郭雁君,吉前華*,蔣惠,郭麗英,楊鳳梅,胡益波,
(1.廣東省肇慶學(xué)院果樹(shù)研究所 肇慶市 526061;2.廣東省德慶縣柑桔研究所 德慶縣 526600)
我國(guó)是世界柑橘生產(chǎn)第一大國(guó),西江流域柑橘產(chǎn)業(yè)帶是我國(guó)柑橘生產(chǎn)的重要區(qū)域,其中砂糖橘Citrus reticulate(Blanco cv.Shatangju)是其主栽品種之一,也是我國(guó)特有的地方品種,目前廣西是我國(guó)砂糖橘種植面積最大的產(chǎn)區(qū)。柑橘根線蟲(chóng)病在我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生,其中尤以柑橘半穿刺線蟲(chóng)Tylenchulus semipenetrans和柑橘根結(jié)線蟲(chóng)MeloidogyneSPP.危害最大[1-2],成為近年來(lái)制約砂糖橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)常見(jiàn)蟲(chóng)害。砂糖橘感染柑橘根線蟲(chóng)后,柑橘植株生長(zhǎng)減緩,葉片黃化,葉片翻卷,樹(shù)冠衰退,花和果實(shí)易脫落,產(chǎn)量下降,嚴(yán)重的可以導(dǎo)致植株多年不結(jié)果或死亡。其主要原因是根線蟲(chóng)侵染根系和取食,造成機(jī)械損傷,引發(fā)病原菌侵染和影響柑橘根和葉中滲透活性離子的分配[3],導(dǎo)致根的吸收能力衰退,影響根系的正常生理功能,植株對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收能力減弱,從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。柑橘根線蟲(chóng)1 a發(fā)生10個(gè)世代以上,對(duì)柑橘危害時(shí)間長(zhǎng)[4]。目前柑橘線蟲(chóng)的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治,以化學(xué)防治為主,但是這類殺線蟲(chóng)劑存在使用成本高、毒性大、污染環(huán)境等弊端,如破壞生態(tài)平衡、造成次要病害發(fā)生、藥劑殘留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性喪失等[5]。因此研究開(kāi)發(fā)新型的、既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的殺線蟲(chóng)劑十分必要。萬(wàn)壽菊Tagete srecta是菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物,種類多樣,在我國(guó)廣泛分布,其生長(zhǎng)對(duì)土壤要求不高,栽培容易,向陽(yáng)喜暖,能耐旱霜,抗性較強(qiáng),病蟲(chóng)害少,適合大面積的播種。萬(wàn)壽菊化學(xué)成分包括噻吩類、精油、色素、黃酮及苷類等,目前國(guó)內(nèi)針對(duì)萬(wàn)壽菊中葉黃素的研究報(bào)道較多,對(duì)于其他成分的研究報(bào)道較少[6-7]。噻吩類化合物是萬(wàn)壽菊的特征性次生產(chǎn)物,它有多種生物活性,其中α-三聯(lián)噻吩是最有代表性的物質(zhì)之一,含量最高。有研究表明萬(wàn)壽菊的根、莖和花的提取物對(duì)松樹(shù)線蟲(chóng)具有毒殺性,尤以根的粗提物最為顯著[8]。國(guó)內(nèi)在蘋(píng)果的生產(chǎn)上利用間種萬(wàn)壽菊預(yù)防蘋(píng)果根線蟲(chóng)病。而柑橘的生產(chǎn)上極少使用萬(wàn)壽菊作為柑橘根線蟲(chóng)病的防治方法。本文以萬(wàn)壽菊為材料,選取成熟萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根3個(gè)部位,用不同方法獲得粗提物,并試驗(yàn)毒殺砂糖橘園柑橘根線蟲(chóng)的效果,研究萬(wàn)壽菊生物活性物質(zhì)成分與柑橘根線蟲(chóng)毒殺效率的相關(guān)性,為使用萬(wàn)壽菊提取物毒殺柑橘根線蟲(chóng)和研發(fā)新型植物源毒殺柑橘根線蟲(chóng)藥劑提供理論依據(jù)。
取成熟的萬(wàn)壽菊花、莖葉、根3個(gè)部位,于烘箱中85℃烘干、粉碎,陰涼黑暗處保存?zhèn)溆谩?/p>
取砂糖橘園感病果樹(shù)根際土壤,采用改良式貝曼氏漏斗法收集柑橘根線蟲(chóng)備用[9]。
1.2.1 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根粗提物的制備
分別稱取5.0 g萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的干粉,用無(wú)菌水、無(wú)水乙醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯,于超聲波機(jī)中(功率900 W,頻率40 kHz)提取30 min,常溫下提取3次,合并液體后進(jìn)行減壓抽濾,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓蒸發(fā)至干,得到粗提物[10],計(jì)算各粗提物的提取率。提取率=提取物干重/植物干粉重×100。
1.2.2 不同溶劑粗提物的毒殺線蟲(chóng)率測(cè)定
取適量的粗提物用無(wú)菌水溶解,稀釋成0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液,分別吸取提取物稀釋液3 mL于培養(yǎng)皿中(d=5 cm),加入20條線蟲(chóng),培養(yǎng)72 h,每隔24 h觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)死亡率。對(duì)照組為3 mL無(wú)菌水中加入20條線蟲(chóng)。
1.2.3 萬(wàn)壽菊粗提物的活性物質(zhì)測(cè)定及其對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺能力相關(guān)性分析
