許寅聰，陳 達(dá)，陳 靜，劉超敏，李 娟，王超英，張素華，趙亞芳

目前，全球近視人口數(shù)量不斷增長(zhǎng)，近視發(fā)病率過(guò)快增長(zhǎng)已引起社會(huì)高度關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界高度近視患者約有1.63億[1-2]。61.7%的高度近視人群會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，特別是當(dāng)近視度數(shù)超過(guò)-10.00 D時(shí)，極易出現(xiàn)黃斑病變[3-4]，引起患者生活質(zhì)量嚴(yán)重降低，帶來(lái)沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，且臨床上缺乏控制近視的有效手段。受到紫外線A-核黃素角膜交聯(lián)技術(shù)在角膜疾病中應(yīng)用的啟發(fā)[5-6]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極探索鞏膜膠原交聯(lián)方法并希望將其應(yīng)用于病理性近視的治療中，目前鞏膜的交聯(lián)方法分為物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)兩種[7]。本實(shí)驗(yàn)為探索化學(xué)交聯(lián)方法，采用后Tenon's囊下注射京尼平的方法，將藥物直接注射于后極部鞏膜，希望引起后極部鞏膜的交聯(lián)效應(yīng)，增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度，達(dá)到延緩或抑制近視發(fā)展的目的。京尼平是一種天然交聯(lián)劑，提取自中藥梔子，是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，具有良好的生物相容性和低毒性，因此得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[8-9]。近年國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者圍繞京尼平的交聯(lián)效應(yīng)展開(kāi)了一系列研究，證明了京尼平確實(shí)可以增強(qiáng)鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度，但是對(duì)其安全性仍不甚明確[10-12]。故本研究通過(guò)觀察形覺(jué)剝奪性近視模型兔進(jìn)行京尼平鞏膜交聯(lián)后視網(wǎng)膜的電生理以及視網(wǎng)膜、鞏膜纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維的形態(tài)變化，來(lái)評(píng)估京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 選擇14日齡健康幼兔(新西蘭大白兔)60只(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不限，在解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心由專人進(jìn)行飼養(yǎng)。研究涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)取得醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)2018-KY-09)。京尼平產(chǎn)地日本。新生牛血清和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。RetiMINER-S型視覺(jué)電生理儀購(gòu)自重慶艾爾曦醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立：60只幼兔飼養(yǎng)室溫20～23 ℃，光照與黑暗的周期比例為1∶1。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只幼兔分為空白對(duì)照組、近視模型組和京尼平注射+眼瞼縫合組3組，每組20只，均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼未處理?？瞻讓?duì)照組雙眼均不處理，近視模型組實(shí)驗(yàn)眼進(jìn)行眼瞼縫合，京尼平注射+眼瞼縫合組實(shí)驗(yàn)眼結(jié)膜下注射0.5 mmol/L京尼平0.25 ml，隔日1次，連續(xù)注射4次，每次注射后縫合眼瞼，注射前拆線進(jìn)行下一次注射，第一次和第三次注射部位為鼻上1點(diǎn)鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下，第二次和第四次注射部位為顳下7點(diǎn)鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下。眼瞼縫合均采用雙“U”字形縫合，使用氧氟沙星眼膏涂眼每日1次，眼瞼縫合共持續(xù)60 d。

1.2.2閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查：實(shí)驗(yàn)60 d后使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分雙眼散瞳，將幼兔置于絕對(duì)暗室進(jìn)行暗適應(yīng)20 min，后固定幼兔，使用氯胺酮注射液35 mg/kg肌內(nèi)注射麻醉，使用0.5%丁卡因進(jìn)行角膜表面麻醉，使用表面涂有氧氟沙星眼膏的角膜電極置于角膜表面(作用電極為鍍金角膜電極，記錄條件符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))，參考電極和接地極分別安置在幼兔額部正中和耳緣皮下，擺放幼兔頭位置伸入刺激球，使檢測(cè)眼正對(duì)刺激球閃光點(diǎn)。行雙眼F-ERG檢查，順序?yàn)閷?shí)驗(yàn)眼暗適應(yīng)3.0檢查(無(wú)背景光，3.0 cd×s/m2，白色閃光，通頻帶1～300 Hz)，對(duì)照眼行暗適應(yīng)3.0檢查。檢查期間對(duì)側(cè)眼始終用遮光眼罩完全遮蓋，所有測(cè)量均由同一名技術(shù)人員完成。

