王 瓊 劉運廣 董凱華 顏嘉葳

(1 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西百色市 533000,電子郵箱：1834252464@qq.com；2 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，廣西百色市 533000；3 首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院兒科,北京市 100015)

【提要】 足細胞足突融合消失和蛋白尿是腎小球疾病的共同特征，了解足細胞的生物學特性，對研究足細胞損傷機制、靶向治療具有重要意義。裂孔隔膜作為足細胞重要組成部分之一，對維持腎小球濾過屏障結構及功能、限制蛋白濾過起關鍵作用。CD2相關蛋白(CD2AP)作為裂孔隔膜的代表性蛋白之一，與細胞骨架相關蛋白、其他裂孔隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、頂膜區(qū)蛋白和離子通道蛋白存在相互作用，共同影響足細胞形態(tài)學和動力學。本文圍繞CD2AP與足細胞相關蛋白的相互作用進行綜述，為探討蛋白尿的發(fā)生機制提供參考。

蛋白尿是腎臟疾病的主要標志，同時也是導致腎功能惡化進展的獨立因素，其嚴重程度可反映腎臟病變的嚴重程度[1]。蛋白尿的發(fā)生與腎臟的濾過屏障結構完整性破壞密切相關。有學者借助分子生物學研究手段，發(fā)現(xiàn)足細胞相關蛋白在維持腎臟濾過功能上發(fā)揮重要作用，并且不同蛋白之間關系密切[2-3]。CD2相關蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)作為重要足細胞分子之一，在維持腎臟濾過屏障的結構及功能完整性上起著重要作用。本文主要就CD2AP與其他足細胞相關蛋白之間相互關系做一綜述。

1 足細胞的結構與功能

腎小球濾過屏障可阻止包括白蛋白在內的血漿大分子進入尿液，該結構由電荷屏障和機械屏障構成，其中機械屏障由有孔的內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成。足細胞是一種終末分化細胞，其作為構成腎小球濾過屏障的最后一道屏障，附著于腎小球毛細血管襻的外側。足細胞可分為結構和功能不同的3個部分：細胞體、初級突起(亦稱主突)、足突。相鄰足細胞的足突呈相互交叉嵌合，并形成寬約40 nm的濾過裂孔，裂孔由極薄的裂孔隔膜相連，成為阻止蛋白質等大分子濾過的最后屏障。足細胞正常功能的發(fā)揮及其在腎小球基底膜上的穩(wěn)定附著，均依賴于足細胞相關蛋白的維持。而根據(jù)足細胞的分布情況和功能，足細胞相關蛋白可分為細胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、頂膜區(qū)蛋白、離子通道蛋白，這些蛋白共同構成腎小球濾過屏障，能夠有效選擇血漿中的濾過成分，從而維持內環(huán)境的穩(wěn)定。

2 CD2AP

CD2AP是人足細胞裂孔隔膜特異性表達的蛋白。在空間結構上，CD2AP由中央的卷曲線圈域和外周的4個對稱基序構成，而外周的每個基序中均含有3個SH3球狀結構域；從氨基酸序列上看，CD2AP的NH2末端包含3個SH3結構域，中間區(qū)域為富含脯氨酸區(qū)域，COOH末端包含一個卷曲螺旋結構域和肌動蛋白結合位點[4]。其中，CD2AP的SH3結構域與脯氨酸線性識別序列結合。Rouka等[5]研究了每個SH3結構域與已知交互因子Casitas B譜系淋巴瘤蛋白(Casitas B-lineage lymphoma，CBL)的結合特性，并進行了基于識別PxPxPR基序的肽微陣列篩選，發(fā)現(xiàn)多種可結合蛋白，如CBL、凋亡相關基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene 2-interacting protein X，ALIX)、Ras和Rab結合因子3分子等；3個SH3結構域對這些結合蛋白的識別和結合存在顯著差異：CD2AP的SH3-1和SH3-2結構域通常與具有相似特征的肽配體結合，而SH3-3結構域與大多數(shù)的肽配體結合較弱，但可識別ALIX中異常延伸的序列。有研究表明SH3-3的一個突變(p.K301M)可能在遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化中起作用[6]。有學者進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD2AP的SH3-1結構域Y10位的酪氨酸對于維持其自身功能不可或缺[7]。

