張子龍，趙 雯，黃小玉，徐海芳，師曉敏，劉 晨，張冰玉，楊家樂，呂玉紅, ，岳昌武,

（1.延安大學醫(yī)學院，延安市微生物藥物創(chuàng)新與轉化重點實驗室，陜西延安 716000；2.河南省駐馬店市農科院，河南駐馬店 463001）

稀有糖是被定義為“自然界中數(shù)量有限的單糖及其衍生物”的一類單糖或糖醇，稀有糖主要存在于天然植物中，與自然界中大量存在的葡萄糖和果糖相比存量非常稀少[1]。目前已報道發(fā)現(xiàn)約50種，已被廣泛應用于保健食品、嬰幼兒配方食品、乳制品、飲料等食品生產和醫(yī)療臨床產品生產[2]。稀有糖類作為益生元的重要來源，一般不能為動物直接消化吸收利用，但可被腸道內雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌分解吸收，促進有益細菌生長繁殖，對維持腸道菌群平衡具有重要意義[3]。目前，常見的有開發(fā)價值的活性稀有糖類主要有塔格糖、阿洛酮糖、異麥芽酮糖（帕拉金糖）、L-阿拉伯糖和海藻糖等，也因其具有降血糖、降血脂、提高免疫力等重要的生物活性[4]而備受食品、化工和醫(yī)藥等領域關注。隨著人們對稀有糖產品功能認可度不斷提高，中國食糖結構的日益優(yōu)化，國內稀有糖的需求日益增長，將為功能性稀有糖的開發(fā)、生成及推廣帶來良好的機遇[5]。然而，由于稀有糖研發(fā)基礎薄弱、生產工藝落后、自主知識產權欠缺等因素，國內稀有糖生產還有較大提升空間。本文將從稀有糖的結構、生物活性及生物轉化合成等方面，對近年來稀有活性糖的研究進展進行回顧，并對其應用和工業(yè)化發(fā)展趨勢進行展望，為國內活性稀有糖的研究開發(fā)以及產業(yè)化利用提供理論依據(jù)。

1 主要活性稀有糖類的結構

從化學結構上可以將稀有糖類分為稀有糖和稀有糖醇兩種主要結構類型，二者化學結構的差別導致了其生物活性有較大差異。大量的研究表明，活性稀有糖類的基本構成單糖單元組成、特殊基團及構象等結構的差異決定了其生物活性的多樣性[6]。無論是稀有糖或是稀有糖醇，往往都有D-型構象也有L-型構象，而食品工業(yè)中利用價值較高的稀有糖往往是D-糖或D-糖醇，提示人們在食品加工添加稀有糖時需要關注稀有糖的構象差異，才能確保產品的生物功能。

1.1 主要活性稀有糖及其結構

稀有糖具有糖類共有的多羥基醛類或者酮類化學結構特征（圖1），目前研究較多的稀有糖有塔格糖（Tagatose）、D-阿洛酮糖（D-Psicose）和D-甘露糖（DMannose）、D-核酮糖（D-Ribulose）、D-鼠李糖（DRhamnose）、D-山梨糖（D-Sorbose）和D-木酮糖（DXylulose）。稀有二糖主要異麥芽酮糖/帕拉金糖（Isomaltulose/Palatinose）、L-阿拉伯糖（L-Arabinose）、乳果糖（Lactulose）和海藻糖（Trehalose）等為主，這些活性糖大多是由乳糖、果糖、蔗糖和海藻多糖等生物質經生物轉化或化學轉化而來，因而具有不同于常見天然單糖的化學結構[7]。其中塔格糖為果糖的 “差向異構體”，是以乳糖為原料，經水解獲得半乳糖后經異構化酶處理轉化生成的含酮基的六碳己酮糖[7]。阿洛酮糖則是由D-果糖經D-阿洛酮糖3-差向異構酶經生物轉化而得到的D-果糖C3所對應的差向異構體[8]。異麥芽酮糖又叫帕拉金糖，是由葡萄糖和果糖以α-1,6糖苷鍵連接形成的還原性二糖，為蔗糖的1種異構體[9]。L-阿拉伯糖是一種戊醛糖，又稱樹膠醛糖、果膠糖，常與其他單糖結合，以雜多糖的形式存在于膠質、半纖維素、果膠酸、細菌多糖及某些糖苷中，可經酸、堿水解或生物酶解而獲得[10]。乳果糖（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖），是由果糖和半乳糖組成的乳糖的同分異構體，該糖在自然界中并不存在[11]。作為自然界中最穩(wěn)定的一類天然雙糖，海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖，按照海藻糖的構象又可以將其分為α,β-海藻糖（Neotrehalose，新海藻糖）、α,α-海藻糖（Mushroom sugar，蘑菇糖）、和β,β-海藻糖（Isotrehalose，異海藻糖）。其中只有α,α-海藻糖在自然界中以游離狀態(tài)存在，即為通常所說的海藻糖，而α,β-型海藻糖和β,β-型海藻糖在自然界中很少見，可由化學合成途徑獲得[12]。

