李彥飛， 楊雙雙， 初曉輝， 馬向麗,2， 段新慧,2， 韓 博,2， 段佳鑫， 單貴蓮,2*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201； 2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院， 云南 昆明 650201)

青貯是在厭氧環(huán)境中，利用乳酸菌的發(fā)酵作用，降低pH，抑制有害菌的生長(zhǎng)，以長(zhǎng)期保存飼草青綠多汁營(yíng)養(yǎng)特性的簡(jiǎn)單而又經(jīng)濟(jì)的方法[1]。在青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2]。青貯飼料中乳酸菌種類(lèi)較豐富，其中，乳酸菌并不是青貯飼料表面附著的唯一的微生物[3]，梭狀芽孢桿菌(ClostridiumPerfringens)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Candidaboidinii)等也常附著在青貯飼料表面，并與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)水溶性碳水化合物，降低了青貯飼料的品質(zhì)[4-5]。

為有效提升青貯飼料的品質(zhì)，人們往往采用添加乳酸菌制劑的方式進(jìn)行青貯。研究表明添加乳酸菌制劑大多能有效改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性[6-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，受區(qū)域性環(huán)境因素的影響，接種乳酸菌可能對(duì)青貯品質(zhì)沒(méi)有提升效果甚至?xí)档颓噘A品質(zhì)，因?yàn)楦苓m應(yīng)環(huán)境的附著微生物可能更具競(jìng)爭(zhēng)力而主導(dǎo)青貯過(guò)程[9-10]。添加適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件的乳酸菌菌株，才能起到提升青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的效果[11-12]。然而，不同地區(qū)、不同類(lèi)型青貯飼料中乳酸菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量差異較大[5]，開(kāi)展青貯原料表面附著優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選研究，研發(fā)出適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件的乳酸菌制劑，對(duì)促進(jìn)當(dāng)?shù)厍噘A產(chǎn)業(yè)及草地畜牧業(yè)的高效發(fā)展具有一定的推動(dòng)作用。

為篩選出適應(yīng)昆明氣候條件、地理環(huán)境及青貯原料種類(lèi)的青貯用乳酸菌制劑，提高全株玉米青貯飼料的青貯品質(zhì)，本試驗(yàn)旨在發(fā)現(xiàn)適應(yīng)昆明溫暖濕潤(rùn)氣候條件的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株，探討其在全株玉米青貯上的應(yīng)用效果，為昆明地區(qū)青貯用乳酸菌制劑的研發(fā)提供材料與支撐。

1 材料與方法

1.1 優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選與鑒定

1.1.1優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選 2021年7月20日，將采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校實(shí)習(xí)基地的蠟熟期‘云瑞121’青貯玉米(Zeamays‘Yunrui 121’)、現(xiàn)蕾期‘WL525’紫花苜蓿(Medicagosativa‘WL525’)、抽穗期‘安巴’鴨茅(Dactylisglomerata‘Amba’)，粉碎至3～4 cm、揉搓、充分混合均勻后裝入容積為5 kg的聚乙烯塑料桶，每份材料裝3桶，壓實(shí)密度為640 kg·m-3，密封，于室溫避光貯藏，自然發(fā)酵60 d。

2021年9月20日，取發(fā)酵完成的青貯樣品各10 g，利用稀釋涂布平板法[13]進(jìn)行乳酸菌的分離，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，從3種樣品中各分離30株菌株，依次編號(hào)為A1-A30(來(lái)自青貯玉米樣品)、B1-B30(來(lái)自紫花苜蓿樣品)、C1-C30(來(lái)自鴨茅樣品)。將90株菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)[13]，篩選出乳酸菌菌株并繼代劃線(xiàn)3次，得到純化的菌株。將純化后的菌株接種在裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)24～36 h。于培養(yǎng)12 h和24 h時(shí)測(cè)其OD600 nm及pH值，據(jù)此初選優(yōu)質(zhì)菌株。根據(jù)初選菌株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率[14]，初選獲得9優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株。

1.1.2乳酸菌生理生化特性及鑒定 根據(jù)Cai等[14]描述的乳酸菌鑒定方法，對(duì)9株菌株進(jìn)行革蘭氏染色、菌落形態(tài)、過(guò)氧化氫酶活性和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)。