3 CD2AP與其他足細胞相關蛋白之間的相互作用

3.1 CD2AP與細胞骨架蛋白之間的相互作用 足細胞胞體和主突的細胞骨架是由微管和富含桿狀蛋白的中間絲構成。足突的細胞骨架由富含F(xiàn)-肌動蛋白的微絲構成，微絲形成環(huán)狀束呈縱向排列；環(huán)狀束之間由密集的輔肌動蛋白連接，在足突與主突的移行處，環(huán)狀束彎曲與主突的微絲及微管相連，這樣的結構特性使足細胞具有對抗腎小囊內張力的能力[8]。

3.1.1 CD2AP與肌動蛋白：足細胞的分化伴隨著細胞骨架的重排和細胞形態(tài)的變化。而CD2AP在足細胞分化中起重要作用[9]。Lehtonen等[10]發(fā)現(xiàn)，CD2AP和F-肌動蛋白在體外培養(yǎng)小鼠腎皮質集合管細胞中存在部分共定位現(xiàn)象，肌動蛋白細胞骨架的破壞可導致內源性CD2AP解體，考慮這種相互作用是通過CD2AP的COOH末端介導的。He等[11]發(fā)現(xiàn)，白蛋白過載可引起永生化小鼠足細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的p17亞基表達上調、F-肌動蛋白細胞骨架破壞及CD2AP表達降低，從而引起足細胞啟動凋亡程序；而用CD2AP真核表達載體轉染這些細胞后可逆轉上述改變，考慮CD2AP可能參與抑制促凋亡的轉化生長因子β信號傳導以維持足細胞穩(wěn)態(tài)。Zhao等[12]也發(fā)現(xiàn)，在增強肌動蛋白加帽蛋白和肌動蛋白結合蛋白促進Arp2/3復合物介導的肌動蛋白組裝的能力方面，CD2AP起著關鍵的支架作用。由此可見，CD2AP可從多個方面影響肌動蛋白細胞骨架，CD2AP異常表達及分布均導致其穩(wěn)定性的破壞，而這可引起蛋白尿的發(fā)生。

3.1.2 CD2AP與F-肌動蛋白結合蛋白：目前已發(fā)現(xiàn)F-肌動蛋白結合蛋白有α-輔肌動蛋白-4、突觸足蛋白、結蛋白、波形蛋白和巢蛋白等。(1)α-輔肌動蛋白-4連接F-肌動蛋白，具有調節(jié)足細胞機械動力的作用[13]。在α-輔肌動蛋白-4缺陷小鼠中可觀察到其足細胞與裂孔隔膜結合差，易引起足細胞之間分離，從而導致足細胞損傷[14]。由此可見，作為裂孔隔膜特異性表達的蛋白，CD2AP與α-輔肌動蛋白-4有著密切的空間關聯(lián)。(2)突觸足蛋白可介導包含α-輔肌動蛋白-4和β-連環(huán)蛋白的復合物的形成，并與肌球蛋白Ⅱ相互作用，從而參與調節(jié)足細胞的運動功能[15]。Huber等[16]發(fā)現(xiàn)CD2AP和突觸足蛋白可以直接相互作用，推斷這種相互作用是由CD2AP的SH3結構域與富含脯氨酸的突觸足蛋白片段結合而實現(xiàn)的，其中至少有2種不同的富含脯氨酸的片段可以與CD2AP結合。突觸足蛋白是α-輔肌動蛋白-4的張力敏感調節(jié)劑，而敲除犬腎細胞MDCK細胞中的突觸足蛋白可導致α-輔肌動蛋白-4和F-肌動蛋白在細胞連接處的積聚急劇減少，引起Venus-α-輔肌動蛋白在成熟單層濾過屏障中從細胞連接處重新定位到細胞質中[15]。由此推測CD2AP和突觸足蛋白同時也存在間接作用。(3)結蛋白是一種細胞骨架中間絲蛋白，與其他蛋白共同構建細胞骨架結構。正常情況下，結蛋白在足細胞中不表達，當足細胞受到損傷時，結蛋白表達升高以應對損害。Wang等[17]在表現(xiàn)為大量蛋白尿的阿霉素腎病大鼠中發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞裂隙膜蛋白(podocin)、腎病蛋白(nephrin)等裂隙隔膜蛋白的表達下調，而CD2AP和中間絲蛋白-結蛋白的表達上調。但目前CD2AP與結蛋白之間的具體作用尚未確定。(4)目前尚未有研究證實波形蛋白、巢蛋白與CD2AP有直接作用關系。綜上，CD2AP可通過調節(jié)相關F-肌動蛋白結合蛋白來影響細胞骨架，從而對維持細胞骨架結構、保證正常濾過功能具有重要作用。

