郭宜城，羅美蘭，許時貴，李小蘭，付志媛

(1.江西省皮膚病?？漆t(yī)院藥劑科，南昌 330001；2.江西省皮膚病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南昌 330001)

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率為1%～3%[1-3]，容易反復(fù)發(fā)作，給患者帶來巨大困擾。銀屑病的致病原因尚未完全闡明，涉及遺傳學(xué)、免疫系統(tǒng)和環(huán)境暴露等因素，如白細胞介素17(IL-17)和IL-23認為是疾病的關(guān)鍵驅(qū)動因素[4-5]，細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6等在功能上參與發(fā)病過程[6]。

自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)的進化保守過程，是缺陷細胞器、錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，以及某些老化蛋白質(zhì)的自我降解[7]。自噬與自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[8-10]，自噬相關(guān)基因(ARGs)死骨片1在銀屑病皮損區(qū)中表達顯著增強，激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白抑制自噬對IL-17a介導(dǎo)的銀屑病具有積極的治療作用[11]。

近年來，隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，基于測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析可高效地處理大量樣本數(shù)據(jù)，并提供疾病的有價值信息。WANG等[12]基于生物信息學(xué)方法得到趨化因子(C-X-C型)配體 9(CXCL9)、脯氨酸的小蛋白1B(SPRR1B)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶6(TGM6)和 S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)4個銀屑病進展的關(guān)鍵基因，其中CXCL9對炎癥過程中具有關(guān)鍵作用的單核細胞、嗜中性粒細胞和T淋巴細胞具有很強的趨化作用[13]；SPRR1B被確定為牛皮癬的潛在生物標志物[14]；TGM6則影響角質(zhì)形成細胞的分化[15]；S100A9因趨化、黏附和嗜中性粒細胞的脫粒作用在銀屑病炎性反應(yīng)的擴增過程中發(fā)揮作用[16]。然而利用生物信息學(xué)分析銀屑病自噬相關(guān)關(guān)鍵基因(Hub)鮮有文獻報道，本研究選擇基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO數(shù)據(jù)庫)中銀屑病的測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析和驗證，探討Hub和潛在治療藥物，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建的基因數(shù)據(jù)庫，收錄全球范圍研究機構(gòu)提交的基因表達數(shù)據(jù)，是目前使用最廣泛的基因數(shù)據(jù)庫之一。通過GEOquery包從該數(shù)據(jù)庫下載GSE41662、GSE13355兩個數(shù)據(jù)集的表達譜，其中GSE41662作為分析數(shù)據(jù)集，GSE13355作為驗證數(shù)據(jù)集，具體信息見表1。通過箱式圖查看樣本標準化的情況，通過主成分分析(PCA)圖查看樣本分組間聚類情況。另外通過HAMdb數(shù)據(jù)庫(http://hamdb.scbdd.com/home/index/)收集ARGs。

表1 數(shù)據(jù)集GSE41662、GSE13355具體信息

1.2 方法

1.2.1分析和篩選自噬相關(guān)差異表達基因(DEARGs)

使用R語言Limma包分析GSE41662數(shù)據(jù)集中皮損區(qū)和正常區(qū)皮膚組織樣本之間的差異表達基因(DEGs)，篩選條件：P≤0.05、|log2(FC)|>1，采用R語言ggplot2包繪制火山圖。運用DrawVennDiagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be)工具對DEGs、ARGs作韋恩圖取交集得到DEARGs，并通過Complex Heatmap包繪制熱圖。

1.2.2基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析

采用ClusterProfiler包和ggplot2包對DEARGs進行GO生物過程和KEGG通路富集分析及結(jié)果可視化，均以P<0.05作為分析標準。

1.2.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及Hub分析

STRIN數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫之一，收錄超過14 000個物種、200多億個相互作用，通過該數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEARGs的PPI，篩選條件為combined score>0.4，刪除游離點，隨后將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.72軟件，利用 MCODE算法插件篩選DEARGs最顯著模塊，條件為MCODE score>5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k score=2，得到Hub。

1.2.4Hub驗證

采用GSE13355作為驗證數(shù)據(jù)集，分析Hub表達水平。此外，采用受試者工作特征(ROC)曲線評估Hub與銀屑病的相關(guān)性。

1.2.5藥物分子預(yù)測

DGIdb數(shù)據(jù)庫(www.DGIdb.org/)是一個包含了NCBI Entrez、DrugBank、PharmGKB等臨床試驗數(shù)據(jù)及PubMed已經(jīng)發(fā)表的文獻數(shù)據(jù)等30個來源的綜合數(shù)據(jù)庫。通過搜索DGIdb數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能逆轉(zhuǎn)異常表達Hub的潛在治療藥物，并構(gòu)建藥物-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用DGIdb數(shù)據(jù)庫分析可能與血管緊張素Ⅱ受體1(AGTR1)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、瘦素(LEP)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)、IL6相互作用的藥物，過濾條件選擇Approved(已批準)。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的獲取