分別稱量100.0 g的萬(wàn)壽菊的花、莖葉、根,剪碎,放置蒸發(fā)皿中,在85℃烘箱中烘24 h至恒重,待冷卻至室溫,取出稱重并記錄。計(jì)算萬(wàn)壽菊各部位的失水率和干物質(zhì)得率。取萬(wàn)壽菊的花、莖葉、根干粉分別測(cè)定生物活性物質(zhì)含量,黃酮含量的測(cè)定采用分光光度法[11],脯氨酸含量的測(cè)定采用茚三酮顯色法[12],總糖、還原糖、多糖含量的測(cè)定采用文獻(xiàn)[13]的方法,α-三聯(lián)噻吩含量的測(cè)定采用高效液相色譜法,選用C18柱色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-水(90∶10),流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)352 nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量10 μL[14]。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析(SSR法)和相關(guān)性分析。
結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,以相同的方法、不同的溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根部的干粉進(jìn)行抽提,得率高低的趨勢(shì)在花、莖葉和根中表現(xiàn)相同,均為無(wú)菌水>無(wú)水乙醇>丙酮>乙酸乙酯>石油醚。不同溶劑提取的粗提物顏色不同,無(wú)菌水粗提物是深黃色,無(wú)水乙醇的是綠色,乙酸乙酯的是黃綠色,石油醚的是淺綠色,丙酮的是綠色,說(shuō)明各粗提物中所含的物質(zhì)存在差異。
表1 不同溶劑提取萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的粗提率(單位:%)
結(jié)果見(jiàn)圖1至圖5。由圖1可知,萬(wàn)壽菊的無(wú)菌水提取物稀釋成3個(gè)濃度,對(duì)砂糖橘園根際土壤柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果不同,線蟲(chóng)的死亡率隨提取物濃度的增加而升高,并且表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng),即柑橘根線蟲(chóng)死亡率隨著各濃度提取物處理時(shí)間的增加而升高。所有處理的線蟲(chóng)死亡率均未超過(guò)50%。相同濃度和相同處理時(shí)間下萬(wàn)壽菊根提取物的毒殺效果最高,其次是花和莖葉提取物,與對(duì)照相比,0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時(shí)對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的相對(duì)毒殺率為10%(花、莖葉)和15%(根)。
圖1 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的無(wú)菌水提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果
由圖2至圖5可知,萬(wàn)壽菊的無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺趨勢(shì)與無(wú)菌水提取物的相似,柑橘根線蟲(chóng)的死亡率隨提取物濃度和時(shí)間的增加而升高,相同濃度和相同處理時(shí)間乙酸乙酯、石油醚提取的根提取物的毒殺效果最高,其次是花和莖葉提取物。與對(duì)照相比,0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時(shí)對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的相對(duì)毒殺率表現(xiàn)為:無(wú)水乙醇提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為70%(花)、75%(莖葉)和95%(根),乙酸乙酯和石油醚提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為80%(花)、80%(莖葉)和95%(根),丙酮提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為30%(花)、30%(莖葉)和75%(根),與對(duì)照相比差異顯著。萬(wàn)壽菊不同部位的乙酸乙酯和石油醚提取物在0.01 mg/mL濃度和處理72 h條件下,柑橘根線蟲(chóng)被全部毒殺。不同提取試劑相比,乙酸乙酯提取物的柑橘線蟲(chóng)毒殺效果最高,0.000 1 mg/mL的根提取液、0.01 mg/mL的花和莖葉提取液72 h內(nèi)線蟲(chóng)死亡率達(dá)100%。0.01 mg/mL的根提取液處理24 h線蟲(chóng)死亡率達(dá)到100%。相同濃度下,乙酸乙酯提取物的殺蟲(chóng)用時(shí)更短。各提取物殺線蟲(chóng)效果:乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>無(wú)水乙醇提取物>丙酮粗提取物>無(wú)菌水提取物。
圖2 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的無(wú)水乙醇提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果
圖3 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的乙酸乙酯提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果
圖4 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的石油醚提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果
圖5 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的丙酮提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效率
結(jié)果見(jiàn)表2 至表6。從表2 可知,萬(wàn)壽菊花的失水率>莖葉的失水率>根部的失水率,即萬(wàn)壽菊的根獲得的干物質(zhì)最多,達(dá)到24.88%。由表3可知,不同部位,萬(wàn)壽菊的各種生物活性物質(zhì)含量不同,其中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量由多到少的部位依次是花>莖葉>根,且花中的含量與莖葉、根中的差異顯著,而α-三聯(lián)噻吩含量與之相反,表現(xiàn)為根>花>莖葉,且根中的含量與莖葉、花中的差異顯著。
表2 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的干物質(zhì)率
表3 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根干粉中生物活性物質(zhì)含量
