郭雁君，吉前華*，蔣惠，郭麗英，楊鳳梅，胡益波，

（1.廣東省肇慶學(xué)院果樹(shù)研究所 肇慶市 526061；2.廣東省德慶縣柑桔研究所 德慶縣 526600）

我國(guó)是世界柑橘生產(chǎn)第一大國(guó)，西江流域柑橘產(chǎn)業(yè)帶是我國(guó)柑橘生產(chǎn)的重要區(qū)域，其中砂糖橘Citrus reticulate（Blanco cv.Shatangju）是其主栽品種之一，也是我國(guó)特有的地方品種，目前廣西是我國(guó)砂糖橘種植面積最大的產(chǎn)區(qū)。柑橘根線蟲(chóng)病在我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，其中尤以柑橘半穿刺線蟲(chóng)Tylenchulus semipenetrans和柑橘根結(jié)線蟲(chóng)MeloidogyneSPP.危害最大[1-2]，成為近年來(lái)制約砂糖橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)常見(jiàn)蟲(chóng)害。砂糖橘感染柑橘根線蟲(chóng)后，柑橘植株生長(zhǎng)減緩，葉片黃化，葉片翻卷，樹(shù)冠衰退，花和果實(shí)易脫落，產(chǎn)量下降，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致植株多年不結(jié)果或死亡。其主要原因是根線蟲(chóng)侵染根系和取食，造成機(jī)械損傷，引發(fā)病原菌侵染和影響柑橘根和葉中滲透活性離子的分配[3]，導(dǎo)致根的吸收能力衰退，影響根系的正常生理功能，植株對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收能力減弱，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。柑橘根線蟲(chóng)1 a發(fā)生10個(gè)世代以上，對(duì)柑橘危害時(shí)間長(zhǎng)[4]。目前柑橘線蟲(chóng)的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治，以化學(xué)防治為主，但是這類殺線蟲(chóng)劑存在使用成本高、毒性大、污染環(huán)境等弊端，如破壞生態(tài)平衡、造成次要病害發(fā)生、藥劑殘留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性喪失等[5]。因此研究開(kāi)發(fā)新型的、既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的殺線蟲(chóng)劑十分必要。萬(wàn)壽菊Tagete srecta是菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，種類多樣，在我國(guó)廣泛分布，其生長(zhǎng)對(duì)土壤要求不高，栽培容易，向陽(yáng)喜暖，能耐旱霜，抗性較強(qiáng)，病蟲(chóng)害少，適合大面積的播種。萬(wàn)壽菊化學(xué)成分包括噻吩類、精油、色素、黃酮及苷類等，目前國(guó)內(nèi)針對(duì)萬(wàn)壽菊中葉黃素的研究報(bào)道較多，對(duì)于其他成分的研究報(bào)道較少[6-7]。噻吩類化合物是萬(wàn)壽菊的特征性次生產(chǎn)物，它有多種生物活性，其中α-三聯(lián)噻吩是最有代表性的物質(zhì)之一，含量最高。有研究表明萬(wàn)壽菊的根、莖和花的提取物對(duì)松樹(shù)線蟲(chóng)具有毒殺性，尤以根的粗提物最為顯著[8]。國(guó)內(nèi)在蘋(píng)果的生產(chǎn)上利用間種萬(wàn)壽菊預(yù)防蘋(píng)果根線蟲(chóng)病。而柑橘的生產(chǎn)上極少使用萬(wàn)壽菊作為柑橘根線蟲(chóng)病的防治方法。本文以萬(wàn)壽菊為材料，選取成熟萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根3個(gè)部位，用不同方法獲得粗提物，并試驗(yàn)毒殺砂糖橘園柑橘根線蟲(chóng)的效果，研究萬(wàn)壽菊生物活性物質(zhì)成分與柑橘根線蟲(chóng)毒殺效率的相關(guān)性，為使用萬(wàn)壽菊提取物毒殺柑橘根線蟲(chóng)和研發(fā)新型植物源毒殺柑橘根線蟲(chóng)藥劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取成熟的萬(wàn)壽菊花、莖葉、根3個(gè)部位，于烘箱中85℃烘干、粉碎，陰涼黑暗處保存?zhèn)溆谩?/p>