3.2 CD2AP與裂孔隔膜蛋白之間的相互作用 腎小球裂孔隔膜作為選擇性屏障，可防止大分子過濾到超濾液中，并受到來自腎小球濾液流動所引起的剪切應力的影響。裂孔隔膜蛋白包含了在黏附和緊密連接處表達的蛋白，如P-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、閉塞小帶-1、軸突蛋白、受體酪氨酸激酶亞家族Eph的配體B1、緊密連接蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白、γ-連環(huán)蛋白、閉合蛋白、鈣/鈣調素依賴性絲氨酸蛋白激酶、連接黏附分子、膜相關鳥苷酸激酶轉化蛋白2和鈣黏蛋白等，以及足細胞特有的蛋白，如受體酪氨酸激酶亞家族Eph的配體(nephrin)、podocin、NEPH和CD2AP等[18-19]。

podocin可將nephrin和CD2AP募集到裂孔隔膜上，然后通過其COOH末端與CD2AP和nephrin結合，從而形成nephrin-podocin-CD2AP復合物，嵌入脂筏中[20-21]。podocin、nephrin、CD2AP之間存在相互作用：nephrin也是一種信號分子，而podocin可顯著增強nephrin誘導的信號傳導，從而激活絲裂原活化蛋白激酶[22]；nephrin和CD2AP在體內與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)的p85調節(jié)亞基相互作用，將PI3K募集到質膜，并與podocin一起刺激足細胞中依賴PI3K的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號傳導，而PI3K/Akt信號的激活是維持足細胞功能完整性的重要組成部分[23]。有研究表明，Akt活性較低的大鼠腎小球上皮細胞合成的應力纖維較多，上調Akt活性后，這些細胞的應力纖維合成減少，而應力纖維影響著肌動蛋白骨架的分布[24]。由此推測，nephrin-CD2AP-PI3K/Akt復合物參與調節(jié)足細胞的肌動蛋白細胞骨架。

鈣黏蛋白是一組鈣依賴性黏附分子，參與著細胞與細胞之間的黏附。足細胞的裂隙隔膜是一種特殊的黏附結構，含有幾種支架蛋白，包括P-鈣黏蛋白、CD2AP和FAT蛋白[25]。 Tang等[26]通過蛋白質印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在敲除CD2AP基因的MDCK細胞系中，E-鈣黏蛋白水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化；但用單個解卷積光學圖像比較E-鈣黏蛋白、CD2AP和F-肌動蛋白的連接強度，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白與CD2AP水平存在中等相關性，E-鈣黏蛋白在敲除CD2AP基因的MDCK細胞上分布減少。但目前尚未明確CD2AP與P-鈣黏蛋白、FAT鈣黏蛋白相互作用。

ephrin-B1在裂隙隔膜處表達，參與維持裂隙隔膜分子的正確排列和裂隙隔膜的屏障功能[27]。Hashimoto等[28]發(fā)現(xiàn)ephrin-B1、nephrin和CD2AP在大鼠足細胞上存在共定位現(xiàn)象；用小干擾RNA靶向抑制這些細胞中的ephrin-B1表達，發(fā)現(xiàn)CD2AP僅在細胞核周圍表達。該結果表明ephrin-B1有助于 CD2AP 在足細胞中的正確定位。但目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)ephrin-B1與CD2AP存在直接的相互作用。