由表4、表5、表6可知,α-三聯(lián)噻吩含量多少與柑橘根線蟲(chóng)死亡率之間存在顯著的正相關(guān)性(P<0.05),萬(wàn)壽菊根部的α-三聯(lián)噻吩含量最高,對(duì)應(yīng)的根提取物的柑橘根線蟲(chóng)死亡率高。而黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量與線蟲(chóng)死亡率之間成負(fù)相關(guān),但未達(dá)到顯著水平。不同的提取方法,二者之間的相關(guān)性存在差異。
表4 處理24 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)
表5 處理48 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)
表6 處理72 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)
本文探討了用成熟萬(wàn)壽菊的不同部位,在不同提取方法和不同處理時(shí)間等條件下,提取物對(duì)砂糖橘園根際土壤的柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果。
不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚的提取物得率最低,但毒殺柑橘根線蟲(chóng)的效果最高,其中尤以根部的最高。而柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊提取物中的α-三聯(lián)噻吩含量顯著正相關(guān),α-三聯(lián)噻吩屬于芳香性雜環(huán)化合物,脂溶性較強(qiáng)、水溶性較差[15],所以不同溶劑提取的α-三聯(lián)噻吩含量不同,導(dǎo)致對(duì)柑橘根線蟲(chóng)毒殺效果不同。萬(wàn)壽菊中的α-三聯(lián)噻吩具有顯著的光活化殺蟲(chóng)活性,在有光的環(huán)境會(huì)產(chǎn)生光分解[16],因此α-三聯(lián)噻吩在萬(wàn)壽菊干燥和提取的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的損耗,一方面在干燥、提取和保存過(guò)程中需要避光操作,另一方面提供了利用α-三聯(lián)噻吩毒殺柑橘根線蟲(chóng)的其他思路,比如間種萬(wàn)壽菊和利用萬(wàn)壽菊粉碎物覆蓋等方法輔助殺滅柑橘根線蟲(chóng)。
為了生產(chǎn)上應(yīng)用便利,分別提取了萬(wàn)壽菊花、莖葉和根3個(gè)部位的α-三聯(lián)噻吩,其中根的含量最多,將莖和葉合并提取,α-三聯(lián)噻吩的含量最少,不及花的。而闞春剛等[17]的研究結(jié)果顯示,萬(wàn)壽菊莖的冷浸提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量最高,其次為根,而葉和花中的含量極少。本文中測(cè)得萬(wàn)壽菊根提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量為14.96 mg/g,由此可以看出超聲波提取的方法優(yōu)于冷浸提取。試驗(yàn)證明,萬(wàn)壽菊根的粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果最高,且隨著粗提物濃度的增大,對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果也呈升高趨勢(shì),當(dāng)粗提物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL時(shí),毒殺效果可達(dá)100%。并且發(fā)現(xiàn),萬(wàn)壽菊粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
本文中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖與線蟲(chóng)的死亡率之間沒(méi)有顯著正相關(guān)關(guān)系,雖然黃酮對(duì)線蟲(chóng)具有抗氧化損傷作用,多糖中可能有損傷線蟲(chóng)的部分活性物質(zhì)存在,但相比萬(wàn)壽菊中噻吩類化合物的作用,其可能只是存在部分的輔助作用。用成熟萬(wàn)壽菊的提取物進(jìn)行小鼠急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出萬(wàn)壽菊提取物是無(wú)毒的[18],因此可作為符合現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)條例的綠色環(huán)保植物農(nóng)藥,而對(duì)于α-三聯(lián)噻吩這一成分是否就是萬(wàn)壽菊根提取物的最主要有效殺柑橘根線蟲(chóng)的成分,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
砂糖橘的生產(chǎn)可以充分利用萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)特點(diǎn)和作用,行間間種矮生萬(wàn)壽菊,既具有觀賞性,又可研究萬(wàn)壽菊根部分泌物的殺線蟲(chóng)作用;成熟后收獲全株,花中可以提取黃酮等生物活性物質(zhì),并用于醫(yī)藥、食品和美容保健等行業(yè),提供高附加值;莖和葉直接粉碎后還田,一則可以作為綠肥,二則可以輔助毒殺線蟲(chóng);根可以用于提取噻吩類化合物,制備植物源農(nóng)藥。
在萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根中,根部粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺作用最強(qiáng),不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)毒殺效果最高。隨著粗提物濃度增大,對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果也有提升趨勢(shì),當(dāng)提取物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL 時(shí),毒殺效果可達(dá)100%。粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提升。α-三聯(lián)噻吩是毒殺柑橘根線蟲(chóng)的主要有效成分之一,并在根中含量最多。黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖、多糖等生物活性物質(zhì)不是毒殺柑橘根線蟲(chóng)的主要成分。