1.1.3乳酸菌的鑒定及分類(lèi)地位的確定 采用TIANamP細(xì)菌DNA試劑盒(DP302-02，天根科技有限公司，北京，中國(guó))[15]，按照說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA。通過(guò)引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將長(zhǎng)度約為1 500 bP的條帶PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程(云南)股份有限公司測(cè)序并進(jìn)行序列分析[14]。將測(cè)得的16SrRNA序列提交NCBI Genbank進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，得出菌株的屬種信息。

選取Genbank中與初選菌株相似度最高的已知菌株序列，利用MEGA7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其分類(lèi)地位。

1.1.4優(yōu)質(zhì)菌株生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸能力測(cè)定 將初選獲得的9株菌株發(fā)酵液以3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)定其OD600 nm和pH值，連續(xù)測(cè)定24 h，終選出3株優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株，并繪制產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速率曲線(xiàn)。

1.2 優(yōu)質(zhì)乳酸菌應(yīng)用效果檢測(cè)

1.2.1供試材料的種植與管理 供試玉米品種為‘曲辰9號(hào)’青貯玉米(Zeamays‘Quchen 9’)，該品種購(gòu)自北京克勞沃種業(yè)有限公司。2021年6月15日，將供試玉米品種播種于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校實(shí)習(xí)基地(25°21′N(xiāo)，102°58′E)，穴播，種植密度58 000株·hm-2，播種時(shí)適量施入農(nóng)家肥為基肥，復(fù)合肥為種肥，之后于玉米拔節(jié)期追施適量尿素，并于玉米生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行常規(guī)管理，確保其正常生長(zhǎng)。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2021年10月16日，將篩選獲得的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株，進(jìn)行活化，按照3%的接種量加入100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)24 h制成優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌液。將優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌液，單獨(dú)或按1∶1配比添加到蠟熟期全株玉米中進(jìn)行青貯發(fā)酵(設(shè)自然發(fā)酵和添加商用乳酸菌制劑為對(duì)照)，檢測(cè)其應(yīng)用效果。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，表1為各處理乳酸菌種類(lèi)、活菌數(shù)量、添加量等。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

1.2.3青貯樣品的制作 2021年10月16日，將蠟熟期全株玉米刈割，用切短揉搓機(jī)粉碎(長(zhǎng)度2～3 cm)并混合均勻后，將自制菌液均勻噴灑在原料表面(CK組噴灑等量蒸餾水，商用乳酸菌制劑按推薦添加量溶于蒸餾水后均勻噴灑)，充分混均、揉搓，確保噴灑均勻。將處理好的樣品裝入容積為5 kg的聚乙烯塑料桶，每處理裝3桶，壓實(shí)密度為640 kg·m-3，即為3次重復(fù)。壓實(shí)、密封，發(fā)酵60 d后開(kāi)封取樣，開(kāi)展相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，全株玉米原料的WSC為8.11% DM，CP為6.33% DM，ADF為27.75% DM，NDF為44.61% DM，EE為14.15% DM，Ash為3.70% DM。

1.2.4測(cè)定指標(biāo)及方法

發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定:pH值采用pH計(jì)測(cè)定[15]。乳酸、乙酸、丁酸及丙酸含量采用高效液相色譜法測(cè)定[8]，色譜柱為RoA-organic Acid H+(8%)，柱溫為30℃，流動(dòng)相為20 mmol·L-1KH2PO4/H3PO4,pH為2.37，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為0.6 mL·min-1。NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定[16]。

微生物數(shù)量測(cè)定:采用稀釋涂布平板法[13]進(jìn)行乳酸菌、酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌的計(jì)數(shù)。乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基(上海博微生物科技有限公司，上海，中國(guó))，好氧細(xì)菌使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基培養(yǎng)[13]。乳酸菌和好氧細(xì)菌在30℃下培養(yǎng)2 d，酵母菌和霉菌在28℃條件下培養(yǎng)3～5 d，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定:DM采用烘干法[17]，NDF及ADF采用范氏法[6]，CP采用凱氏定氮法[8]，EE采用殘余法[18]，Ash采用灼燒法[19]，WSC采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[13]。

