田新岳， 馬春芳， 張 雯， 吳春燕， 邵 倩，崔生玲， 楊 奇， 余永濤

（1.寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏 銀川 750004）

抗生素是指由微生物或高等動植物產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性，能干擾其他細菌發(fā)育功能的一類次級代謝產(chǎn)物[1]。抗生素能通過抑制細菌細胞壁合成，增強細菌細胞膜通透性，干擾細菌蛋白質(zhì)合成以及抑制細菌核酸復制來發(fā)揮抑菌作用。

抗生素被廣泛應用于細菌感染的治療，如氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類抗生素，可用于治療需氧革蘭氏陰性桿菌所致的感染，β-內(nèi)酰胺類抗生素對梅毒、鉤端螺旋體等的感染也具有良好的治療作用；四環(huán)素主要用于治療立克次體、衣原體、螺旋體的感染，也可用于惡性腫瘤、各種囊腫及頑固性胸腔疾病的治療?？股匾脖粡V泛應用于畜禽感染的治療。如大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、替米考星）常用于治療因金黃色葡萄球菌引起的乳房內(nèi)感染；林可酰胺類抗生素（林可霉素）用于治療和控制疾病，如豬的痢疾和豬增生性腸病，雞的壞死性腸炎，奶牛的急性乳腺炎和綿羊的傳染性足腐病[2]；氨基糖苷類抗生素鹽酸大關霉素用于治療動物呼吸吸道和胃腸道等疾病。

近年來，人們越來越關注自然環(huán)境中新興的有機污染物——藥物殘留[3-4]。在藥物研究中，抗生素類藥物由于其對細菌耐藥性發(fā)展和對自然社區(qū)的毒性以及最終對公共健康的影響而被列為優(yōu)先事項[5]?？股卦诃h(huán)境中的殘留，可以促進細菌中單一、交叉和多重耐藥性的形成。一旦抗生素抗性基因存在于自然環(huán)境中，它們可能不會消失，甚至會在細菌群落之間橫向轉(zhuǎn)移到人類。農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的植物可能通過廢水再利用來吸收抗菌藥物和耐藥基因，進而可能接觸動物和人類，給人類造成嚴重危害。據(jù)報道[6-7]抗生素類藥物可以抑制土壤分解能力，發(fā)揮其潛在的遺傳毒性作用，對生物造成生態(tài)危害，并影響當?shù)丨h(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)。人類體內(nèi)大部分病原體耐藥性的產(chǎn)生與人類使用抗生素藥物有關[8]。因此，加強抗生素類藥物的監(jiān)管，對生態(tài)環(huán)境保護具有重要的意義。

據(jù)統(tǒng)計，《中華人民共和國藥典》（2020 版）[9]收錄抗生素品類366 種，《中國獸藥典》（2015 版）[10]收錄抗生素品類81 種，《獸藥質(zhì)量標準》（2017 版）[11]收錄抗生素類藥物58 種。在上述藥典或標準中，用于藥品中抗生素含量檢測的方法主要有抗生素微生物檢定法、紫外-可見分光光度法和液相色譜法等。近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法、氣相色譜法、液相色譜飛行時間質(zhì)譜法等也被廣泛應用到藥品抗生素含量檢測的研究和應用中。本文對近年來抗生素含量檢測方法的研究和應用進行綜述，以期為抗生素類藥物的質(zhì)量控制和研究應用提供新的思路。

1 抗生素微生物檢定法

抗生素微生物檢定法是通過檢測抗生素對微生物的抑制作用來計算抗生素活性的一種方法，主要包括管碟法和比濁法?？股匚⑸餀z定法采用活菌檢測，靈敏度高，能直接顯示抗生素的抗菌效價，是諸多抗生素含量檢測不可或缺的方法，特別是由生物發(fā)酵產(chǎn)生的多種組分抗生素，主要采用該法來測定其含量。目前，抗生素微生物檢定法被廣泛用于諸多抗生素類藥物的含量測定。