取砂糖橘園感病果樹(shù)根際土壤，采用改良式貝曼氏漏斗法收集柑橘根線蟲(chóng)備用[9]。

1.2 研究方法

1.2.1 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根粗提物的制備

分別稱取5.0 g萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的干粉，用無(wú)菌水、無(wú)水乙醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯，于超聲波機(jī)中（功率900 W，頻率40 kHz）提取30 min，常溫下提取3次，合并液體后進(jìn)行減壓抽濾，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓蒸發(fā)至干，得到粗提物[10]，計(jì)算各粗提物的提取率。提取率=提取物干重/植物干粉重×100。

1.2.2 不同溶劑粗提物的毒殺線蟲(chóng)率測(cè)定

取適量的粗提物用無(wú)菌水溶解，稀釋成0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取提取物稀釋液3 mL于培養(yǎng)皿中（d=5 cm），加入20條線蟲(chóng)，培養(yǎng)72 h，每隔24 h觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)死亡率。對(duì)照組為3 mL無(wú)菌水中加入20條線蟲(chóng)。

1.2.3 萬(wàn)壽菊粗提物的活性物質(zhì)測(cè)定及其對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺能力相關(guān)性分析

分別稱量100.0 g的萬(wàn)壽菊的花、莖葉、根，剪碎，放置蒸發(fā)皿中，在85℃烘箱中烘24 h至恒重，待冷卻至室溫，取出稱重并記錄。計(jì)算萬(wàn)壽菊各部位的失水率和干物質(zhì)得率。取萬(wàn)壽菊的花、莖葉、根干粉分別測(cè)定生物活性物質(zhì)含量，黃酮含量的測(cè)定采用分光光度法[11]，脯氨酸含量的測(cè)定采用茚三酮顯色法[12]，總糖、還原糖、多糖含量的測(cè)定采用文獻(xiàn)[13]的方法，α-三聯(lián)噻吩含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，選用C18柱色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（90∶10），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)352 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析（SSR法）和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊的花、莖葉、根的提取效果

結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，以相同的方法、不同的溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根部的干粉進(jìn)行抽提，得率高低的趨勢(shì)在花、莖葉和根中表現(xiàn)相同，均為無(wú)菌水＞無(wú)水乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞石油醚。不同溶劑提取的粗提物顏色不同，無(wú)菌水粗提物是深黃色，無(wú)水乙醇的是綠色，乙酸乙酯的是黃綠色，石油醚的是淺綠色，丙酮的是綠色，說(shuō)明各粗提物中所含的物質(zhì)存在差異。

表1 不同溶劑提取萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的粗提率（單位：%）

2.2 不同溶劑提取的粗提物的毒殺線蟲(chóng)效果

結(jié)果見(jiàn)圖1至圖5。由圖1可知，萬(wàn)壽菊的無(wú)菌水提取物稀釋成3個(gè)濃度，對(duì)砂糖橘園根際土壤柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果不同，線蟲(chóng)的死亡率隨提取物濃度的增加而升高，并且表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng)，即柑橘根線蟲(chóng)死亡率隨著各濃度提取物處理時(shí)間的增加而升高。所有處理的線蟲(chóng)死亡率均未超過(guò)50%。相同濃度和相同處理時(shí)間下萬(wàn)壽菊根提取物的毒殺效果最高，其次是花和莖葉提取物，與對(duì)照相比，0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時(shí)對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的相對(duì)毒殺率為10%（花、莖葉）和15%（根）。

圖1 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的無(wú)菌水提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果