圖 1 幾種重要生物活性稀有糖的結構Fig.1 Structure of important bioactive rare sugars

1.2 主要活性稀有糖醇及其結構

稀有糖醇是相應稀有糖的酮基經催化氫化還原而被相應的羥基等取代生成的多元醇（圖2），因其多由相應的稀有糖類衍生而來，因此還具有某些糖的化學和生物屬性。在食品工業(yè)有較大利用價值的稀有糖醇主要包括：麥芽糖醇（Maltitol）及其同分異構體異麥芽糖醇（Isomaltitol）、山梨醇（Sorbitol）及其同分異構體異山梨糖醇（Isosorbide）、巖藻糖醇（Fucitol）、蘇糖醇（Threitol）、艾杜糖醇（Iditol）、甘露醇（Mannitol）、塔羅糖醇（Talitol）以及阿拉伯糖醇（Arabinitol）等，這些活性糖醇大多數(shù)既有D-糖醇構象也有L-糖醇構象，且兩種構象的生物活性差別較大。

圖 2 幾種重要生物活性稀有糖醇的結構Fig.2 Structure of important bioactive rare sugar alcohols

2 稀有糖的生物活性

圖3總結了稀有糖類主要影響腸道菌群-腸腦軸而發(fā)揮生物活性的機制[13]，食物中稀有糖類往往不能被胃和小腸直接消化吸收，進入大腸后可被腸道菌利用轉化成短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFA）或維生素等代謝產物，激活機體免疫系統(tǒng)或是刺激機體白介素等合成，增加機體免疫力等多種途徑發(fā)揮益生作用；或是抑制腸道有害菌異常發(fā)酵，減少了腸道內各種毒素產生；或是通過影響人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）等的合成與分泌，發(fā)揮降血糖、血脂的作用。

圖 3 稀有糖主要生物活性機制Fig.3 Main bioactivites mechanism of rare sugars

2.1 經腸道菌轉化成可被機體吸收的SCFA或維生素

稀有糖類不能被人體直接吸收利用，當它們進入腸道后可作為養(yǎng)分直接為雙歧桿菌、乳酸菌或枯草芽孢桿菌等益生菌所利用提供能量或合成菌體成分，促進益生菌增殖同時被益生菌轉化而產生多種乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等多種SCFA[14]。稀有糖轉化的有機酸一方面可降低腸道pH值促使腸道益生菌的大量增殖進而競爭性抑制有害菌的生長及其有害產物的產生，一方面還可以刺激腸道蠕動、潤濕糞便從而有效預防便秘[15]。此外，SCFA被腸道上皮細胞吸收入血，進而通過腸腦軸調節(jié)機體的免疫力等增強機體機能。稀有糖類也是維生素合成的重要前體物質，可以在體外由特定酶催化合成維生素，為實現(xiàn)維生素工業(yè)化量產提供物質基礎。

2.2 病原微生物的抑制作用

稀有糖類除了通過對益生菌的益生作用抑制有害菌異常發(fā)酵，直接減少了腸道內各種毒素產生外，其刺激增殖的雙歧桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等菌體的細胞壁成分和胞外分泌物，可刺激機體免疫系統(tǒng)抑制病原微生物活性[16]。稀有糖不被口腔微生物利用，可抑制口腔病原菌的生長，進而抑制牙齒齲變，有報道稱D-塔格糖可通過抑制變形鏈球菌在牙齒形成生物膜而發(fā)揮抗齲齒作用[17]。