1.1 管碟法

管碟法是抗生素效價測定的國際通用方法，管碟法是利用抗生素在瓊脂中的擴散作用，形成抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小計算生物活性的一種方法。目前，管碟法仍在各國藥典中廣泛應用。管碟法的抑菌原理是抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈。根據(jù)擴散定律的推導，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關系，根據(jù)抑菌圈直徑的大小即可計算抗生素生物活性。

《中華人民共和國藥典》（2020 版）所描述的抗生素含量測定方法有4 種，其中有71 種抗生素采用抗生素微生物檢定法，約占抗生素類藥物的25.4%。如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素乙酰螺旋霉素、吉他霉素；氨基糖苷類如妥布霉素；β 內(nèi)酰胺類如磺芐西林鈉等?！吨袊F藥典》（2015 版）所描述的抗生素含量檢測方法有2 種，其中31 種采用抗生素微生物檢定法，約占抗生素類藥物的39%。如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如硫氰酸紅霉素、吉他霉素、泰樂菌素、紅霉素；氨基糖苷類抗生素如安普霉素、卡那霉素、鹽酸大觀霉素、鏈霉素、新霉素；四環(huán)素類如土霉素；多肽類抗生素如桿菌肽鋅等。目前，歐盟藥典和美國藥典依然采用管碟法，如泰萬菌素、大觀霉素、酒石酸泰樂菌素采用管碟法測定效價。《獸藥質(zhì)量標準》（2017 版）所描述的抗生素含量測定方法有3 種，約64%的抗生素采用抗生素微生物檢定法測定效價，如土霉素注射液和土霉素鈣預混劑。

除用于藥品抗生素含量測定外，管碟法還廣泛應用于飼料添加劑中非法添加抗菌藥物的檢測和藥物生產(chǎn)中間產(chǎn)物的檢測等。楊修鎮(zhèn)[12]應用管碟法對獸藥散劑中非法添加抗菌藥物進行了快速檢測。Biarnes-Carrera M 等[13]應用管碟法和卡那霉素生物法測定鏈霉素的中間產(chǎn)物。管碟法也被應用于檢測一些物質(zhì)的生物活性。如李文婷等[14]利用管碟法測定檢測重組蛋白的生物學活性，發(fā)現(xiàn)重組蛋白對大腸桿菌、雛沙門菌均具有體外抑菌活性。ShaoyingLi等[15]用管碟法測定乳酸菌菌株對喹諾酮類藥物的抵抗力。管碟法可以檢測組分復雜的發(fā)酵類藥物的效價，直接檢測其微生物活性，這是高效液相色譜法等化學方法所不能替代的。

管碟法操作復雜，對環(huán)境和操作人員要求高，易受環(huán)境因素影響。而高效液相色譜（HPLC）法操作簡單，快速，精密度高，一些藥物的含量測定逐步采用HPLC 法代替抗生素微生物法。如《中國藥典》（2015版）采用抗生素微生物檢定法測定紅霉素軟膏中紅霉素的含量，劉玲[17]建立HPLC 法測定紅霉素軟膏中紅霉素的含量，快速，操作簡單，線性范圍良好?！吨袊F藥典》（2010 版）[16]將乳糖酸紅霉素、硫酸卡那霉素的含量檢測方法修訂為HPLC 法，使得含量檢測更方便。恩拉霉素目前采用的含量檢測方法為抗生素微生物檢定法，而劉雅晶[17]建立了HPLC 法檢測恩拉霉素的含量，與抗生素微生物檢定法相比，HPLC 法快速，便捷，精密度更好，HPLC 法的重復性RSD 為0.48%，遠遠高于抗生素微生物法的3.26%。林仙軍[18]用HPLC 法測定那西肽預混劑并與抗生素微生物檢定法進行比較，差異不顯著。高效液相色譜法影響因素少，線性范圍大，操作更便捷，出結(jié)果更快，用于那西肽預混劑實際檢測中效率更高。王麗霞等[19]建立了HPLC 法檢測藥物含量，在100～900 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回收率為99.6%，RSD 為0.55%，穩(wěn)定性良好，與抗生素微生物法檢測結(jié)果相對偏差為0.42%，該方法穩(wěn)定性良好，操作簡單，更適合于企業(yè)對大觀霉素的質(zhì)量檢控。

