張 磊, 王玉祥, 李瑞強, 樓明祝, 陳映霞, 張志杰, 張 博

(西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室 新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室 新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，新疆 烏魯木齊 830052)

土壤鹽漬化、淡水短缺對農(nóng)牧業(yè)主產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境以及可持續(xù)發(fā)展的威脅是一個世界性的問題[1]。我國農(nóng)業(yè)灌溉用水量約占總供應水量的62%，在西北干旱、半干旱地區(qū)，尤其是新疆，灌溉用水的短缺已成為限制農(nóng)業(yè)持久發(fā)展的重要因素。開發(fā)利用鹽水資源以增加灌溉水源已經(jīng)成為了我國西北地區(qū)解決水資源危機的一項重要措施[2-3]。土壤中鹽離子含量過高會會對植物產(chǎn)生滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫。并對植物的種子萌發(fā)、根長、株高、結(jié)實等方面抑制顯著[4]。選育種植耐鹽牧草是節(jié)約灌溉用水與緩解土壤鹽漬化的重要的方法[5]。

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)是一種豆科多年生牧草，抗逆性強，并且可以與紫花苜蓿和蘭花苜蓿等天然雜交，是優(yōu)秀的育種材料[6]。目前關(guān)于黃花苜蓿耐鹽性的研究較少，呂世杰[7]試驗表明脯氨酸、可溶性糖和丙二醛可以作為鑒定黃花苜蓿耐鹽性的指標，葉綠素不能作為鑒定指標；田雨等[8]通過測定不同濃度NaCl脅迫下黃花苜蓿的生長特性，認為錫盟黃花苜蓿耐鹽性較強；武祎等[9]研究了中性鹽和堿性鹽對黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響，認為堿性鹽的脅迫作用大于中性鹽，但黃花苜蓿鹽脅迫和高pH有一定的耐受性；秦峰梅等[10]測定不同NaCl濃度下黃花苜蓿的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等指標，認為黃花苜蓿耐鹽性強于紫花苜蓿。王俊杰[6]測定了不同濃度的NaCl脅迫下，37個野生黃花苜蓿居群的成活率、株高和地上生物量等指標，并進行篩選出了耐鹽品種。已有的研究主要集中于黃花苜蓿單鹽脅迫下的生理和生長指標變化，而關(guān)于利用自然環(huán)境下淡化鹽水進行復合鹽脅迫的研究相對較少。本研究使用新疆達坂城鹽湖水稀釋液連續(xù)澆灌107份國內(nèi)外黃花苜蓿種質(zhì)，通過測定鹽脅迫對形態(tài)指標、光合指標和生理指標的影響，并應用綜合分析法對供試材料的耐鹽性及耐鹽性相關(guān)指標進行綜合評價，以期為黃花苜蓿耐鹽性評價及耐鹽性苜蓿育種提供理論和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以國內(nèi)外的107份野生黃花苜蓿種質(zhì)作為試驗材料，種子均由新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院和西部干旱區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室提供，表1所示。

表1 供試黃花苜蓿種質(zhì)材料編號及來源Table 1 Number and origin of yellow alfalfa germplasms used in this study

續(xù)表1

1.2 試驗方法

試驗于2020年6月在新疆農(nóng)業(yè)大學三坪試驗基地進行。選擇顆粒飽滿、大小均一的黃花苜蓿種子，用刀片劃破表皮，破除種子硬實。使用塑料花盆(上內(nèi)徑12 cm、下內(nèi)徑10 cm、高12 cm)種植，每盆裝干燥花土0.5 kg，按50∶1的比例施基肥。每盆播種5粒，播種20盆。每天光照16 h(光照強度6 680 Lux)，溫度為22℃±1℃；黑暗8 h，溫度18℃±1℃，保持濕度55%±10%。出苗15 d后間苗至每盆1株，出苗30 d后刈割至2 cm，再生長15 d后按照長勢平均分為對照組和實驗組。

實驗組處理液為電導率為10 mS·cm-1的新疆達坂城鹽湖水稀釋液(氨氮：0.44 mg·L-1，總磷：0.19 mg·L-1，總氮：0.99 mg·L-1，pH=6.5)，每4 d處理一次，每次澆灌300 ml，對照組澆灌自來水。試驗于50 d(處理12次)后結(jié)束，測定其形態(tài)、光合及生理指標。