共篩選出1 428個DEGs，其中上調(diào)基因647個(45.3%)，下調(diào)基因781個(54.7%)，樣本標準化情況箱式圖見圖1A。數(shù)據(jù)集中于皮損區(qū)和正常區(qū)能顯著分離。見圖1B。差異分析結(jié)果可靠。結(jié)果的火山圖見圖1C。

A：樣本標準化情況箱式圖；B：GSE41662數(shù)據(jù)集PCA分析；C：DEGs火山圖，紅色代表上調(diào)，藍色代表下調(diào)。

2.2 DEARGs篩選

將獲得的DEGs與收集到的797個ARGs取交集得到39個DEARGs，其中上、下調(diào)基因分別為23個(59.0%)和16個(41.0%)。見圖2A。表達熱圖和箱式圖見圖2B～D。DEARGs差異表達見表2。

表2 DEARGs差異表達

A:DEGs、ARGs韋恩圖；B:DEARGs表達熱圖;C、D:DEARGs在樣本中的表達差異箱式圖。

2.3 富集分析

DEARGs主要參與炎性反應(yīng)調(diào)控、細胞因子分泌調(diào)節(jié)、自噬調(diào)控，以及IL-8與IL-17的調(diào)節(jié)等生物過程；主要細胞成分位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、濃縮染色體及紡錘絲微管；主要分子功能為受體激活劑活性、絲氨酸/蘇氨酸酶活性、細胞因子活性及脂肪酸結(jié)合等相關(guān)。見圖3A。DEARGs主要參與腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、脂肪細胞因子、NOD樣受體、胰島素抵抗等通路。見圖3B。

A：GO功能富集分析結(jié)果氣泡圖；B：KEGG通路富集分析圓圈圖。

2.4 PPI構(gòu)建及Hub篩選

運用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEARGs的PPI，其由27個節(jié)點和46條邊組成。見圖4A。通過Cytoscape的MCODE插件篩選出最顯著模塊得到Hub，分別是AGTR1、PPARG、LEP、ADIPOQ、NAMPT和IL-6。見圖4B。

A：構(gòu)建 DEARGs的PPI；B：MCODE篩選出最顯著的模塊。

2.5 Hub驗證

Hub在驗證數(shù)據(jù)集皮損區(qū)與正常區(qū)皮膚樣本的表達水平顯示,PPARGC1B、NAMPT、IL6在皮損區(qū)樣本中的表達量明顯高于正常區(qū)皮膚樣本，表明基因PPARGC1B、NAMPT、IL6可能在銀屑病發(fā)病過程中具有促進作用；而AGTR1、LEP、ADIPOQ在皮損區(qū)樣本中的表達量明顯低于正常區(qū)皮膚樣本，表明AGTR1、LEP、ADIPOQ可能具有抑制銀屑病進展的作用。見圖5A。AGTR1、PPARG、LEP、ADIPOQ、NAMPT、IL6的ROC曲線下面積分別為0.946、0.961、0.810、0.763、0.995、0.887，見圖5B，與表達水平分析結(jié)果一致。表明Hub在銀屑病疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了作用。

A：Hub在驗證數(shù)據(jù)集GSE13355皮損區(qū)和正常區(qū)皮膚組織樣本的表達差異；B：6個Hub的ROC曲線。

2.6 藥物-基因相互作用

包括環(huán)孢素、阿達木單抗、利妥昔單抗、異環(huán)磷酰胺在內(nèi)的77種藥物與Hub存在相互作用，NAMPT未找到匹配的潛在治療藥物。見圖6。

紅色圓圈代表基因，藍色方形代表藥物。

3 討 論

目前，僅有少量研究探索了銀屑病與ARGs的關(guān)系。目前研究證實，自噬相關(guān)16樣蛋白1缺失會誘發(fā)細胞死亡、組織損傷和炎癥，其多態(tài)性與銀屑病相關(guān)[17]。抑制自噬可刺激角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生自主的細胞增殖抑制[18]。在這項研究中選擇了基于GPL570平臺的數(shù)據(jù)集GSE41662對24例銀屑病患者的皮膚組織轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)進行分析，篩選出39個DEARGs，并構(gòu)建PPI得到6個Hub，基于GSE13355數(shù)據(jù)集和ROC曲線進行驗證，結(jié)果均提示這些基因通過自噬通路參與了銀屑病的疾病進展，最后預(yù)測出77個潛在的治療藥物。

