翁一玲 李煌 卓辰茜 劉婉婷 陳松旺

腦血栓是腦梗死常見類型之一,其發(fā)病急,病情進(jìn)展迅速,致死風(fēng)險(xiǎn)較高,發(fā)病率逐年增加,并呈現(xiàn)年輕化趨勢,故臨床上需對腦血栓予以積極治療［1］。西醫(yī)多采用溶栓治療加腦神經(jīng)保護(hù),可在一定程度上緩解腦血栓癥狀。近年來,中西醫(yī)結(jié)合治療腦血栓取得了良好的進(jìn)展,中藥多選擇活血化瘀方藥［2,3］。暢脈樂膠囊是福建省第二人民醫(yī)院根據(jù)陳美華主任的多年經(jīng)驗(yàn)研制的院內(nèi)制劑,具有滋腎活血、祛風(fēng)通絡(luò)的功效。該處方由黃芪、丹參、郁金、赤芍、葛根等多味中藥組成,方中黃芪補(bǔ)中益氣,丹參通利血脈,赤芍涼血散瘀,郁金、葛根有助于在活血祛瘀通絡(luò)的同時(shí)不傷正氣。全方兼?zhèn)涔パa(bǔ),共同發(fā)揮活血益氣功效。目前,暢脈樂膠囊在臨床上常用于防治中老年血管硬化或腦卒中后遺癥［4,5］。在中藥的質(zhì)量控制方面,目前研究主要集中于某一種或幾種標(biāo)記化合物的定量分析。中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)已被廣泛認(rèn)識,但是,從數(shù)以萬計(jì)成分的復(fù)雜中藥體系中獲取有用的化學(xué)信息一直是研究人員面臨的挑戰(zhàn)。UPLC-QE-MS 具有高分辨率和靈敏度,已成功用于復(fù)雜樣品的分析,以此可以作為一種快速、全面地識別中藥化學(xué)成分的策略［6］。近年來,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種高通量篩選,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)可視化及網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù),已經(jīng)廣泛用以揭示藥物、靶點(diǎn)、疾病間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,從多維度理解藥物的作用機(jī)制,這為中藥研究中的多成分多靶點(diǎn)作用機(jī)制研究提供新的研究思路［7］。本研究采用UPLCQE-MS 技術(shù)對暢脈樂膠囊化學(xué)成分快速分析,并進(jìn)行其抗腦血栓的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,旨在為院內(nèi)制劑質(zhì)量評價(jià)和闡明其藥效作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 Vanquish 型超高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120 型高分辨質(zhì)譜(購自美國賽默飛世爾科技公司)；BSA124S-CW 型天平(德國賽多利斯公司)；JXFSTPRP-24 型研磨儀(上海凈信科技有限公司)；明澈 D24 UV 性純水儀(默克密理博公司)；YM-080S 型超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)；色譜柱(100×2.1 mm,1.7 μmWaters ACQUITY UPLC BEH C18)。

1.2 試劑 暢脈樂膠囊(規(guī)格：0.5 g/粒,批號：20211224,由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供)；甲醇、乙腈(色譜純,均購自CNW Technologies)；甲酸(色譜純,購自美國SIGMA 公司)；L-2-氯苯丙氨酸(純度≥98%,購自上海恒柏生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 暢脈樂膠囊化學(xué)成分定性分析

1.3.1.1 色譜條件與質(zhì)譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～3.5 min,5%～15% B；3.5～6.5 min,15%～30% B；6.5～12.5 min,30%～70% B；12.5～25.0 min,70%～100% B；25～30 min,100%～5% B),體積流量400 μl/min;柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量5 μl；進(jìn)樣室溫度4℃。

Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur,Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScanddMS2 功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。具體參數(shù)：鞘層氣體流速30 Arb；輔助氣體流速10 Arb；離子傳輸管溫度 350℃；蒸發(fā)器溫度350℃；全ms 分辨率 60000；ms/ms 分辨率15000；NCE 模式碰撞能量：16/38/42；噴射電壓：5.5 kV(正)或-4 kV(負(fù))。

1.3.1.2 暢脈樂膠囊的前處理 稱取100 mg 的暢脈樂膠囊內(nèi)容物,加入500 μl 提取液(甲醇∶水=4∶1,內(nèi)標(biāo)濃度為10 μg/ml)；渦旋30 s,45 Hz 勻漿4 min,冰水浴超聲1 h；-40 ℃靜置1 h 后將樣本4 ℃,12000 rpm［離心力13800(×g),半徑8.6 cm］離心 15 min；小心取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾；轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,用于UPLC-QE-MS 分析。

1.3.1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML 格式后,使用XCMS 軟件將質(zhì)譜原始導(dǎo)入,進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作,利用自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配對含有MSMS 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

1.3.2 暢脈樂膠囊網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.2.1 暢脈樂膠囊有效成分代謝靶點(diǎn)的獲取 通過檢索 TCMSP 數(shù)據(jù)庫 (http://tcmspw.com/tcmsp.php)得到暢脈樂膠囊組方中葛根、丹參、郁金、赤芍和黃芪的所有活性成分,將口服生物利用度(OB) 設(shè)為＞30%,類藥性(DL)設(shè)為＞0.18 篩選及統(tǒng)計(jì)出暢脈樂膠囊的有效成分。同時(shí)篩選出有效靶點(diǎn),導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3.2.2 腦血栓治療靶點(diǎn)的獲取 運(yùn)用 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“Cerebral Thrombosis”為主題詞進(jìn)行相關(guān)檢索,查得腦血栓治療靶點(diǎn),將結(jié)果導(dǎo)入EXCEL 表格中分析處理,并建立數(shù)據(jù)集。