1.3 測定內(nèi)容及方法

1.3.1形態(tài)指標測定 試驗第52 d測定最終形態(tài)指標，采取常規(guī)測量法測定株高(Plant height，PH)、幅長(Plant length，PL)、幅寬(Plant wide，PW)、莖粗(Stem diameter，SD)；齊地刈割地上部分，用清水清洗后擦干，稱量鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)；使用LA-S3000型葉面積儀測量植物全葉面積(Whole leaf area，LA)；最后用紙包住放入烘箱，105℃殺青45 min，恒溫70℃過夜后稱量干重(Dry weight，DW)。

1.3.2SPAD值與葉綠素熒光測定 試驗第53 d中午11：00至15：00測定SPAD值與葉綠素熒光數(shù)據(jù)，使用SPAD502葉綠素含量測定儀測量每盆植株固定葉片(倒2葉)的SPAD值，測定5次后計算平均值；使用PEA植物效率分析儀測定每盆植株固定葉片(倒2葉)的葉綠素熒光參數(shù)(Fo/Fm，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo)，重復3次。

1.3.3生理指標測定 試驗第54 d進行取樣，分別從對照組和實驗組稱取新鮮葉片1 g，重復3次，取樣后迅速用錫箔紙包裹后放于液氮中備用。采用茚三酮測法測定葉片脯氨酸(Proline，Pro)含量；采用硫代巴比妥酸法測定葉片丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量；采用蒽酮比色法測定葉片可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019進行基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理處理，使用SPSS 26.0進行相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析及聚類分析，使用DPS 9.01進行灰色關(guān)聯(lián)度分析。對供試材料進行耐鹽排序并篩選耐鹽性鑒定關(guān)鍵指標。

1.4.1抗性指數(shù) 以抗性指數(shù)來評價不同材料間的抗性，某項測定指標的抗性指數(shù)(α)的計算：

(1)

1.4.2權(quán)重 使用主成分分析后因子載荷計算各主成分權(quán)重：

(2)

1.4.3隸屬函數(shù)值及耐鹽度量值(D值) 為減少不同指標間的差異，使用各材料主成分得分進行隸屬度的計算：

(3)

式中：X(β)是某一份材料隸屬度值；Xi是某一指標的主成分得分的平均值；Xmin為該主成分得分最小值； Xmax為該指主成分得分最大值。

(4)

式中：D代表耐鹽性度量值，n代表指標數(shù)。

1.4.4灰色關(guān)聯(lián)度 依照公式(5)將各指標的隸屬函數(shù)值進行累加求其平均值。參照耿慧等[11]的方法，對原始數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，以隸屬函數(shù)值作為參考數(shù)列，各指標作為比較數(shù)列，進行灰色關(guān)聯(lián)度分析。

(5)

式中Xt表示隸屬度平均值，n表示指標數(shù)。

關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度的計算公式為：

(6)

(7)

式中，Ψi(k)為關(guān)聯(lián)系數(shù)，ri為灰色關(guān)聯(lián)度。|x0(k)-xi(k)|表示參考數(shù)列與比較數(shù)列間的絕對差值，minimink|x0(k)-xi(k)|為二級最小差值，maximaxk|x0(k)-xi(k)|為二級最大差值。ρ為分辨系數(shù)，本實驗中取值為0.5[12]。

2 結(jié)果分析

2.1 鹽脅迫對各指標的影響

通過公式(1)計算供試材料各指標抗性指數(shù)，并對各指標對照組和實驗組的平均值進行獨立樣本T檢驗。在鹽水連續(xù)澆灌下，可溶性糖差異不顯著，SPAD在P<0.05水平下存在顯著差異，其余指標皆在P<0.01水平下存在顯著差異(表2)。

表2 供試材料指標的測定及差異分析Table 2 Measurement and difference analysis of tested materials

2.2 鹽脅迫下各指標抗性指數(shù)的相關(guān)性分析

將鹽脅迫下14個指標抗性指數(shù)進行相關(guān)性分析(圖1)，結(jié)果表明：株高與鮮重、干重、SPAD呈正顯著相關(guān)(P<0.05)；幅長與幅寬、鮮重、干重、莖粗、全葉面積呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Fv/Fo呈顯著正相關(guān)；幅寬與鮮重、干重、全葉面積呈極顯著正相關(guān)，與可溶性糖呈極顯著負相關(guān)；鮮重與干重、莖粗、全葉面積、Fv/Fo呈極顯著正相關(guān)，與Fv/Fm呈顯著正相關(guān)；干重與莖粗、全葉面積、Fv/Fo呈極顯著正相關(guān)，與Fv/Fm呈顯著正相關(guān)，與Fo/Fm呈顯著負相關(guān)；全葉面積與丙二醛、Fv/Fo呈顯著正相關(guān)；SPAD與丙二醛呈顯著負相關(guān)；脯氨酸與可溶性糖呈極顯著負相關(guān)；丙二醛與Fo/Fm呈極顯著正相關(guān)，與Fv/Fm呈極顯著負相關(guān)，與Fv/Fo呈顯著負相關(guān)；可溶性糖與Fo/Fm呈顯著正相關(guān)，與Fv/Fm、Fv/Fo呈顯著負相關(guān)；Fo/Fm與Fv/Fm、Fv/Fo呈極顯著負相關(guān)；Fv/Fm與Fv/Fo呈極顯著正相關(guān)。