雖然管碟法操作誤差大，易受環(huán)境影響，但是它可以用來測定多種組分抗生素，直接測定其生物活性，這是HPLC 法所不能替代的，所以依然在抗生素含量檢測中廣泛應用。

1.2 比濁法

比濁法是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌的生長抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對細菌生長的抑制程度，以測定供試品效價的一種方法。此法適用于能制成均勻混懸液的微生物，抗生素可應用該方法進行效價檢測。與管碟法比，比濁法對系統(tǒng)要求低，不易受環(huán)境、人員的影響，具有快速、靈敏度高、易操作等優(yōu)點。Mariane 等[20]建立了比濁法測定乳劑中夫西地酸（FA）含量并進行方法學驗證，夫地西酸在0．25～2．25 μg/mL 線性范圍內(nèi)，吸光度和濃度呈良好的線性關系，R為0．999 7。在重復性試驗中，25、0．75 和2．25 μg/mL 濃度下的FA 的RSD 值分別為2．46%、1．03%和2．40%。在中間精密中RSD 值為1．52%。該方法具有良好的精密度，平均回收率為101．95%，準確度良好，佐劑對FA 的定量無影響，適用于乳劑中夫地西酸的含量測定；班附國等[21]建立了比濁法對泰樂菌素及其制劑的含量檢測；李樹剛等[22]建立比濁法對酒石酸泰萬菌素可溶性粉的含量；郝秋紅[23]建立濁度法測定制霉素片中制霉素的含量，在4．0～12．0 IU/mL 范圍內(nèi)線性良好，精密度良好。

試驗菌的穩(wěn)定性是影響比濁法的重要因素，所以在試驗過程中要嚴格控制。

比濁法用于抗生素含量檢測，與抗生素微生物檢定法相比耗時短，影響因素少，可以替代擴散法。且該方法是一種不使用有機溶劑的技術，不會產(chǎn)生化學廢物，綠色環(huán)保。

比濁法往往因供試品中含有雜質(zhì)，影響細菌生長，并不適用于有色或混濁的供試品，且對比濁管的透明度和培養(yǎng)基的澄清度要求較高。此外，比濁法所需儀器昂貴，雖然在獸藥典收錄，但在實際應用中較少。

2 紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法（UV）是在190～800 nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于物質(zhì)鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質(zhì)溶液時，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。紫外-可見分光光度法用于定量時，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數(shù)法計算出樣品溶液的濃度。

《中華人民共和國藥典》（2020 版）有8 種抗生素采用紫外-可見分光光度法測定含量。包括放線菌素D 和注射用放線菌素D，酰胺醇類抗生素的琥珀氯霉素、棕櫚氯霉素以及它們的制劑?！东F藥質(zhì)量標準》（2017 版）[11]規(guī)定紫外-可見分光光度法為恩諾沙星可溶性粉的檢測方法。紫外-可見分光光度法廣泛用于各種藥物檢測，該方法操作簡便，儀器較高效液相色譜儀器便宜，在高校和醫(yī)院應用較為廣泛，可進行常規(guī)的藥物分析。徐長舉等[24]報道了恩諾沙星含量測定的紫外-可見分光光度法，在200～350 nm 波長范圍，其最大吸收波長為270 nm，線性范圍為0．01～0．08 μg/mL，相關系數(shù)為0．999 6，回收率為100．47%，RSD 為1．09%；張慧輝[25]建立紫外法測恩諾沙星納米乳，線性范圍為2．5～7．0 μg/mL，平均回收率為99．67%；李振[26]采用紫外法測定吉他霉素預混劑的含量，在231 nm 處有最大吸收波長，線性范圍為5．0～25．0 μg/mL，R為0．999 8，該方法與抗生素微生物檢定法相比，簡單快速，對環(huán)境要求低；Naveed S[26]建立了UV 法測定克拉霉素；張偉[28]建立紫外-可見分光光度法測大觀霉素的含量，線性范圍280～519 μg/mL，R為0．999 0，RSD 為0．7%。紫外法操作簡單，快速，因此在實際應用中較廣泛。