1.2.3病理形態(tài)學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)60 d后，使用氯胺酮注射液(35 mg/kg)肌內(nèi)注射麻醉，選擇空氣栓塞法處死幼兔，固定于手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌條件下取出眼球，清除結(jié)膜及筋膜，保留眼外肌和視神經(jīng)，將眼球標(biāo)記清楚，依次放入眼球保存液1(25%新生牛血清，2% DMSO，2.5%蔗糖)、液2(25%新生牛血清，4% DMSO，5.5%蔗糖)、液3(25%新生牛血清，6% DMSO，7.5%蔗糖)，在每種保存液中浸泡10 min，最后置于眼球保存液4(25%新生牛血清，7.5% DMSO，10.0%蔗糖)中，密封好后放入-196 ℃液氮中保存。運(yùn)輸至光鏡實(shí)驗(yàn)室，將離體兔眼從液氮中取出后放入37 ℃水浴箱中復(fù)溫，然后使用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，于視神經(jīng)顳側(cè)垂直鞏膜連續(xù)切片至外直肌，視神經(jīng)使用垂直視神經(jīng)軸位方向切片，厚度0.5 μm，進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡逐層觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、鞏膜、眼外肌，并照相記錄。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)3組均進(jìn)行F-ERG檢測(cè)，比較a波振幅、a波潛伏期、b波振幅、b波潛伏期。因考慮需評(píng)估京尼平的不良反應(yīng)，僅對(duì)京尼平注射+眼瞼縫合組進(jìn)行光學(xué)顯微鏡HE染色觀察眼部結(jié)構(gòu)，包括鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)，以及觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞、鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維排列情況和是否存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2 結(jié)果

2.1F-ERG檢查結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)60 d后對(duì)3組幼兔進(jìn)行F-ERG檢查，分析暗適應(yīng)3.0檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組的a波振幅、b波振幅、b波潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但3組間a波潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。近視模型組a波振幅、b波振幅、b波潛伏期與空白對(duì)照組和京尼平注射+眼瞼縫合組比較均顯著降低(P<0.05)，但空白對(duì)照組與京尼平注射+眼瞼縫合組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組幼兔實(shí)驗(yàn)眼閃光視網(wǎng)膜電圖檢查結(jié)果比較

2.2病理組織學(xué)觀察 對(duì)京尼平注射+眼瞼縫合組進(jìn)行觀察，角膜、結(jié)膜及鞏膜大體觀察實(shí)驗(yàn)眼與對(duì)照眼之間無(wú)明顯差別。見(jiàn)圖1。HE染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)眼發(fā)現(xiàn)鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)異常變性壞死視網(wǎng)膜細(xì)胞，鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

圖1 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔角膜、結(jié)膜及鞏膜大體觀察

圖2 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜、鞏膜纖維、神經(jīng)纖維、眼外肌纖維病理組織學(xué)觀察(HE×200)

3 討論

病理性近視的發(fā)病機(jī)制與鞏膜的生物力學(xué)特點(diǎn)和自身的缺點(diǎn)有關(guān)，因?yàn)閺难矍虮谌龑咏Y(jié)構(gòu)的力學(xué)性能來(lái)看，在相同應(yīng)力的作用下，從視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜到鞏膜的切線模量呈逐步遞增的趨勢(shì)[13]，而鞏膜膠原纖維在后鞏膜葡萄腫形成過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。目前臨床治療病理性近視方法匱乏，國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用相對(duì)廣泛的是后鞏膜加固術(shù)，手術(shù)對(duì)于高度近視黃斑裂孔、阻止眼球繼續(xù)增長(zhǎng)具有一定效果[14]，但其長(zhǎng)期有效性及安全性仍需觀察。目前，探索鞏膜膠原交聯(lián)方法并用于病理性近視的治療成為研究熱點(diǎn)，其中天然交聯(lián)劑京尼平因具有優(yōu)良生物相容性和低毒性在眾多交聯(lián)劑中脫穎而出，本文圍繞京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性進(jìn)行研究。