圖1 鹽脅迫下各指標抗性指數(shù)的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of each index resistance index under salt stress

2.3 各指標抗性指數(shù)主成分分析

對14個指標的抗性指數(shù)進行主成分分析，獲得因子載荷和貢獻率。表3可知：前4個主成分(Principal component，PC)累計貢獻率達83.28%，基本可以代表供試材料14個指標的絕大部分信息。在第1主成分中(PC1)，鮮重、干重、幅長、全葉面積與幅寬具有較高的因子載荷，分別為0.855，0.829，0.733，0.710和0.690；在第2主成分中(PC2)，F(xiàn)o/Fm、Fv/Fm和Fv/Fo有較高的因子載荷，分別為0.768，-0.761和-0.720；在第3主成分中(PC3)，脯氨酸和可溶性糖具有較高的因子載荷，為-0.774和0.675；在第4主成分中(PC4)，SPAD具有較高的因子載荷，為-0.814。

表3 主成分分析因子載荷及權(quán)重Table 3 Principal component analysis factor loading and weight

2.4 隸屬函數(shù)值及耐鹽性度量值(D值)

通過計算各主成分特征向量，獲取供試材料主成分得分，使用公式(3)計算各主成分的隸屬函數(shù)值，使用公式(4)計算供試材料的耐鹽性度量值(表4)。其中耐鹽性排在前5的材料是：84，48，97，39，47；耐鹽性排在倒5的材料是：21，57，59，65，100。

表4 供試材料隸屬函數(shù)值及耐鹽性度量值Table 4 Subordinative funcation and D value of tested materials

2.5 聚類分析

以材料耐鹽性度量值為基礎(chǔ)，使用瓦爾德法對107份材料的耐鹽性進行聚類分析[13]，分為6個類群，并根據(jù)其耐鹽性度量值劃分為：極強(Extremely strong)、強(Strong)、較強(Generally strong)、較弱(Generally weak)、弱(Weak)和極弱(Extremely weak)。

其中類群I為耐鹽性極強的材料，包括10份材料，占總材料數(shù)的9.35%，平均D值為0.718；類群II為耐鹽性強的材料，包括15份材料，占總材料數(shù)的14.02%，平均D值為0.578；類群III為耐鹽性較強的材料，包括27份材料，占總材料數(shù)的25.23%，平均D值為0.504；類群IV為耐鹽性較弱的材料，包括21份材料，占總材料數(shù)的19.63%，平均D值為0.423；類群V為耐鹽性弱的材料，包括28份材料，占總材料數(shù)的26.17%，平均D值為0.363；類群VI為耐鹽性極弱的材料，包括6份材料，占總材料數(shù)的5.61%，平均D值為0.246(圖2)。

圖2 供試材料耐鹽性聚類分析Fig.2 Cluster analysis of salt resistance of tested materials

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度

使用公式(5)(6)(7)對14個指標進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，以D值作為參考序列，14個指標的抗性指數(shù)作為比較序列進行分析。各指標抗性指數(shù)與D值關(guān)聯(lián)度(表5)排列順序如下：全葉面積>幅長>脯氨酸>幅寬>干重>莖粗>Fv/Fo>鮮重>丙二醛>株高>Fo/Fm>可溶性糖>SPAD>Fv/Fm。

表5 各抗性指數(shù)的灰色關(guān)聯(lián)度及排序Table 5 Grey correlation analysis and rank of resistance index

3 討論

研究表明，苜蓿苗期對鹽脅迫比較敏感，易遭受鹽害影響導致發(fā)育遲緩甚至死亡，而生長的后期對鹽脅迫表現(xiàn)的就相對不敏感，苗期是評價黃花苜蓿耐鹽性的最佳時期[14-16]。因此,本試驗使用苗期黃花苜蓿進行鹽脅迫處理，篩選耐鹽材料。