由于紫外區(qū)常會因為吸光度的波動而發(fā)生被測樣品不平行現(xiàn)象，不能區(qū)分相近波長，且其準確度、穩(wěn)定性與重復性不好，所以此法已逐漸被HPLC 法取代。

紫外-可見分光光度法不能區(qū)分相近波長的物質(zhì)，但是在《中華人民共和國藥典》（2020 版）中還應用于一些其他藥物含量的檢測。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜（HPLC）是柱色譜的一種形式，可將高壓下的樣品混合物或分析物（流動相）泵入帶有色譜填充材料的色譜柱（固定相）中，利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異而達到分離的目的，利用兩相的相對移動，將被測物質(zhì)在兩相之間進行反復多次的質(zhì)量交換，從而達到分離的目的。由于HPLC 具有分離和鑒定存在于任何樣品中的化合物的能力且這些化合物含量可以很低，因此HPLC 可用于各種工業(yè)和科學應用，例如制藥，環(huán)境，法醫(yī)和化學藥品等。

《中華人民共和國藥典》（2020 版）收錄的抗生素有203 種采用HPLC 法測定其含量，約占72．5%。如氨基糖苷類抗生素阿米卡星、鹽酸大觀霉素、硫酸依替米星及其制劑等；酰胺醇類抗生素甲砜霉素、琥珀氯霉素、鹽酸林可霉素等；β 內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西、美羅培南及頭孢類抗生素等；四環(huán)素類抗生素鹽酸土霉素、鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素等；肽類抗生素鹽酸萬古霉素及其制劑。《獸藥質(zhì)量標準》（2017版）收錄的抗生素有21 種采用HPLC 法測定其含量，約占36%。如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素硫氰酸紅霉素膠囊、黃霉素預混和酒石酸泰萬菌素及其制劑；四環(huán)素類抗生素鹽酸多西環(huán)素的制劑；氨基糖苷類單硫酸卡那霉素及其制劑。《中國獸藥典》（2015 版）收錄的抗生素有44 種采用HPLC 法測定其含量，約占59%，其中HPLC 法檢測大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和β 內(nèi)酰胺類抗生素。大環(huán)內(nèi)酯類如硫酸卡那霉素、泰樂菌素及其制劑等；β 內(nèi)酰胺類抗生素如普魯卡因青霉素、阿莫西林、青霉素鈉、苯唑西林、氨芐西林等；四環(huán)素類如鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸金霉素、替米考星還有林可胺類抗生素如鹽酸林可霉素等均用HPLC 法測定藥品含量。

高效液相色譜法測定藥物含量快速、操作簡單、誤差小，對環(huán)境要求較小，因此被廣泛使用。Suneetha[29]建立了RP-HPLC 法檢測頭孢洛林，頭孢洛林濃度在40～120 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)為0．999 9。經(jīng)過驗證該方法適用于原料藥及其制劑中頭孢洛林酯含量的測定；Maria[30]建立了HPLC 法測定萬古霉素，并成功應用于定量人工灌注液和肺組織樣品中的萬古霉素；Agnieszka[31]建立了RP-HPLC法定量測定硫酸頭孢喹酮，色譜柱為LiChroCART RP-18 色譜柱，流動相為乙腈：0．02 mol 磷酸鹽緩沖液（1∶9），線性范圍為0．034～0．1 mg/mL，該高效液相色譜法可快速測定頭孢喹諾酯的含量，且重復性良好；Ali[32]建立了HPLC 法檢測頭孢洛林酯，并對頭孢洛林的HPLC 分析方法進行建立和驗證；Izabela Karpiuk[33]建立了HPLC 法檢測頭孢類抗生素，方法重復性好，靈敏度高；Decheng[34]建立了HPLC 法檢測萬古霉素和多粘菌素B 等抗生素，快速，靈敏；王旗[35]建立HPLC 法測恩諾沙星，色譜條件為Agilent Eclipse Plus C18，流動相為0．025 mol/L 磷酸溶液：乙腈（83∶17），pH 值為3．0±0．5，流速為1．0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為278 nm，線性范圍為0．01～0．1 mg/mL，平均回收率為99．78%，最低檢測限為0．06%。該方法快速靈敏，實際應用更簡便；Mohammed[36]建立了使用折光檢測器的新型環(huán)保HPLC 方法分析藥物中的硫酸安普霉素和克拉霉素。新開發(fā)的技術比以前的HPLC 方法簡便，準確且節(jié)省時間，而它們無需任何其他步驟即可執(zhí)行衍生化和提取程序。