NEPH1、閉塞小帶-1等蛋白協(xié)助維持著裂孔隔膜的屏障功能，目前尚無研究發(fā)現(xiàn)CD2AP與這些分子的直接作用。

3.3 CD2AP與基底膜區(qū)蛋白之間的相互作用 基底膜區(qū)蛋白在維持細胞正常形態(tài)、足突與基膜的相互作用以及足突的正常定位具有重要作用。整合蛋白α3β1是主要的足細胞基底膜區(qū)蛋白，其在足細胞中高度表達。整合蛋白α3β1等黏附復合物與基底膜上的層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等蛋白相互連接，進而將基底膜與足細胞的肌動蛋白細胞骨架相聯(lián)系，從而使足細胞牢固地錨定在基底膜上[29-30]。Karabulut等[2]對發(fā)生腎結石病變大鼠的足細胞進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)這些細胞的CD2AP表達上調，而整合蛋白α3β1 表達下調。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)CD2AP與足細胞高度表達的整合蛋白α3β1之間存在直接相互作用，但這些基底區(qū)蛋白通過間接相互作用來影響著CD2AP的表達與分布。

3.4 CD2AP與頂膜區(qū)蛋白 由于足細胞標記蛋白(podocalyxin)、平足蛋白(podoplanin)、podoendin和腎小球上皮蛋白等頂膜區(qū)蛋白的存在，頂膜結構域帶負電荷，可有效阻止白蛋白通過[18-19]。這些蛋白對于足細胞的功能具有重要意義。Refaeli等[31]通過敲除處于毛細血管袢末期小鼠足細胞的podocalyxin基因，并對這些細胞進行podocalyxin和podocin免疫熒光共染色，發(fā)現(xiàn)podocalyxin和podocin表達均減少，并且podocin已錯誤定位到足細胞細胞體的頂膜區(qū)，推測podocalyxin有助于裂隙隔膜相關蛋白podocin在細胞上正確定位。而由上文可知podocin通過其COOH末端與CD2AP與nephrin結合，因此推測podocalyxin可間接影響CD2AP。但目前暫無研究表明CD2AP與podocalyxin、podoplanin、podoendin和腎小球上皮蛋白這些分子之間存在直接相互作用。

3.5 CD2AP與離子通道相關蛋白 離子通道對維持正常足細胞功能至關重要，該通道的失調可能導致足細胞內外離子失衡，進而造成足細胞損傷。腎小球足細胞表達 瞬時受體電位陽離子通道亞家族C(transient receptor potential cation channel subfamily C,TRPC)1、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC6蛋白；使用電生理學和藥理學方法進行分析發(fā)現(xiàn)，目前只有TRPC3、TRPC5和TRPC6被證明有助于鈣進入足細胞[32]。Reiser等[33]通過共定位研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6與裂隙隔膜蛋白nephrin、podocin和CD2AP 相關；免疫印跡檢測結果顯示TRPC6僅與nephrin和podocin有直接相互作用，而不是 CD2AP。另外，目前也尚未發(fā)現(xiàn)TRPC3、TRPC5與CD2AP有存在著直接或間接相互作用。

4 小 結

足細胞結構的完整性是維持腎小球正常濾過功能的基礎。這些結構的異常均會導致足細胞的結構異常，最終引起蛋白尿的產(chǎn)生。CD2AP與細胞骨架蛋白、裂隙隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、離子通道蛋白存在相互作用，這種相互作用是足細胞維持結構與功能完整性的基礎；而在病理條件下，CD2AP的表達和分布異常可以影響著細胞骨架、肌動蛋白結構的完整性，同時改變了裂隙隔膜的分子組成，間接影響著頂端膜的完整性。因此，從CD2AP角度進一步探討足細胞分子間相互作用機制，為足細胞損傷的靶點治療提供了全新的思路，將產(chǎn)生革命性變革，具有重大意義。