有氧穩(wěn)定性的測(cè)定:取500 g置于15 cm×20 cm塑料封口袋中，用牙簽扎數(shù)十個(gè)小孔，再套上一個(gè)寬松不封口的塑料袋，防止交叉污染和減少水分損失，置于室溫下存放，避免陽(yáng)光直射。記錄溫度從完成裝袋時(shí)算起，每4 h記錄1次，直至所有處理組的溫度超過(guò)環(huán)境溫度2℃為止。環(huán)境溫度以?huà)煸趬ι系臏囟扔?jì)為參考。同時(shí)為消除環(huán)境溫度驟變帶來(lái)的誤差，以試驗(yàn)前放置的水為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)，采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法[19]對(duì)青貯營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，如果測(cè)定的指標(biāo)與青貯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值呈正相關(guān)，計(jì)算公式如下：

如果為負(fù)相關(guān)，則用反隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，計(jì)算公式如下：

式中：R(Xi)為某一指標(biāo)隸屬函數(shù)值，Xi為該指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin分別為該指標(biāo)所有測(cè)定值中的最大值和最小值。

對(duì)所有指標(biāo)隸屬函數(shù)值進(jìn)行相加，求其平均值，以平均值大小進(jìn)行排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆明本土青貯飼料中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選與鑒定

2.1.1乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征 從昆明本土青貯飼料中分離出90株菌株，經(jīng)革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，繼代劃線(xiàn)3次，純化獲得83株乳酸菌菌株。通過(guò)16SrRNA序列和NCBI Blast N序列比對(duì)，83株乳酸菌菌株分別屬于乳酸桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)和魏斯氏菌(Weissella)3個(gè)屬，包含了植物乳桿菌(L.Plantarum)、戊糖片球菌(P.Pentosaceus)、短乳桿菌(L.brevis)和類(lèi)腸膜魏斯氏菌(W.Paramesenteroides)4個(gè)種，其中植物乳桿菌42株，占50.6%，戊糖片球菌和短乳桿菌各18株，占21.7%，類(lèi)腸膜魏斯氏菌5株，占0.06%(表2)。

表2 83株乳酸菌鑒定結(jié)果及分布詳情T(mén)able 2 Identification results and distribution details of 83 lactic acid bacteria strains

2.1.2乳酸菌的鑒定與篩選 根據(jù)培養(yǎng)12 h和24 h時(shí)的OD600 nm值及pH值，從83株菌株中初選出9個(gè)優(yōu)質(zhì)菌株，分別是A9，A11，A19，B10，B16，B23，C10，C14和C23菌株。通過(guò)對(duì)其生理生化特征的測(cè)定，結(jié)果表明，9株菌株均呈過(guò)氧化氫酶陰性和革蘭氏陽(yáng)性，其中A9，A11，A19，B10，B16，B23，C10均是桿狀，初步判定為片球菌屬；而C14，C23是球狀，初步鑒定是乳桿菌屬。9株菌株中，B10菌株能夠利用葡萄糖產(chǎn)生氣體，并產(chǎn)生乳酸，表明B10菌株是異型乳酸菌，其余8株菌株不能利用葡萄糖產(chǎn)生氣體，表明這8株菌株是同型乳酸菌(表3)。

表3 乳酸菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

通過(guò)對(duì)9株菌株糖發(fā)酵試驗(yàn)的測(cè)定(表4)，結(jié)果表明，A9,A11,A19,B16,B23,C23菌株能夠利用半乳糖、乳糖、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊甘、蔗糖、棉子糖、馬尿酸、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、蜜二糖，初步鑒定為植物乳桿菌。B10菌株能夠利用半乳糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖，不能利用其它糖進(jìn)行發(fā)酵，且其形狀為桿狀，初步鑒定為短乳桿菌。C14,C23菌株形狀為球狀，能夠利用半乳糖、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、阿拉伯糖、果糖、甘露糖，初步鑒定為戊糖片球菌。