由圖2至圖5可知，萬(wàn)壽菊的無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺趨勢(shì)與無(wú)菌水提取物的相似，柑橘根線蟲(chóng)的死亡率隨提取物濃度和時(shí)間的增加而升高，相同濃度和相同處理時(shí)間乙酸乙酯、石油醚提取的根提取物的毒殺效果最高，其次是花和莖葉提取物。與對(duì)照相比，0.01 mg/mL的提取物在處理24 h時(shí)對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的相對(duì)毒殺率表現(xiàn)為：無(wú)水乙醇提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為70%（花）、75%（莖葉）和95%（根），乙酸乙酯和石油醚提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為80%（花）、80%（莖葉）和95%（根），丙酮提取物的線蟲(chóng)相對(duì)死亡率為30%（花）、30%（莖葉）和75%（根），與對(duì)照相比差異顯著。萬(wàn)壽菊不同部位的乙酸乙酯和石油醚提取物在0.01 mg/mL濃度和處理72 h條件下，柑橘根線蟲(chóng)被全部毒殺。不同提取試劑相比，乙酸乙酯提取物的柑橘線蟲(chóng)毒殺效果最高，0.000 1 mg/mL的根提取液、0.01 mg/mL的花和莖葉提取液72 h內(nèi)線蟲(chóng)死亡率達(dá)100%。0.01 mg/mL的根提取液處理24 h線蟲(chóng)死亡率達(dá)到100%。相同濃度下，乙酸乙酯提取物的殺蟲(chóng)用時(shí)更短。各提取物殺線蟲(chóng)效果：乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物＞無(wú)水乙醇提取物＞丙酮粗提取物＞無(wú)菌水提取物。

圖2 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的無(wú)水乙醇提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果

圖3 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的乙酸乙酯提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果

圖4 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的石油醚提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果

圖5 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的丙酮提取物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效率

2.3 萬(wàn)壽菊粗提物的活性物質(zhì)及其對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺能力

結(jié)果見(jiàn)表2 至表6。從表2 可知，萬(wàn)壽菊花的失水率＞莖葉的失水率＞根部的失水率，即萬(wàn)壽菊的根獲得的干物質(zhì)最多，達(dá)到24.88%。由表3可知，不同部位，萬(wàn)壽菊的各種生物活性物質(zhì)含量不同，其中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量由多到少的部位依次是花＞莖葉＞根，且花中的含量與莖葉、根中的差異顯著，而α-三聯(lián)噻吩含量與之相反，表現(xiàn)為根＞花＞莖葉，且根中的含量與莖葉、花中的差異顯著。

表2 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根的干物質(zhì)率

表3 萬(wàn)壽菊花、莖葉、根干粉中生物活性物質(zhì)含量

由表4、表5、表6可知，α-三聯(lián)噻吩含量多少與柑橘根線蟲(chóng)死亡率之間存在顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），萬(wàn)壽菊根部的α-三聯(lián)噻吩含量最高，對(duì)應(yīng)的根提取物的柑橘根線蟲(chóng)死亡率高。而黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖含量與線蟲(chóng)死亡率之間成負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平。不同的提取方法，二者之間的相關(guān)性存在差異。

表4 處理24 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

表5 處理48 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

表6 處理72 h柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊不同溶劑提取物中生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

3 討論

本文探討了用成熟萬(wàn)壽菊的不同部位，在不同提取方法和不同處理時(shí)間等條件下，提取物對(duì)砂糖橘園根際土壤的柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果。