2.3 其他作用

稀有糖具有對細胞活性酸素的抑制作用，抑制收縮期、擴張期血壓的上升，對臟器貧血障礙的保護作用，抑制破骨細胞的分化，抑制癌細胞的增殖等作用[18]。稀有糖也可通過影響人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）等的合成與分泌，通過影響體內相關信號途徑進而發(fā)揮降血糖、血脂的作用[4,19]。同時，有大量研究表明稀有糖對神經性病變、腦梗塞、心肌梗塞、高血壓等疾病的具有抑制效果[20]。最新研究表明，稀有糖對肝臟細胞能量產生、肝脂肪積累和基因表達具有結構特異性影響，具有保肝藥物應用潛力[21]。

總之，稀有糖表現(xiàn)出抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗氧化、降血糖、降血脂、防腹瀉、抗炎癥以及抗衰老等多種生物活性，可適合于腸胃功能失調、糖尿病、高血壓、肥胖癥、動脈硬化、齲齒患者以及免疫力低下的慢性病和老年病患者，更可作為日常飲食中添加成分用于人體營養(yǎng)與保健[22-24]。此外，稀有糖和合成化學藥品相比，無不良反應，因而必將在制造康養(yǎng)食品和醫(yī)藥品以及醫(yī)療制品方面具有非常大的應用前景。

3 稀有糖的制備方法

稀有糖作為極具市場開發(fā)潛力和大量使用的益生元，傳統(tǒng)的生產工藝已不能滿足市場和環(huán)境保護的需要，研究開發(fā)其高效、低耗、綠色的生產工藝尤為重要，目前稀有糖的主要制造方法大致可分為天然原料酸/堿水解及提取、化學合成、天然多糖生物轉化、糖基生物質轉化、單糖酶學轉化等（圖4）[25-26]，由于近年來從天然原料中提取稀有糖以及天然多糖的酸/堿水解以及化學合成的相關研究進展不大，本文主要就后3種方法展開介紹，包括基于糖基生物質的轉化生產稀有糖；以單糖、寡糖為原料的稀有糖生物合成；己糖Izumoring策略的稀有糖生物合成。

圖 4 稀有糖的主要生物制備途徑Fig.4 Biological production methods of rare sugars

3.1 基于糖基生物質的轉化生產稀有糖

得益于現(xiàn)代微生物組學、酶工程和基因工程技術的巨大進步，使得在工廠里以糖基生物質為原料通過生物合成方法生產稀有糖成為了可能[27-30]。糖基生物質水解法作為比較傳統(tǒng)生產方法，生產工藝較為成熟、近年來鮮有重大突破[31]。例如乳果糖是由半乳糖與果糖組成的二糖，在自然界中并不存在，可通過化學法或生物酶法生產?；瘜W法主要有堿單一催化法、鋁酸鈉催化法和酸堿協(xié)同催化法，后者是目前工業(yè)上的主要生產乳果糖的方法[32]。L-阿拉伯糖廣泛存在于水果、粗糧皮殼中，早期主要是通過堿水解、酸中和獲得阿拉伯聚糖，也可通過化學合成法，利用鼠李糖等為原料，在過氧化氫和乙酸催化下制備L-阿拉伯糖，現(xiàn)已開發(fā)出生物轉化法生產L-阿拉伯糖[33]。塔格糖（Tagatose）是以乳糖為原料，經水解獲得半乳糖，然后在堿性條件下，以堿金屬或堿土金屬鹽為催化劑，催化D-半乳糖與金屬氫氧化物發(fā)生異構化反應，生成金屬氫氧化物+D-塔格糖復合物沉淀，然后酸中和分離沉淀而得[34]。盡管化學家通過兩種不同催化劑介導的受氫和供氫的連續(xù)步驟、通過位點選擇性差向異構化反應直接以D-葡萄糖為原料經一系列催化合成中間體，最終成功制備出D-阿洛糖，實現(xiàn)了稀有糖化學合成的重大突破[35]，是迄今為止產率和選擇性最好的方法，為合成高價值的稀有糖提供了一條簡潔且廣泛的方法，但由于其復雜的化學工藝、轉化成本高昂，目前尚不能應用于實際生產。