表4 乳酸菌糖發(fā)酵特性Table 4 Characteristies of sugar fermentation of lactic acid bacteria

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示(圖1)，菌株A9，A11，A19，B16，B23，C10與L.Plantarum以100%相似度聚在同一支上，鑒定為植物乳桿菌。菌株B10與L.brevis以100%相似度聚在同一支上，鑒定為短乳桿菌。菌株C14，C23與P.Pentosaceu以100%相似度聚在同一支上，鑒定為戊糖片球菌。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的參考菌株見(jiàn)表5。

圖1 乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建Fig.1 Construction of phylogenetic tree of lactic acid bacteria

表5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)參考菌株Table 5 To construct reference strains of lactic acid bacteria phylogenetic tree

比較初選獲得的9株菌株的生長(zhǎng)速度及產(chǎn)酸速率，分別從3種乳酸菌菌株中篩選獲得產(chǎn)酸能力最強(qiáng)、生長(zhǎng)速度最快的3株菌株為優(yōu)質(zhì)菌株，它們分別是短乳桿菌B10、植物乳桿菌B16及戊糖片球菌C23。進(jìn)一步測(cè)定其產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速率，結(jié)果表明：培養(yǎng)15 h時(shí)，B16菌株的pH下降至3.44，C23菌株的pH下降至3.84。培養(yǎng)24 h時(shí)，B16菌株的pH為3.37，C23菌株的pH值為3.56，B10菌株的pH為4.22，此時(shí)B16菌株和C23菌株的pH值基本達(dá)到穩(wěn)定(圖2A)。培養(yǎng)12 h時(shí)，B16和C23菌株的OD600nm值基本達(dá)到最大值，為2.87和2.80。B10菌株在培養(yǎng)的第6～12 h生長(zhǎng)相對(duì)較慢，但在培養(yǎng)的第12～24 h快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)，其OD600nm增加至2.84(圖2B)。

圖2 優(yōu)質(zhì)乳酸菌的產(chǎn)酸速率(A)及生長(zhǎng)速率(B)Fig.2 Acid production rate (A) and growth rate (B) of high-quality lactic acid bacteria

2.2 添加本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)的影響

2.2.1對(duì)微生物數(shù)量的影響 圖3A可知，與CK相比，添加自制乳酸菌及商用乳酸菌可顯著增加全株玉米青貯樣品的乳酸菌數(shù)量(D處理除外)，以X和W1D1處理乳酸菌數(shù)量最高，顯著高于其他處理(P<0.05)。圖3B可知，與CK相比，添加自制乳酸菌及商用乳酸菌均可顯著降低全株玉米青貯飼料中好氧細(xì)菌的數(shù)量(P<0.05)。以W1D1和X處理效果最好，此2種處理下青貯樣品好氧細(xì)菌數(shù)量較CK降低了37.5%和35.5%。本試驗(yàn)所有處理均未檢測(cè)出酵母菌和霉菌的存在。

圖3 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯飼料乳酸菌(A)及好氧細(xì)菌(B)的影響Fig. 3 Effects of different lactic acid bacteria preparations on LAB (A) and AB (B) in whole corn silage注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),下同Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant differences(P<0.05). Same in the following figures

2.2.2對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響 圖4A可知，與CK相比，添加乳酸菌處理下青貯樣品的pH值顯著降低(P<0.05)，下降范圍為0.7%～4.1%。圖4B可知，與CK相比，D，Z1D1，W1D1處理青貯樣品NH3-N含量降低了2.6%～9.6%，但4處理間差異不顯著(P<0.05)，Z，W，X處理青貯樣品NH3-N含量顯著增加(P<0.05)，增幅為18.2%～27.3%。表明添加異型發(fā)酵乳酸菌菌液(D處理)或異型與同型乳酸菌菌液的配合添加(Z1D1、W1D1處理)可以顯著降低青貯飼料的NH3-N含量(P<0.05)。相比較而言，單獨(dú)添加同型發(fā)酵乳酸菌菌液(Z、W處理)不能很好地抑制好氧細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)(圖3B)，可能是因?yàn)楹醚跫?xì)菌的繁殖生長(zhǎng)加速了飼料中粗蛋白的分解，青貯飼料中NH3-N含量增加。

