王東 郜振武 楊秋薈 孫留群 楊學斌 陳晨

血脊髓屏障中的粘附連接蛋白與緊密連接蛋白能夠防止外周循環(huán)物質進入骨髓。脊髓受損后,血脊髓屏障隨之受損,使血細胞進入脊髓,產(chǎn)生炎癥反應,導致脊髓受損和神經(jīng)功能永久性損傷［1］。基質金屬蛋白酶在血脊髓屏障受損中起主導作用,而屏障損傷是造成繼發(fā)性損傷的影響因素［2］。說明維持脊髓屏障的完整及正常功能可能有助于減輕脊髓損傷和恢復神經(jīng)系統(tǒng)。間充質干細胞移植治療脊髓損傷療效確切,而外泌體是間充質干細胞旁分泌機制的重要成分［3］。臨床上將骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來源外泌體用于治療心血管等疾病,但目前在脊髓損傷方面的研究較少?；诖?本研究將構建大鼠脊髓損傷模型,移植干細胞來源外泌體,探討其通過MMP-9 表達減輕脊髓損傷的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源 BMSCs(廠家：廣州賽業(yè)生物科技有限公司)選自大鼠股骨骨髓。

1.1.2 實驗大鼠 選取60 只SD 大鼠(廠家：珠海百試通生物科技有限公司),體質量約200 g,本研究于2021 年1 月～2022 年1 月在白求恩醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室完成,本研究經(jīng)白求恩醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BMSCs 復蘇后,用10%胚胎牛血清(廠家：Ausbian；貨號：WS500T；規(guī)格：500 ml/瓶)和1%青霉素(廠家：普利萊；貨號：APC8250-5；規(guī)格：5 g)和鏈霉素DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng),1 d 后換成新鮮完全培養(yǎng)基,待細胞融合率達80%時通過0.25%胰酶消化,并以1∶4 的比例傳代。

1.2.2 提取外分泌體 從細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體,首先使用超濾離心管將胎牛血清離心55 min(3000×g),獲取去外泌體胎牛血清。當干細胞融合率約70%時,更換含10%去外泌體胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)36 h,按試劑盒說明書進行外泌體提取。

1.2.3 構建脊髓損傷模型及注射外泌體 將60 只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組及外泌體組,每組20 只。構建大鼠脊髓損傷模型(改良Allen's法),大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉,作切口后切除椎板,充分暴露T9～10段脊髓,在T10處造成重度損傷,術畢用0.9%氯化鈉沖洗,縫合傷口。持續(xù)3 d 抗生素方案,手動排空膀胱至大鼠排尿功能恢復正常。假手術組不對脊髓進行打擊,僅行T10椎板切除術。外泌體組在脊髓損傷30 min 和1 d 后進行干細胞來源外泌體尾靜脈注射(200 μl)。模型組分別于損傷后30 min、1 d 經(jīng)尾靜脈注射200 μl PBS 緩沖液。

1.2.4 運動功能評定 采用BBB 評分對大鼠運動功能進行評定,評分范圍0～21 分,0 分表示無自主運動；21 分表示正常自主運動,動作協(xié)調。大鼠于造模前及造模后第1、3、5、7、10、14、21 天在防滑、平坦的塑料板上自由移動,觀察5 min。在雙盲條件下由2 位掌握BBB 評分執(zhí)行標準的研究組員對大鼠進行運動功能評定。

1.2.5 伊文思藍染色 在大鼠脊髓損傷后第3 天,注射2%伊文思藍溶液(2 ml/kg)于大鼠尾靜脈,2 h 后麻醉大鼠(1%戊巴比妥),用0.9 氯化鈉溶液灌注至右心房流出的液體為澄清樣。將脊髓損傷節(jié)段與50%TCA溶液充分勻漿后離心10 min(10000×g),將上清液用分光光度計在發(fā)射波長620、680 nm 下檢測樣品吸光度。將樣品吸光度轉化成每克組織中所含染料微克數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測 用RIPA 裂解液將脊髓組織勻漿后于冰上裂解30 min,在4℃條件下離心10 min(12000×g),用BCA 蛋白質定量法分析上清液總蛋白含量。電泳分離樣品,將蛋白轉移至PVDF 膜上,室溫密封1 h,再將claudin-5、Occludin、ZO-1、MMP-9 一抗加入在4℃下過夜,加入HRP 標記的二抗室溫孵育1 h。以β-actin 為內參,獲取條帶灰度值,蛋白水平的表達形式為目的條帶灰度值/β-actin 帶灰度值。

1.2.7 明膠酶譜法 采用明膠酶譜法檢測MMP-9 活性,取損傷脊髓節(jié)段,在裂解緩沖液中勻漿,離心后分析上清液蛋白含量,加入緩沖液混勻,待蛋白量上樣后洗脫變性,漂洗40 min,放入孵育液37℃48 h,染色2 h,再用脫色液脫色至出現(xiàn)條帶,拍照記錄分析。