纖維素、半纖維素為代表的陸生植物糖基生物質以及褐藻多糖、紅藻多糖、綠藻多糖和藍藻多糖等為代表的海藻多糖是地球糖基生物質的主要來源。其中占植物界碳含量的50%以上的纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，是通過生物轉化獲得優(yōu)質稀有糖的重要原料[36]。已有大量的研究通過將分解纖維素、半纖維素產生葡萄糖、纖維二糖、木糖的纖維素酶（Cellulase）、木聚糖酶（Xylanase）和下游能將后二者進行轉化的合成稀有糖的相關酶類通過代謝工程等方法構建全細胞級聯(lián)反應體系或體外轉化體系，成功實現(xiàn)以直接以纖維素、半纖維素為原料的稀有糖的生物轉化[37]。

以淀粉為原料的稀有糖生產技術經過這些年的探索，已經取得了較大進展，可用于稀有糖的低成本綠色生物制造，如游淳課題組基于“熱力學驅動策略”構建了一個以淀粉為原料的體外稀有糖的合成酶生物體系（圖5），通過多種酶的級聯(lián)反應，最終實現(xiàn)了合成多種稀有糖生物合成[38]。甘油是生物體內通過糖異生途徑合成多種糖的重要原料，科學家們已經實現(xiàn)了體內外的甘油為原料的多種稀有酮糖的生物催化合成，李子杰等成功構建了一鍋多酶系統(tǒng)（Onepot multienzyme system）策略（圖6）。該策略以甘油為唯一碳源，將多種來自不同微生物的甘油糖異生和稀有糖合成相關的酶在大腸桿菌基因工程菌體內過表達，最終獲得14.8 g/L的D-山梨糖和D-阿洛酮糖產量，該策略也可用于其他稀有糖高效、低成本的合成，該團隊還利用該策略實現(xiàn)多種稀有糖的體內酶促催化合成[39]。

3.2 以單糖、寡糖為原料的稀有糖生物合成

將葡萄糖、果糖等單糖或寡糖轉化成稀有糖的方法除了已經介紹的化學法外，利用自然界已發(fā)現(xiàn)的具有轉化合成稀有糖酶活性的菌株或酶類的發(fā)現(xiàn)、定向突變和酶工程一直是科學家們研究的熱點?？茖W家通過突變獲得了耐熱型β-半乳糖苷酶，該酶以乳糖和果糖為底物、可高效的將乳糖水解成半乳糖并后者轉移給果糖而合成乳果糖，其轉化效率較傳統(tǒng)補料法提高了10.6倍，極大提高了乳果糖產率和轉化率[40]。目前海藻糖生產主要利用酶轉化法，該法是以麥芽糖為原料，利用麥芽磷酸化酶、海藻糖磷酸酶共同催化麥芽糖或單獨使用海藻糖合成酶將麥芽糖產生海藻糖[41-42]。生產上利用枯草芽孢桿菌、金黃色節(jié)桿菌或酵母菌的培養(yǎng)物酶解阿拉伯聚糖是獲得L-阿拉伯糖重要途徑[43]。塔格糖則是采取化學法和生物法結合的生產方式，先通過水解乳糖獲得半乳糖，再通過脫氫酶催化氧化半乳糖醇得到D-塔格糖，或者通過L-阿拉伯糖異構酶催化D-半乳糖異構化生成D-塔格糖[44-45]。利用微生物來源的酮糖3-差向異構酶催化D-果糖與D-阿洛酮糖轉化，是目前D-阿洛酮糖生產的主要途徑[46]。利用沙雷氏桿菌、大腸桿菌等微生物的α-葡萄糖基轉移酶轉化蔗糖或是利用酶法轉化葡萄糖和果糖是目前生產異麥芽酮糖重要方法[47-49]。

圖7總結了以葡萄糖為原料，通過不同來源的已糖異構酶等生物酶類組合催化，實現(xiàn)多種稀有糖的生物合成技術路線。目前基于基因工程的組合酶催化生物合成已經在 L-己糖、D-塔格糖、D-阿洛糖等多種稀有糖生物合成中取得成功[50-51]。生產中可以此為借鑒，根據(jù)目標產物的生物合成進展，采取固定化菌株或固定化酶的技術，將來自不同微生物的催化稀有糖合成的高活性酶類基因進行克隆并將相應的催化單元按照一定的順序進行模塊化組合，就可完成特定的稀有糖的高效生物轉化[52]。

