聶發(fā)龍，鄭儉彬，朱紫陌，向 彬，李秀芳

(云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500)

腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是嚴重威脅老年人健康的疾病，其具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，是全球醫(yī)學(xué)界面臨的挑戰(zhàn)[1]。CIRI的病理機制較為復(fù)雜，包括神經(jīng)炎癥[2]、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[3]、興奮性毒性[4-5]、神經(jīng)元凋亡和壞死[4，6-7]。其中，神經(jīng)炎癥反應(yīng)與腦缺血后神經(jīng)繼發(fā)性損傷的有著重要聯(lián)系，持續(xù)的神經(jīng)炎癥會誘發(fā)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。小膠質(zhì)細胞異?；罨閷?dǎo)的炎癥是CIRI的關(guān)鍵病理機制。因此，減輕小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)可能是CIRI治療的有效途徑之一[8-9]。有研究表明[10]，天麻多個酚性成分對異常活化小膠質(zhì)細胞具有很好的抗炎作用，這些酚性成分可通過抑制NF-κB 信號通路和 LPS 刺激的小膠質(zhì)細胞中MAPK的磷酸化，顯著減輕神經(jīng)毒性，具有作為神經(jīng)退行性疾病的抗炎候選藥物的潛力[11]。課題組前期將4個具有抗CIRI活性的天麻酚性成分對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、3，4-二羥基苯甲醛、4-甲氧基芐醇采用均勻設(shè)計的方法，篩選得到了具有較高活性的抗CIRI、抗血小板聚集及抗動脈粥樣硬化作用的活性成分組合物(下文簡稱：組合物)。本實驗采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激BV2小膠質(zhì)細胞炎癥模型，對該組合物對神經(jīng)炎癥的影響進行了考察，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗細胞 小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫。昆明細胞庫(KCB)編號：KCB200770YJ。

1.1.2 實驗藥品和試劑 RPMI Medium 1640(1X)(美國Gibco，REF：11875-093)、脂多糖(Lipopoiysaccharides，LPS)(美國Sigma，L2880)、胎牛血清(FBS)(美國Gibco，REF：10099-141)、青鏈霉素雙抗(Penicillin-Streptomycin)(美國Invitrogen，REF：15140-122)、一氧化氮(NO)一步法測試盒(REF：A013-2)、小鼠IL-6 ELISA試劑盒(REF：201603031)、IL-10(REF：201603031)、IL-1β(REF：201603031)、TNF-α(REF：201603031)、PGE2(REF：201603031)均購買于南京建成生物工程研究所。Anti-Mannose Receptor antibody(abcam，Lot：GR248262-7)、Anti-CD16+CD32 antibody(FITC)(bcam，Lot：GR276159-1)、aPE Rat Anti-Mouse IgG1(BD Biosciences，Lot：5310917)。天麻酚性成分組合物(含對羥基苯甲醛0.023 mg/mL、對羥基苯甲醇0.031 mg/mL、4-甲氧基芐醇0.021 mg/mL、3，4-二羥基苯甲醛0.19 mg/mL)，IL-4(美國Sigma，0309AFC49)、陽性對照藥米諾環(huán)素(Minocycline hydrochloride)(美國Sigma，M9511)。

1.1.3 實驗儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(311)(美國 Thermo scientific 公司)、倒置顯微鏡(Ti-S)(日本Nikon公司)、分析天平(XS125A)(瑞士普利賽斯)、酶標儀(Infinite M200 PRO)(瑞士Tecan公司)、低溫高速離心機(cf16RX)(Hitachi Koki公司)、高壓蒸汽滅菌器(SN310C)(日本 Yamato 公司)、電子分析天平(AB204-S)(瑞士Mettler toledo公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S24)(金壇市大地自動化儀器廠)、流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 組合物對BV-2細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL。繼續(xù)正常培養(yǎng)細胞2 d，第3 d用不完全培養(yǎng)基饑餓處理1 d，第4 d加入不同濃度的含藥且不含血清的培養(yǎng)基，實驗細胞設(shè)為空白組(只加培養(yǎng)基)、正常組、陽性對照組、組合物組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，將96孔培養(yǎng)板放入37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h，每孔中加入MTS溶液36 μL，放入培養(yǎng)箱孵育2 h后，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度(以O(shè)D值表示)，計算細胞相對存活率，計算公式如下：