圖4 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯飼料pH(A)、NH3-N(B)、LA(C)及AA(D)的影響Fig.4 Effects of lactic acid bacteria preparation on pH (A),NH3-N (B),LA (C) and AA (D) of whole corn silage

圖4C可知，不同處理全株玉米青貯樣品乳酸含量以Z1D1處理最高，較CK增加了28.6%，其次是X處理，較CK增加了15.1%，位于第三位的是W和W1D1處理，較CK增加了6.9%和10.6%。圖4D可知，與CK相比，X處理青貯樣品AA含量增加了30.2%，Z1D1，W1D1，D處理增加了16.9%，15.7%和15.1%。表明異型發(fā)酵乳酸菌菌液?jiǎn)为?dú)添加(D處理)或異型與同型乳酸菌菌液的配合添加(X、Z1D1，W1D1處理)與CK相比，在提高全株玉米青貯飼料AA含量上效果顯著。相比較而言，單獨(dú)添加同型發(fā)酵乳酸菌菌液(W、Z處理)在提高青貯飼料AA含量上效果不明顯。本試驗(yàn)中，所有處理均未檢測(cè)出丙酸和丁酸，表明在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，有害微生物活動(dòng)較少。

2.2.3對(duì)常規(guī)養(yǎng)分的影響 表6可知，與CK相比，添加乳酸菌制劑的全株玉米青貯飼料DM，CP，EE含量顯著高于CK組，其WSC(Z1D1處理除外)，ADF，Ash含量顯著低于CK組(P<0.05)，表明乳酸菌制劑的添加有利于全株玉米青貯飼料DM，CP及EE的保存，但乳酸菌制劑的添加促進(jìn)了青貯發(fā)酵，加速了對(duì)WSC和ADF的分解，因此顯著降低了青貯飼料的WSC和ADF含量。

表6 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 6 Effects of Lactic acid bacteria preparation on nutrient composition of whole corn silage 單位：%

2.2.4對(duì)有氧穩(wěn)定性的影響 圖5可知，與CK相比，添加自制或商用乳酸菌制劑(Z處理除外)可顯著增加全株玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定性(P<0.05)，以X處理有氧穩(wěn)定性最好，達(dá)到了215.6 h，較CK提高了1.87倍，其次是D，W1D1，Z1D1處理，分別為141 h，131 h，124 h，較CK提高了88%，74.7%和65.3%。

圖5 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of lactic acid bacteria preparation on aerobic stability of whole corn silage

2.2.5對(duì)綜合品質(zhì)的影響 圖6可知，不同處理全株玉米青貯品質(zhì)優(yōu)劣排序?yàn)閆1D1>W1D1=X>W>D>Z>CK。與CK相比，自制或商用乳酸菌制劑的添加可顯著提高全株玉米青貯飼料的品質(zhì)，但不同處理間存在一定的差異，以Z1D1處理綜合評(píng)分最高，其次是W1D1和X處理。與本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌和商用乳酸菌的添加效果相比，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌復(fù)合菌液的添加效果優(yōu)于或接近于商用乳酸菌制劑，但本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌單一菌液的添加效果不是很理想。在全株玉米青貯中，需要將同型和異型的乳酸菌進(jìn)行合理搭配，以便更好的發(fā)揮添加效果。

圖6 不同處理全株玉米青貯品質(zhì)綜合評(píng)價(jià) Fig.6 Comprehensive evaluation of whole plant corn silage under different treatments

3 討論

3.1 昆明本土青貯飼料中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選和鑒定

受地理、氣候、品種等因素的影響，青貯原料表面附著的微生物種類(lèi)及數(shù)量存在顯著差異[9]。本研究以3種青貯樣品為材料，從中分離出83株乳酸菌，其中，從青貯玉米和紫花苜蓿青貯飼料中分離出的優(yōu)勢(shì)菌種是植物乳桿菌和短乳桿菌，與付浩等[13]研究結(jié)論一致，但不同于Yang等[13]的研究結(jié)果，可能是氣候因子不同，致使同種青貯飼料表面附著乳酸菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量存在一定差異[5,9]。