1.3 觀察指標 ①比較三組大鼠脊髓損傷后不同時間點的BBB 評分；②比較三組大鼠染料滲出量；③比較三組大鼠緊密連接蛋白(claudin-5、ZO-1、Occludin)表達水平；④比較三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達水平及活性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用F檢驗,兩組比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠脊髓損傷后不同時間點的BBB 評分比較 假手術組大鼠無行動障礙,BBB 評分均為21 分。外泌體組、模型組大鼠脊髓損傷后運動功能均受損,第1 天BBB 評分為0 分,兩組大鼠脊髓損傷后第3、5、7 天BBB 評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；外泌體組大鼠脊髓損傷后第10、14、21 天BBB 評分高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1,圖1。

表1 三組大鼠脊髓損傷后不同時間點的BBB 評分(±s,分)

表1 三組大鼠脊髓損傷后不同時間點的BBB 評分(±s,分)

注：與模型組比較,aP＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

圖1 三組大鼠脊髓損傷后不同時間點的BBB 評分

2.2 三組大鼠緊密連接蛋白表達水平及血脊髓屏障染料滲出量比較 三組大鼠損傷后第3 天血脊髓屏障染料滲出量及claudin-5、ZO-1、Occludin 表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。外泌體組大鼠脊髓損傷后第3 天血脊髓屏障染料滲出量少于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；外泌體組大鼠claudin-5、ZO-1 及Occludin 相對表達量高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三組大鼠緊密連接蛋白表達水平及血脊髓屏障染料滲出量比較(±s)

注：與模型組比較,aP＜0.05

2.3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達水平和活性比較 Western blot 檢測結果顯示,三組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達水平和活性比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。外泌體組大鼠脊髓組織中MMP-9 表達水平低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；外泌體組大鼠脊髓組織中MMP-9 活性低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 的表達水平和活性比較(±s)

表3 三組大鼠脊髓組織中MMP-9 的表達水平和活性比較(±s)

注：與模型組比較,aP＜0.05

3 討論

脊髓損傷除影響感覺、運動和自主神經(jīng)功能外,還會出現(xiàn)慢性疼痛、肌肉萎縮等繼發(fā)性問題。在臨床實驗中,脊髓損傷可進一步造成血管損傷、血脊髓屏障破裂?；|金屬蛋白酶、腫瘤壞死因子-α 等都參與破壞脊髓損傷后的血脊髓屏障［4］。

干細胞治療脊髓損傷有良好的治療效果。本研究結果顯示,大鼠脊髓損傷后運動功能均受損,第1、3、5、7 天,外泌體組和模型組BBB 評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；外泌體組第10、14、21 天BBB 評分高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),表明外泌體能促進運動功能恢復。BMSCs 移植可以通過髓內、鞘內、動脈內或靜脈內途徑加速脊髓損傷后神經(jīng)功能修復［5,6］。數(shù)據(jù)顯示,進入損傷部位的BMSCs 通過旁分泌機制發(fā)揮作用,并不會完全分化成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞［7］。外泌體是BMSCs 分泌的細胞外囊泡的主要成分,攜帶如miRNA 等重要活性物質［8］。

外泌體是脂質雙層膜結構,可避免其內容物被吸收或分泌,從而使它們能夠自由地從血脊髓屏障到達損傷部位。BMSCs 來源外泌體可預防神經(jīng)元凋亡、抗炎和抗瘢痕形成,并促進脊髓損傷后的功能恢復［9］。Lu 等［10］的研究表明,BMSCs 來源的外泌體可降低NF-κB p65 信號調控,限制周細胞遷移,增強周細胞覆蓋,使血脊髓屏障通透性下降。本研究結果顯示：損傷后第3 天外泌體組血脊髓屏障染料滲出量少于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；外泌體組claudin-5、ZO-1 及Occludin 相對表達量高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),進一步補充了外泌體可防止緊密連接蛋白降解降低血脊髓屏障的通透性。同時本研究Western blot 檢測結果顯示：外泌體組MMP-9 表達水平低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；外泌體組MMP-9 活性水平低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示BMSCs 來源外泌體能通過抑制MMP-9 表達減少緊密連接蛋白claudin-5、Occludin、ZO-1 的降解,從而加快血脊屏障的修復。

綜上所述,干細胞來源外泌體可通過抑制MMP-9表達和活性降低緊密連接蛋白的降解,改善血脊髓屏障的破壞,從而加速恢復大鼠脊髓損傷后運動功能。外泌體不僅能自由通過學脊髓屏障,還具有低免疫原性,在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中有較大的治療潛力,其可能成為脊髓損傷一種具有前景的治療策略。