細胞存活率(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)]×100%

1.2.2 組合物對 LPS刺激致BV-2細胞炎癥模型的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。實驗細胞設(shè)為正常組、LPS組(1μg/mL)、陽性對照組、組合物+LPS組，繼續(xù)正常培養(yǎng)細胞2天，第3 d用無血清培養(yǎng)基饑餓1 d，第4 d正常組和LPS組加入不完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入不完全培養(yǎng)基配置的1 μmol/L米諾環(huán)素，組合物組加入不完全培養(yǎng)基配置的組合物(10、1、0.1μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，模型組、陽性對照組、組合物組均給予1 μg/mL的LPS刺激，正常組給予等量的PBS，24 h后，收集細胞上清液，按照NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和IL-10的ELISA試劑盒說明書步驟操作，測定OD值，計算細胞上清液中的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和IL-10的含量。

1.2.3 組合物對LPS刺激BV-2細胞膜蛋白CD16/32、CD206表達的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。實驗細胞設(shè)為正常組、LPS組(1 μg/mL)、陽性對照組(1 μmol/L的米諾環(huán)素)、IL-4組(10 ng/mL)、組合物組(10、1、0.1、0.01 μg/mL)。繼續(xù)正常培養(yǎng)細胞2 d，第3 d用無血清培養(yǎng)基饑餓處理，第4 d正常組和LPS組加入不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽性對照組、IL-4組、組合物組分別加入不含血清培養(yǎng)基配置的各組濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，LPS組、IL-4組、陽性對照組、組合物組均給予1 μg/mL的LPS刺激，正常組給予等量的PBS，24 h后，流式細胞儀檢測膜蛋白CD16/32、CD206表達。調(diào)整各組細胞濃度調(diào)為1×106個/mL。膜蛋白CD16/32采用細胞表面直接免疫熒光染色方法檢測，膜蛋白CD206采用細胞表面間接免疫熒光染色法檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 組合物對BV-2細胞增殖的影響 結(jié)果顯示，組合物在0.001～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)作用于BV-2細胞 24 h對 BV-2細胞增殖無明顯影響。詳見表1。

表1 組合物對BV-2細胞存活率的影響

2.2 組合物對LPS刺激致BV-2細胞炎癥模型的影響 結(jié)果顯示，1 μg/mL LPS刺激BV2細胞后，細胞上清中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量均比正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示模型復(fù)制成功；米諾環(huán)素組、組合物高濃度組均能明顯減少LPS刺激BV-2細胞釋放NO、TNF-α、IL-6、PGE2的含量(P<0.05或P<0.01)；LPS刺激后，IL-10含量有下降趨勢，給予組合物1 μg/mL、0.5 μg/mL可促進IL-10的釋放。詳見表2。

表2 組合物對LPS刺激BV-2細胞釋放NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IL-10的影響

2.3 組合物對LPS刺激BV-2細胞活化后細胞膜蛋白CD16/32、CD206表達的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，LPS組的膜蛋白CD16/32、CD206、CD206/CD16/32的表達均無明顯變化，與模型組比較，10 ng/mL的IL-4和1 μmol/L的米諾環(huán)素均能下調(diào)膜蛋白CD16/32的表達(P<0.01)和上調(diào)膜蛋白CD206、CD206/CD16/32的表達(P<0.01)，10、1、0.1、0.01 μmol/L的組合物均能下調(diào)膜蛋白CD16/32的表達(P<0.01)，1、0.1、0.01 μmol/L的組合物均能上調(diào)膜蛋白CD206、CD206/CD16/32的表達(P<0.01)。詳見表3、圖1。