圖 5 淀粉為原料的體外多種酶組合合成稀有酮糖體系Fig.5 In vitro strategy for the synthesis of rare ketose from starch

3.3 稀有糖合成的己糖Izumoring策略

受益于稀有糖酶工程模塊化技術進步，Ken Izumori提出了一套完整的適用于所有稀有糖的生物制備Izumoring策略，該策略利用基于各種稀有糖化學結構、生物活性和酶促催化的相關性，利用AIase（Aldose isomerase，醛糖異構酶）催化醛糖-酮糖異構化，KEase（Ketose 3-epimerase，酮糖3-差向異構酶）催化酮糖C-3異構化，Arase（Aldose reductase，醛糖還原酶）和PDH（Polyol dehydrogenase，多元醇脫氫酶）分別催化醛糖和酮糖還原為相應的多元醇的四個基本酶促反應實現(xiàn)各種稀有糖的轉化[53]。以己糖Izumoring策略為例（圖8），只經過6步反應，即可將L-葡萄糖依次經L-葡萄糖醇、D-山梨糖、D-塔格糖、D塔洛糖醇/D-阿卓糖醇、D-阿洛酮糖、D-果糖等中間體，最終得到D-葡萄糖[54]。Izumoring策略為工廠化生產稀有糖提供了一條簡便、高效且靈活的生產策略，人們可以將各種來源的AIase、KEase、Arase、和PDH固定化，根據(jù)生產目的進行有機的組合，可以實現(xiàn)從L-葡萄糖等糖基生物質原料到己糖稀有糖目標高效生產。

圖 6 甘油全細胞合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖的策略Fig.6 Strategy for the whole-cell synthesis of D-sorbose and D-allulose from glycerol

圖 7 基于單糖異構化的稀有糖生物轉化策略Fig.7 Strategy for the rare sugars biotransformated by isomerase

圖 8 稀有糖的己糖Izumoring策略Fig.8 Strategy of hexose Izumoring for rare sugars

4 結論與展望

本文對近年來稀有糖類的結構、活性及制備方法等研究進展進行較為系統(tǒng)的回顧，盡管目前稀有糖的工廠化生產還是主要從糖基生物質植物中通過理化工藝提取，但以位點選擇性差向異構化反應為代表的從葡萄糖為原料生產稀有糖的化學法的巨大突破為工廠化大規(guī)?；瘜W合成稀有糖提供了新的技術，今后如能再進一步提高轉化效率、簡化生產工藝，必將成為稀有糖的生產一種重要工藝。綠色生物合成是今后稀有糖生產的發(fā)展方向，今后的生產中可以嘗試基于代謝工程的原理、通過基因編輯技術將不同來源高活性纖維素酶、淀粉酶和下游的己糖激酶、磷酸己糖異構酶、醛縮酶、醛（酮）糖醇氧化酶、己糖異構酶、多元醇脫氫酶等進行有機組合，構建出可以分別以纖維素、淀粉等多糖類糖基生物質為原料的高效稀有糖生產工藝。以葡萄糖等己糖為原料生產稀有糖的Izumoring策略可根據(jù)生產目的進行有機的組合，可以實現(xiàn)從L-葡萄糖等己糖原料到多種己糖稀有糖或糖醇自由切換，極大方便了生產者根據(jù)市場行情隨時調整相應的生產工藝和產品類型，具有很高的生產應用價值。基于甘油等糖異生中間分子的稀有糖生物合成技術則可以將稀有糖生產的原料突破了糖基生物質的范圍，衍生到可代謝產生這類小分子中間產物的脂肪、蛋白類原料，為稀有糖生產提供更大原料和代謝途徑改造選擇空間。今后應重點考慮將目前這些研究進展如何優(yōu)化成適應工廠生產模式，可重點考慮解決上述相關酶的催化效率、催化活性穩(wěn)定性、多酶體系組合優(yōu)化、超級菌株構建及其穩(wěn)定性、稀有糖分離純化工藝優(yōu)化（去蔗糖、葡萄糖殘留）方面存在的問題，以提高稀有活性糖的轉化效率、簡化生產工藝、降低生產成本，滿足人們日益增長的對稀有糖的需求。