THC孵育24 h的C6細(xì)胞中ROS生成量。在室溫條件下取10 μL經(jīng)THC處理和未經(jīng)THC處理的細(xì)胞懸液(2×106)，用移液管加入190 μL Muse?氧化應(yīng)激試劑工作溶液，充分混合，將混合物在37 ℃下孵育30 min，然后在Muse?Cell Analyzer中測量。

1.2.4Annexin V-FITC/PI染色和caspase-3/7測定

使用 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒評估THC誘導(dǎo)的C6細(xì)胞凋亡。將C6細(xì)胞(2×106)接種于6孔板中生長，并將貼壁細(xì)胞與25、50、75 μmol/L濃度的THC一起溫育24 h。用胰蛋白酶分離細(xì)胞，用PBS進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC和1 μL碘化丙啶在 25 ℃下在黑暗中溫育15 min，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。通過測量caspase-3/7的活化確定THC處理組和對照組細(xì)胞凋亡狀態(tài)。將細(xì)胞(2×106)與25.0、50.0、75.0 μmol/L 濃度的THC一起溫育24 h，用PBS洗滌胰蛋白酶消化細(xì)胞，并將5 μL Muse?caspase-3/7工作溶液加入50 μL的細(xì)胞。在37 °C下孵育30 min后將150 μL 7-AAD添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，充分混合并在Muse?cell Analyzer上進(jìn)行測量。

1.2.5定量實時逆轉(zhuǎn)錄 PCR

通過定量實時逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析未經(jīng)THC處理和經(jīng)THC處理24 h的C6細(xì)胞(2×106)中PPARγ mRNA的表達(dá)。在實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 程序中根據(jù)說明用RNA分離試劑盒提取總RNA。純化后的RNA在無酶無菌水中洗滌后使用NanoDropTM2000/2000c以A260/A280比率確定其質(zhì)量和濃度。用 SuperScriptTMⅣ一步法實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)從總RNA中合成cDNA。PPARγ、β-肌動蛋白的引物：PPARγ正向引物5′-CCC TTT ACC ACG GTT GAT TTC TC-3′和反向引物 5′-GCA GGC TCT ACTTTG ATC GCA CT-3′；β-肌動蛋白正向引物 5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3′和反向引物 5′-CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C-3′。在StepOnePlusTM實時PCR系統(tǒng)及其軟件程序中使用SYBR Green預(yù)混液擴增cDNA。熱循環(huán)曲線：在95 ℃下進(jìn)行10 min的預(yù)孵育步驟，然后在95 ℃下進(jìn)行45個循環(huán)的變性步驟10 s，在55 ℃下進(jìn)行1 min的退火步驟，并在72 ℃下進(jìn)行10 s的延伸步驟。根據(jù)擴增后的循環(huán)數(shù)(Ct)值確定PPARγ、β-肌動蛋白轉(zhuǎn)錄水平。使用β-肌動蛋白mRNA水平作為內(nèi)標(biāo)，并使用公式2-ΔΔCT確定相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 THC對C6細(xì)胞活力的抑制作用

與對照組比較，12.5 μmol/L濃度THC處理24、48 h,以及25.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細(xì)胞活力均明顯降低，12.5 μmol/L濃度THC孵育72 h組C6細(xì)胞較對照組減少22.7%，25.0 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細(xì)胞較對照組分別減少23%、33%、40%，50.0 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細(xì)胞較對照組分別減少48%、66%、78%，75 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細(xì)胞較對照組分別減少70%、79%、89%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；100.0 μmol/LTHC濃度未檢測到任何細(xì)胞。見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.2 THC調(diào)節(jié)C6細(xì)胞中8-OhdG、TAS水平

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細(xì)胞8-OHdG水平均明顯升高，TAS水平均明顯降低，75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細(xì)胞8-OHdG水平最高，TAS水平最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A：8-OHdG；B：TAS;a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 THC誘導(dǎo)的C6細(xì)胞氧化應(yīng)激

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細(xì)胞ROS生成量均明顯升高，75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細(xì)胞ROS生成量最高(約為57%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A：流程數(shù)據(jù)圖；B：ROS；a：P<0.05，與對照組比較。

2.4 THC觸發(fā)C6細(xì)胞凋亡

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6細(xì)胞凋亡率均明顯增高，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細(xì)胞凋亡率最高，caspase-3/7活性明顯增強，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細(xì)胞 caspase-3/7 活性最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

A：AnnexinV-FITC凋亡分析；B：caspase-3/7活性；a：P<0.05，與對照組比較。

2.5 THC對C6細(xì)胞NF-κB、PPARγ mRNA水平的影響

與對照組比較，25.0 μmol/L 濃度THC處理C6 細(xì)胞NF-κB mRNA水平略下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6 細(xì)胞NF-κB mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6細(xì)胞PPARγ mRNA水平均明顯增加，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細(xì)胞PPAR mRNA水平最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