不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚的提取物得率最低，但毒殺柑橘根線蟲(chóng)的效果最高，其中尤以根部的最高。而柑橘根線蟲(chóng)死亡率與萬(wàn)壽菊提取物中的α-三聯(lián)噻吩含量顯著正相關(guān)，α-三聯(lián)噻吩屬于芳香性雜環(huán)化合物，脂溶性較強(qiáng)、水溶性較差[15]，所以不同溶劑提取的α-三聯(lián)噻吩含量不同，導(dǎo)致對(duì)柑橘根線蟲(chóng)毒殺效果不同。萬(wàn)壽菊中的α-三聯(lián)噻吩具有顯著的光活化殺蟲(chóng)活性，在有光的環(huán)境會(huì)產(chǎn)生光分解[16]，因此α-三聯(lián)噻吩在萬(wàn)壽菊干燥和提取的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的損耗，一方面在干燥、提取和保存過(guò)程中需要避光操作，另一方面提供了利用α-三聯(lián)噻吩毒殺柑橘根線蟲(chóng)的其他思路，比如間種萬(wàn)壽菊和利用萬(wàn)壽菊粉碎物覆蓋等方法輔助殺滅柑橘根線蟲(chóng)。

為了生產(chǎn)上應(yīng)用便利，分別提取了萬(wàn)壽菊花、莖葉和根3個(gè)部位的α-三聯(lián)噻吩，其中根的含量最多，將莖和葉合并提取，α-三聯(lián)噻吩的含量最少，不及花的。而闞春剛等[17]的研究結(jié)果顯示，萬(wàn)壽菊莖的冷浸提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量最高，其次為根，而葉和花中的含量極少。本文中測(cè)得萬(wàn)壽菊根提取物中α-三聯(lián)噻吩的含量為14.96 mg/g，由此可以看出超聲波提取的方法優(yōu)于冷浸提取。試驗(yàn)證明，萬(wàn)壽菊根的粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果最高，且隨著粗提物濃度的增大，對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果也呈升高趨勢(shì)，當(dāng)粗提物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL時(shí)，毒殺效果可達(dá)100%。并且發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)壽菊粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

本文中黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖和多糖與線蟲(chóng)的死亡率之間沒(méi)有顯著正相關(guān)關(guān)系，雖然黃酮對(duì)線蟲(chóng)具有抗氧化損傷作用，多糖中可能有損傷線蟲(chóng)的部分活性物質(zhì)存在，但相比萬(wàn)壽菊中噻吩類化合物的作用，其可能只是存在部分的輔助作用。用成熟萬(wàn)壽菊的提取物進(jìn)行小鼠急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出萬(wàn)壽菊提取物是無(wú)毒的[18]，因此可作為符合現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)條例的綠色環(huán)保植物農(nóng)藥，而對(duì)于α-三聯(lián)噻吩這一成分是否就是萬(wàn)壽菊根提取物的最主要有效殺柑橘根線蟲(chóng)的成分，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

砂糖橘的生產(chǎn)可以充分利用萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)特點(diǎn)和作用，行間間種矮生萬(wàn)壽菊，既具有觀賞性，又可研究萬(wàn)壽菊根部分泌物的殺線蟲(chóng)作用；成熟后收獲全株，花中可以提取黃酮等生物活性物質(zhì)，并用于醫(yī)藥、食品和美容保健等行業(yè)，提供高附加值；莖和葉直接粉碎后還田，一則可以作為綠肥，二則可以輔助毒殺線蟲(chóng)；根可以用于提取噻吩類化合物，制備植物源農(nóng)藥。

4 小結(jié)

在萬(wàn)壽菊的花、莖葉和根中，根部粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺作用最強(qiáng)，不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)毒殺效果最高。隨著粗提物濃度增大，對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果也有提升趨勢(shì)，當(dāng)提取物稀釋液濃度達(dá)到0.01 mg/mL 時(shí)，毒殺效果可達(dá)100%。粗提物對(duì)柑橘根線蟲(chóng)的毒殺效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提升。α-三聯(lián)噻吩是毒殺柑橘根線蟲(chóng)的主要有效成分之一，并在根中含量最多。黃酮、脯氨酸、總糖、還原糖、多糖等生物活性物質(zhì)不是毒殺柑橘根線蟲(chóng)的主要成分。