生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率是優(yōu)質(zhì)乳酸菌篩選中兩個(gè)非常重要的指標(biāo)[7]。不同種類(lèi)的乳酸菌其產(chǎn)酸能力和生長(zhǎng)能力不同[24]。有研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵初期便能快速產(chǎn)酸，且發(fā)酵效率更高，可作為青貯啟動(dòng)菌[20-21]。本研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌植物乳桿菌B16和戊糖片球菌C23具有良好的產(chǎn)酸能力，異型發(fā)酵乳酸菌短乳桿菌B10產(chǎn)酸能力相較于前兩者略低，但該菌株在提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面具有較大潛力[22]。

3.2 昆明本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌的應(yīng)用效果

乳酸菌能夠改變青貯飼料內(nèi)的微生物體系，促進(jìn)青貯發(fā)酵，進(jìn)而改善青貯發(fā)酵品質(zhì)[22-27]。大量研究表明，添加乳酸菌能顯著降低青貯飼料的pH值和NH3-N含量，提高其乳酸含量[5,8,23-26]，有效保存青貯飼料的DM和CP含量[20,23,27-28]。本研究表明，與CK相比，添加優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌復(fù)合菌液可促進(jìn)全株玉米產(chǎn)生較多的乳酸和乙酸，抑制有害菌對(duì)DM,CP及氨基酸的分解，降低其N(xiāo)H3-N含量，有效提升青貯玉米的發(fā)酵品質(zhì)并有效保存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。相比較而言，單一菌液作用效果不如復(fù)合菌液顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)，與添加商用乳酸菌制劑相比，添加優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌菌液調(diào)制的青貯飼料其DM和CP含量更高，表明本研究篩選出的優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保存上發(fā)揮了較好的效果，具有良好的青貯潛能。

有氧穩(wěn)定性在生產(chǎn)應(yīng)用中是評(píng)估青貯質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[29]。青貯飼料開(kāi)罐后暴露于空氣中，有害微生物利用乳酸及多余糖類(lèi)、氨基酸和蛋白質(zhì)，通過(guò)一系列的生理活動(dòng)，不斷釋放熱量，進(jìn)而造成青貯飼料的有氧變質(zhì)[30]。本研究顯示，與CK相比，優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌菌液的添加提高了青貯玉米的有氧穩(wěn)定性，以單獨(dú)添加異型發(fā)酵乳酸菌菌液或同型異型配合添加效果較好，與前人研究結(jié)論一致[31]。本研究還發(fā)現(xiàn)，與商用乳酸菌相比，優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的提升效果相對(duì)較差，分析原因?yàn)閰⒃嚿逃萌樗峋侵参锶闂U菌和布氏乳桿菌按1∶9配比制成的復(fù)合菌劑，其布氏乳桿菌配比較高。布氏乳桿菌屬異型發(fā)酵乳酸菌，其主要作用是產(chǎn)生乙酸，抑制有害菌滋生，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[7,22]。本試驗(yàn)添加的復(fù)合菌液，是同型和異型乳酸菌按1∶1配比制成的復(fù)合菌液。與商用乳酸菌相比，異型發(fā)酵乳酸菌占比偏低，因此其對(duì)有氧穩(wěn)定性的提升效果相對(duì)較差。本研究篩選出的優(yōu)質(zhì)本土菌液研發(fā)商用復(fù)合菌液時(shí)，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步提高異型發(fā)酵乳酸菌的占比。

4 結(jié)論

本研究從昆明地區(qū)全株玉米、紫花苜蓿、鴨茅3種青貯飼料中篩選出生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的3株優(yōu)質(zhì)乳酸菌，鑒定為短乳桿菌B10、植物乳桿菌B16及戊糖片球菌C23。添加優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌單一菌液或復(fù)合菌液的添加可更好的保存青貯飼料的DM及CP含量，但優(yōu)質(zhì)本土乳酸菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的提升效果相對(duì)較差。綜合得出，添加本土優(yōu)質(zhì)乳酸菌制劑能夠改善全株玉米的青貯發(fā)酵品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分含量和有氧穩(wěn)定性。