表3 組合物對LPS誘導(dǎo)BV-2細胞活化后膜蛋白CD16/32、CD206表達的影響

圖1 組合物對LPS誘導(dǎo)BV-2細胞活化后膜蛋白CD16/32、CD206表達的影響

3 討論

近年來的植物化學(xué)和藥理研究共同表明，中藥及其復(fù)方的藥效往往不是由單一的活性成分來發(fā)揮，而是多種活性成分綜合效應(yīng)的結(jié)果?！敖M分中藥”概念的提出，簡化了中藥的多成分論，為研究中藥復(fù)雜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的思路和方法[12]。組分中藥的有效性具有大量臨床應(yīng)用背景作為依據(jù)，并且在對有效成分的組合配比篩選過程中，加強了對特定病癥的針對性活性篩選，進一步為組分中藥后續(xù)的藥效學(xué)成藥性及安全性成藥性研究奠定了基礎(chǔ)[13]。課題組前期的研究顯示，天麻及其多個活性成分具有較好的抗CIRI作用，在組分中藥研究思路的指導(dǎo)下，采用均勻設(shè)計的方法，對天麻4個酚性成分對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、3，4-二羥基苯甲醛、4-甲氧基芐醇抗CIRI活性進行了優(yōu)化篩選，得到的組合物除具有明顯抗CIRI活性外，還具有顯著的抗血小板聚集、抗血栓形成及抗動脈粥樣硬化作用[14]。但對組合物是否具有減輕CIRI后神經(jīng)炎癥作用尚不清楚，故進行了本實驗的研究。

神經(jīng)炎癥是CIRI疾病發(fā)展中一個重要且不可避免的病理過程[15]，減輕CIRI后的神經(jīng)炎癥是改善預(yù)后的重要途徑之一。小膠質(zhì)細胞是介導(dǎo)CIRI后神經(jīng)炎癥的主要細胞類型。本實驗采用LPS刺激致BV2小膠質(zhì)細胞炎癥模型為研究對象，對組合物的作用進行了考察，結(jié)果顯示采用1μg/mL濃度的LPS刺激BV-2細胞24h可成功復(fù)制BV2細胞炎癥模型。

正常情況下，高度分枝狀靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞為大腦提供了一個高度動態(tài)和高效的監(jiān)測系統(tǒng)，當腦內(nèi)發(fā)生炎癥、感染、創(chuàng)傷或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，小膠質(zhì)細胞迅速被激活并獲得吞噬功能。具有不同表型的活化小膠質(zhì)細胞是缺血性卒中的雙刃劍[16-18]。當免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時，小膠質(zhì)細胞的表型可以轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€極端：經(jīng)典激活的M1(促炎)表型和交替激活的M2(抗炎)表型。不同的小膠質(zhì)細胞表型在調(diào)節(jié)炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展和停止中起著重要作用。因此，與單純抑制M1激活相比，抑制M1表型同時刺激M2表型被認為是治療神經(jīng)炎性疾病的一種潛在的治療方法[19-20]。本實驗的結(jié)果顯示，組合物(10μg/mL)能明顯減少LPS刺激BV-2細胞釋放NO、TNF-α、IL-6、PGE2的含量(P<0.05，P<0.01)；促進抗炎因子IL-10釋放，下調(diào)M1型BV2小膠質(zhì)細胞膜蛋白CD16/32的表達(P<0.01)和上調(diào)M2型小膠質(zhì)細胞膜蛋白CD206表達，并提高CD206/CD16/32的比值(P<0.01)。以上結(jié)果表明，組合物具有明顯減輕LPS刺激導(dǎo)致的BV2細胞炎癥反應(yīng)，其作用途徑可能與抑制促炎的M1型小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為抗炎的M2型小膠質(zhì)細胞有關(guān)。天麻4個酚性成分的組合物具有作為減輕CIRI后神經(jīng)炎癥藥物開發(fā)的潛力，其促進小膠質(zhì)細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變的深入機制有待進一步研究。