3.1 耐鹽指標的篩選

植物的耐鹽性評價因涉及到滲透脅迫、離子脅迫和pH脅迫等眾多因素的影響，是一個十分復雜的機制[17]，所以通過從形態(tài)、生理、光合等多個方面進行分析評價才能真實反映植物耐鹽性的大小。在鹽脅迫下，植物的生長速率，生物量等直接指標均被抑制，株高及生物量顯著下降[18]。鹽脅迫下，植物細胞膜受損，產(chǎn)生過氧化產(chǎn)物，丙二醛作為過氧化產(chǎn)物隨著鹽濃度的上升而上升[19-21]。植物遭受鹽脅迫時，通過降解大分子以降低滲透勢，以保證逆境條件下水分的正常供應[22]，隨著鹽濃度的上升，植物體內(nèi)可溶性糖的含量也在上升[23]。脯氨酸作為植物逆境脅迫下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗逆性緊密相關(guān)[24-25]，植物在鹽脅迫時脯氨酸不斷累積，提高細胞對水分的保持能力，增強植物對鹽脅迫的適應性[26]；但也有研究表明，隨著鹽脅迫濃度的增加，脯氨酸的積累呈先升高后下降的趨勢[18,27]。一般認為，植物受到鹽脅迫時，葉面積降低，光合作用也會受到抑制，隨著鹽濃度的上升，生長速度降低，總?cè)~面積降低；葉綠素酶活性提高，葉綠素含量減少，導致植物光合能力下降[13,27-29]。

本試驗中，107份材料在鹽脅迫下各項形態(tài)指標與光合指標均不同程度下降，生理指標不同程度上升，與前人研究一致。通過主成分分析確定鮮重、干重、幅長、全葉面積、幅寬、Fo/Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、脯氨酸、可溶性糖、SPAD為主要作用因子。并通過計算各指標抗性指數(shù)與耐鹽性度量值的灰色關(guān)聯(lián)分析，篩選出全葉面積、幅長和脯氨酸可作為鑒定耐鹽性的關(guān)鍵指標。

3.2 耐鹽性評測方法

因苜蓿的耐鹽性是一個復雜的特性，與多個指標相關(guān)，故一般進行苜蓿耐鹽性鑒定多采用綜合評價：李源等[16]運用聚類分析、標準差系數(shù)賦予權(quán)重法18個國外苜蓿品種的苗期耐鹽性進行了綜合評價；梁曉等[30]對10個紫花苜蓿品種的萌發(fā)期和生長期的耐鹽性進行了分析，以7個性狀指標均值為依據(jù)，通過綜合指標法和灰色關(guān)聯(lián)度法，確定了耐鹽與敏鹽品種；李明雨等[31]研究了不同鹽濃度下22份苜蓿萌發(fā)期的耐鹽性，篩選出耐鹽材料及敏鹽材料，并確定1.2% NaCl為苜蓿萌發(fā)期耐鹽性鑒定的最適濃度；楊紫貽等[32]對30份紫花苜蓿材料及耐鹽性分析，通過隸屬函數(shù)及綜合分析，將其耐鹽性分為3類，并確定“中苜1號”苜蓿耐鹽性最強，“隴東”苜蓿耐鹽性最弱；張則宇等[13]以13個指標的耐鹽系數(shù)為基礎(chǔ)，運用加權(quán)隸屬函數(shù)法、灰色關(guān)聯(lián)法、聚類分析將59份苜蓿劃分為5個耐鹽性不同類群，并確定了4個苜蓿苗期耐鹽鑒定指標。魚小軍等[33]比較了扁蓿豆(MelissilusruthenicusL.)和苜蓿萌發(fā)期的耐鹽性強弱，通過對5項指標進行隸屬函數(shù)綜合分析，認為苜蓿的耐鹽性強于扁蓿豆；金艷等[34]以14個苜蓿雜交組合F1代為試驗材料，使用隸屬函數(shù)法選出耐鹽性較好的雜交組合。

本試驗中，通過測定14個指標的抗性指數(shù)，采用加權(quán)隸屬函數(shù)法對107份供試材料耐鹽性進行綜合評價，并通過聚類分析將其劃分為6個耐鹽類型。

4 結(jié)論

通過對14個指標進行主成分分析、隸屬函數(shù)分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析得出全葉面積、幅長和脯氨酸等3個指標可作為黃花苜蓿苗期耐鹽性評價的關(guān)鍵指標；107份材料耐鹽能力分為6類，耐鹽能力較強的3份材料為84，48，97；耐鹽能力較差的3份材料依次為21，57，59；本試驗研究結(jié)果可為苜蓿耐鹽性評價及耐鹽性育種提供理論和材料基礎(chǔ)。