A：NF-κB mRNA；B：PPARγ mRNA；a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

本研究探討了不同持續(xù)時間(24、48、72 h)和濃度THC處理是否可通過觸發(fā)各種生化機制在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中引起抗腫瘤作用，確定了C6細(xì)胞的IC25、IC50和IC75，結(jié)果顯示，THC可調(diào)節(jié)C6細(xì)胞中8-OhdG、TAS水平，8-OHdG水平上調(diào)和TAS水平下降在THC處理C6細(xì)胞中呈濃度依賴性，THC濃度越大C6細(xì)胞中8-OHdG水平越高，TAS水平越低；并且可誘導(dǎo)C6細(xì)胞氧化應(yīng)激，經(jīng)THC處理C6細(xì)胞中ROS積累顯示出濃度依賴性，THC濃度越大C6細(xì)胞中ROS生成量越高。通過PPARγ/NF-κB信號通路分析了氧化、凋亡和DNA損傷機制，結(jié)果顯示，THC處理24 h后活細(xì)胞比率降低。凋亡細(xì)胞比例及caspase-3/7活性存在THC濃度依賴性，THC濃度越大細(xì)胞凋亡率越高，細(xì)胞caspase-3/7活性越強，并且THC濃度的增加引起C6細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)增加和NF-κB抑制?？梢奣HC處理上調(diào)了C6細(xì)胞PPARγ mRNA水平并降低了NF-κB mRNA水平，提示PPARγ、NF-κB通過誘導(dǎo)氧化和凋亡機制誘導(dǎo)DNA損傷。

ROS可引起細(xì)胞大分子生物分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的氧化[12]。腫瘤細(xì)胞的高增殖導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加和異常的氧化還原穩(wěn)態(tài)[13]。通過增強抗氧化防御機制優(yōu)化氧化負(fù)荷，從而阻止ROS誘導(dǎo)的生物分子的氧化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力阻礙了過量的ROS產(chǎn)生，從而抵抗細(xì)胞凋亡[15]。同樣C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PPAR激動劑治療未能改變過氧化氫酶的表達(dá)和酶活性[16]。因DNA螺旋中的核堿基與ROS相互作用而形成的8-OHdG是最豐富的DNA損傷和潛在的生物標(biāo)志物[17]。本研究結(jié)果顯示，在THC處理C6細(xì)胞中ROS產(chǎn)生和DNA損傷以劑量依賴性方式增加，而細(xì)胞增殖受到抑制。C6細(xì)胞中THC誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生與TAS水平的降低呈比例。此外，本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞ROS水平的增加導(dǎo)致DNA損傷，增加8-OHdG水平。ALMAMUN等[18]研究也表明，THC治療通過誘導(dǎo)紅細(xì)胞中的氧化應(yīng)激增加ROS的產(chǎn)生。

caspase通過外在和內(nèi)在的促凋亡信號機制啟動程序性細(xì)胞死亡，對凋亡程序的啟動至關(guān)重要[19]。協(xié)調(diào)細(xì)胞凋亡破壞階段的caspase-3/7的激活是細(xì)胞凋亡的一個特征[20]。PPARγ激動劑可通過多種信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡激活PPARγ，如增加腫瘤細(xì)胞系中促凋亡蛋白的表達(dá)或通過改變線粒體膜電位導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)中[21]。據(jù)文獻(xiàn)報道，PPARγ的活化降低了抗凋亡蛋白的表達(dá)，并增加了A375細(xì)胞系中凋亡蛋白的表達(dá)[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)THC處理的A549細(xì)胞抗凋亡蛋白和腫瘤抑制基因表達(dá)降低，而caspase-3/7活性增加；THC及其衍生物已被證明通過caspase-3、caspase-9激活途徑誘導(dǎo)C6、U-87 MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[23-25]。

NF-κB是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖誘導(dǎo)遷移和侵襲，特別是在癌細(xì)胞中具有結(jié)構(gòu)活性的NF-κB上調(diào)氧化應(yīng)激和DNA損傷，以及壞死性細(xì)胞死亡[26]。據(jù)文獻(xiàn)報道，PPARγ與NF-κB的物理相互作用通過降低NF-κB對炎癥啟動子的結(jié)合親和力抑制NF-κB信號通路[27]。有研究表明，MCF-7乳腺癌細(xì)胞中二十二碳六烯酸處理通過PPARγ mRNA表達(dá)的增加引起NF-κB抑制[28]。另有研究表明，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB的失活或抑制通過下調(diào)抗凋亡蛋白及上調(diào)凋亡蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)[29-30]。THC具有介導(dǎo)PPARγ抑制炎癥、血管生成和轉(zhuǎn)移的潛力[25]。本研究對PPARγ、NF-κB測定的結(jié)果顯示，THC處理C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過增強PPARγ的表達(dá)和活化使NF-κB蛋白水平降低，觸發(fā)C6細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果可能有望用于解決治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物抗性問題。

綜上所述，作為 PPARγ激動劑的THC在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯示出濃度和時間依賴性抗腫瘤作用，通過引起細(xì)胞PPARγ mRNA水平的增加引起NF-κB抑制，從而誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞凋亡；此外，在THC處理的細(xì)胞中觀察到8-OHdG水平的增加和TAS水平的降低。本研究通過PPARγ/NF-κB信號通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中證實了THC的促細(xì)胞凋亡作用。但尚需在動物體內(nèi)模型進(jìn)行研究和驗證，也是后續(xù)將要關(guān)注的重點。本研究結(jié)果為將THC開發(fā)為治療神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的新藥提供了參考依據(jù)。