本研究設(shè)計(jì)了3組，分別為空白對(duì)照組、近視模型組、京尼平注射+眼瞼縫合組，這樣分組的目的是為更全面觀察形覺(jué)剝奪性近視模型兔中京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性。在視網(wǎng)膜電生理檢查指標(biāo)中選擇F-ERG暗適應(yīng)3.0檢查，這是因?yàn)槟壳芭R床應(yīng)用的各項(xiàng)檢查中只有暗適應(yīng)3.0檢查可綜合反映視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞混合系統(tǒng)功能，其主要觀察指標(biāo)是a、b波的潛伏期和振幅，a波反映視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的功能，b波反映雙極細(xì)胞的功能。之所以選擇幼兔作為動(dòng)物模型是因?yàn)槌錾?4～74 d處于眼球的快速發(fā)育階段[15]，此階段有利于形覺(jué)剝奪性近視模型建立，同時(shí)也模擬了病理性近視眼軸延長(zhǎng)的過(guò)程。

本文F-ERG暗適應(yīng)3.0檢查結(jié)果顯示，近視模型組實(shí)驗(yàn)眼的a波振幅、b波振幅較空白對(duì)照組出現(xiàn)了顯著的降低，說(shuō)明在形覺(jué)剝奪60 d后幼兔發(fā)生了近視化，與此同時(shí)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能出現(xiàn)下降。本研究還顯示，京尼平注射+眼瞼縫合組的a波振幅及潛伏期、b波振幅及潛伏期均無(wú)異常，這除了說(shuō)明京尼平鞏膜交聯(lián)有良好安全性外，還證明其可通過(guò)控制鞏膜擴(kuò)張起到保護(hù)剝奪性近視致視網(wǎng)膜功能損傷作用。

考慮到在實(shí)際注射京尼平后，藥物存在局部擴(kuò)散使得京尼平鞏膜交聯(lián)不具備特異性，鞏膜周圍的眼外肌、視神經(jīng)、血管等組織均存在被交聯(lián)的可能性，所以本研究又觀察了京尼平注射+眼瞼縫合組實(shí)驗(yàn)眼的病理學(xué)形態(tài)改變，使用光學(xué)顯微鏡HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)異常變性壞死視網(wǎng)膜細(xì)胞，鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這說(shuō)明京尼平對(duì)于視網(wǎng)膜、鞏膜、視神經(jīng)、眼外肌是安全的。但本研究?jī)H選擇使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查，未能使用高倍電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的微結(jié)構(gòu)改變，今后需進(jìn)行補(bǔ)充以使結(jié)果更具有說(shuō)服力。

前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)形覺(jué)剝奪性近視模型兔進(jìn)行京尼平鞏膜交聯(lián)后的鞏膜條帶彈性模量、極限應(yīng)力均出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，極限應(yīng)變、蠕變率出現(xiàn)降低，說(shuō)明交聯(lián)后鞏膜不易發(fā)生變形擴(kuò)張[16]。HOANG等[17]也通過(guò)熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，京尼平交聯(lián)活體兔眼鞏膜后會(huì)提高其收縮溫度，闡明了后Tenon's囊下注射京尼平可以提高鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度，有效阻止近視的發(fā)生發(fā)展。

總之，對(duì)形覺(jué)剝奪性近視模型兔眼后Tenon's囊下注射京尼平進(jìn)行鞏膜膠原交聯(lián)能提高鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度，有效阻止動(dòng)物模型近視眼發(fā)展；有良好安全性，不會(huì)損傷視網(wǎng)膜視細(xì)胞功能，對(duì)鞏膜、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)及眼外肌細(xì)胞不會(huì)構(gòu)成形態(tài)學(xué)損傷。