在分析得到的Hub中AGTR1可作為介導(dǎo)自噬效應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子[19]，已證實可通過干擾銀屑病患者表皮細胞自噬、介導(dǎo)角質(zhì)形成細胞增殖抑制發(fā)揮緩解病癥的作用[20]。PPARG是脂肪細胞脂肪酸沉積的關(guān)鍵因子[21]，其干預(yù)飽和脂肪酸代謝而改善脂代謝紊亂可對銀屑病皮損改善具有積極作用，與本研究結(jié)果一致，有研究發(fā)現(xiàn)，LEP在進展期銀屑病患者中表達顯著增高[22]，可能與LEP 的T1型細胞因子釋放促進及Th2型細胞因子抑制對銀屑病的免疫病理過程有關(guān)，其直接相關(guān)性需進一步證明。ADIPOQ具有炎癥及促炎細胞因子IL-2、IL-6、IL-8的雙重抑制作用，同時增加抗炎細胞因子的分泌，可能對銀屑病的炎癥狀態(tài)具有極大的改善作用[23-24]。NAMPT介導(dǎo)的 NAD+代謝促進了銀屑病皮膚中Th1/Th17 細胞因子誘導(dǎo)的過度增殖和終末分化損害進而加快了銀屑病的進程[25]，抑制其表達能否控制疾病尚需深入研究。IL-6被認為是銀屑病炎癥活性的標志物[26]，參與了TNF-α、IL-23、IL-17信號通路的銀屑病易感性位點，同時還與遺傳易感性和對TNF-α抑制劑的反應(yīng)有關(guān)[27]。另外，有研究表明，IL-6介導(dǎo)的慢性炎癥狀態(tài)可拮抗自噬[28]，表明IL-6是通過多途徑影響銀屑病的進展。本研究中部分Hub已有相應(yīng)的銀屑病基礎(chǔ)研究成果支持，說明本研究預(yù)測結(jié)果的可靠性，同時NAMPT、ADIPOQ的表達或功能在銀屑病基礎(chǔ)研究中未見文獻報道，提示NAMPT、ADIPOQ可能為銀屑病的診治提供新的研究思路。

本研究富集分析結(jié)果顯示，DEARGs與炎性反應(yīng)、細胞因子、自噬、IL等多種免疫反應(yīng)相關(guān)的功能活化有關(guān)，與銀屑病是炎癥細胞浸潤和炎癥細胞因子介導(dǎo)的炎癥性皮膚病這一共識一致，同時也表明自噬在銀屑病發(fā)病過程中的重要作用。KEEG富集分析提示，DEARGs涉及單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)、脂肪細胞因子、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體、胰島素抵抗等通路，其中AMPK是自噬生理過程中的關(guān)鍵位點，該位點激活后通過促使結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2和mTOR調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，進而導(dǎo)致雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mTORC1)復(fù)合物下調(diào)和促進Unc-51樣激酶1(ULK1)磷酸化的雙重作用激活自噬過程[29]。脂肪細胞因子、NOD樣受體、胰島素抵抗等通路均涉及代謝功能方面的調(diào)節(jié)，通常銀屑病與其他代謝性疾病合并發(fā)生，目前研究表明，銀屑病嚴重程度評分與高密度脂蛋白膽固醇外流能力呈負相關(guān)，高密度脂蛋白膽固醇外流能力與銀屑病患者冠狀動脈疾病負擔(dān)直接相關(guān)[30]。

干預(yù)銀屑病自噬的潛在藥物預(yù)測中，阿達木單抗特異性地與 TNF-α 結(jié)合并阻斷其與細胞表面TNF受體p55、p75的相互作用而發(fā)揮治療作用。一項阿達木單抗治療銀屑病的臨床試驗中，研究組71%患者皮損狀態(tài)得以改善,而安慰劑組僅為7%[31]。環(huán)孢素影響干擾素γ和IL-2等炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄，抑制角質(zhì)形成細胞DNA的合成與增殖用于銀屑病的治療[32]。異環(huán)磷酰胺抑制T淋巴細胞增殖和干擾素γ產(chǎn)生而改善銀屑病皮損狀況和炎性反應(yīng)[33]。氯沙坦降低血管緊張素受體Ⅰ(AT1R)和 IL-17a表達，減輕咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠的紅斑、鱗屑及真皮T淋巴細胞浸潤[34]。但篩選的潛在藥物中有一些是尚未被文獻報道具有逆轉(zhuǎn)銀屑病的功能，其治療銀屑病的可能性尚需更進一步的論證。

本研究運用生物信息學(xué)方法取得了預(yù)期研究結(jié)果，然而仍存在一定的局限：(1)樣本中患者與對照者在年齡分布方面存在的差異導(dǎo)致結(jié)果無法區(qū)分不同年齡患者自噬水平的差異；(2)本研究分析數(shù)據(jù)均取自于GEO數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)的準確性和樣本量的有限性可能會造成研究結(jié)果的偏差，需要在后續(xù)的基礎(chǔ)實驗及臨床實踐中加以驗證。

總之，本研究運用生物信息學(xué)分析了銀屑病自噬相關(guān)的Hub，并預(yù)測了涉及的信號通路及與Hub存在相互作用的潛在治療藥物，為研究銀屑病的發(fā)病機制和治療靶點提供了新的思考。