該方法缺點是不能檢測抗生素的生物活性，且色譜柱使用壽命短，成本較高資金消耗較大。

雖然HPLC 法存在一定缺點，但是它的操作簡單，快速，使得其在抗生素含量檢測方面被廣泛應用。

4 其他方法

除了管碟法、紫外-可見分光光度法和高效液相色普法外，常用的藥物含量檢測方法還有毛細管電泳法。

毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，根據(jù)供試品中各組分流淌和分配行為的差異而實現(xiàn)的一種分離方法。侯卓[37]建立了10 種頭孢菌素抗生素的檢測方法，并且可以同時進行10 種抗生素的分析。毛細管電泳方法與HPLC 法都高效快速，但是毛細管電泳法較HPLC 法消耗試劑少，分離能力強，但是該方法靈敏度較低，所以推廣還需要技術的提高。隨著科學技術的發(fā)展，一些新的方法也被應用于抗生素的檢測。許銘玉等[38]用干燥濾紙片法代替管碟法檢測恩拉菌素預混劑中恩拉菌素的含量，該方法操作簡單，重復性好，可以避免管碟法一些試驗干擾因素，亦可對大量樣品同時檢測，方便快捷；Chengke[39]建立基于金納米顆粒（AuNPs）催化能力增強，以AuNPs 為催化劑的卡那霉素的高靈敏度檢測。據(jù)報道，TMB 可以被H2O2氧化，并在650 nm 處產(chǎn)生具有顯著最大吸光度的藍色產(chǎn)物[40]，在TMB-H2O2溶液中加入AuNPs后，檸檬酸AuNPs 可以催化TMB 和H2O2的反應，繼續(xù)加入卡那霉素，進一步提高了AuNPs 的催化活性，并將混合物的顏色改為深藍，用比色法測定溶液中卡那霉素的濃度，方法簡單，具有合理的選擇性和增強的靈敏度；Webb[41]建立了實時熒光定量PCR 檢測方法，快速檢測抗生素，為臨床醫(yī)生提供了一種工具，可以近乎實時地識別潛在的治療失敗，從而在感染期間進行知情的治療變更并改善患者的預后；Samiha 等[40]利用在堿性到中性介質(zhì)中，大觀霉素可以進行衍生化反應，可以進行光譜測定從而建立了熒光法檢測大觀霉素，該方法簡單、靈敏度高，在治療藥物監(jiān)測系統(tǒng)和質(zhì)量控制分析中得到廣泛應用。

5 展望

抗生素的檢測方法多種多樣，目前常用的檢測方法主要是管碟法和HPLC 法，管碟法雖然操作復雜，易受環(huán)境影響，耗時長，但是可以用來分析多種組分組成的抗生素，可以直接測定抗生素的生物活性，該特點是其他快速便捷的含量檢測方法所不能達到的。HPLC 法快速靈敏，操作簡單，對環(huán)境要求較小，因此被廣泛應用。中國藥典中許多用管碟法測生物活性的抗生素類藥物都已修訂為HPLC 法，隨著藥物生產(chǎn)工藝水平的提高，抗生素微生物法在未來可能會逐漸被HPLC 法取代。