1.3.2.3 成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立 為了更明確、清晰地闡述暢脈樂膠囊抗腦血栓的作用機(jī)制,利用在線韋恩圖Venny2.1 繪制韋恩圖Venn Diagram,得到交集靶點(diǎn)。整理后的藥物有效成分與靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中,獲得成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2.4 靶點(diǎn)GO 功能分析以及KEGG 通路富集分析將上述已獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)化為基因ID,運(yùn)用GO (http://www.geneontology.org/) 進(jìn)行功能注釋以及富集分析,同時(shí)對相關(guān)靶點(diǎn)利用KEGG 網(wǎng)站搜索數(shù)據(jù)庫提供的繪圖模塊進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白渲染。

1.3.2.5 靶點(diǎn)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 把上述獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作圖。加入代謝物與靶點(diǎn)蛋白節(jié)點(diǎn)關(guān)系、靶點(diǎn)蛋白與通路節(jié)點(diǎn)關(guān)系,進(jìn)一步闡述暢脈樂膠囊抗腦血栓的代謝物-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析。

2 結(jié)果

2.1 暢脈樂膠囊化學(xué)成分定性分析結(jié)果 研究結(jié)果表明：在Composite Score ＞0.99 的情況下,暢脈樂膠囊的正離子模式共鑒定成分79 個(gè),負(fù)離子模式共鑒定成分47 個(gè)。見圖1。正負(fù)離子模式下暢脈樂膠囊鑒定出的化學(xué)成分可分為20 種類型,分別是氨基酸衍生物、苯及取代衍生物、脂肪酸類、脂肪酰類、黃酮類、寡糖類、酚類、糖類多酮類、苯丙素類、萜類、生物堿、酰胺類、香豆素及其衍生物類、二萜類、神經(jīng)遞質(zhì)類、有機(jī)酸及其衍生物、酚醚類、有機(jī)羥基化合物、異戊烯醇脂類及其他類。

圖1 暢脈樂膠囊UPLC-QE-MS 檢測正(A)、負(fù)離子(B)模式TIC 圖

2.2 暢脈樂膠囊有效成分作用靶點(diǎn)及有效成分-疾病-作用靶點(diǎn)篩選 經(jīng)過檢索,得到暢脈樂膠囊復(fù)方中的有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)577 個(gè),在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中查得腦血栓形成靶點(diǎn)共2284 個(gè)。將有效成分靶點(diǎn)與腦血栓形成靶點(diǎn)取交集,共得到267 個(gè)交集靶點(diǎn),見圖2。具體靶點(diǎn)見表1。

表1 藥物-疾病有效交集靶點(diǎn)

圖2 有效成分靶點(diǎn)-藥物靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 GO 功能分析以及KEGG 分析結(jié)果 將上述過程中獲得的相應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集性分析,得到生物過程(BP)3316 個(gè)、細(xì)胞組分(CC)163 個(gè)、分子功能(MF)434 個(gè)條目,包括蛋白質(zhì)自磷酸化、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對異種刺激的反應(yīng)等生物過程起作用。GO 分析各分類排名前五結(jié)果見表2。KEGG 通路富集分析得到194 條相關(guān)通路,其中富集程度顯著的有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、鈣信號通路、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)及HIF 信號通路等。KEGG 通路富集分析靶點(diǎn)蛋白個(gè)數(shù)排名前五結(jié)果見表3。

表2 GO 分析暢脈樂膠囊抗腦血栓關(guān)鍵靶點(diǎn)各分類排名前五結(jié)果

表3 KEGG 代謝通路富集分析暢脈樂膠囊靶點(diǎn)蛋白個(gè)數(shù)排名前五結(jié)果

2.4 靶點(diǎn)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫,輸入藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集中相交的267 個(gè)有效靶點(diǎn),手動(dòng)設(shè)定物種為“Homo sapiens”。利用靶點(diǎn)蛋白之間相互關(guān)系構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白可視化互作網(wǎng)絡(luò)。鏈接節(jié)點(diǎn)最多的20 個(gè)靶點(diǎn)基因見圖3,這些靶點(diǎn)可能是暢脈樂膠囊作用于腦卒中的核心靶點(diǎn)。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中 20 個(gè)核心基因

3 討論

腦血栓作為一種常見的心腦血管疾病,多因大腦供血不足,導(dǎo)致血液粘度升高,凝血因子聚集形成血栓堵塞血管,引起側(cè)支循環(huán)不暢,進(jìn)而造成神經(jīng)功能損傷。而暢脈樂膠囊能夠調(diào)節(jié)血管舒張功能,從而修復(fù)血管內(nèi)皮損傷,對腦血栓具有治療作用。

本研究利用UPLC-QE-MS 技術(shù)對暢脈樂膠囊化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,得到20 種化學(xué)成分,包括黃酮類、萜類、苯丙素類等。黃酮類化合物主要通過抗炎抗氧化,抑制血小板活化和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),改善血腦屏障通透性和血液流變學(xué),對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［8］。暢脈樂膠囊處方中君藥黃芪的主要活性成分槲皮素、山萘酚為黃酮類靶點(diǎn)較多的有效成分,黃芪甲苷為萜類靶點(diǎn)較多的有效成分,主要通過減少腦部缺血組織細(xì)胞的凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血小板活性等減輕神經(jīng)功能的損傷［9］。萜類靶點(diǎn)較多的成分還有芍藥苷、大豆皂苷等。芍藥苷可顯著降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評分,改善神經(jīng)功能損傷［10］。丹參的有效成分較多,如苯丙素類的丹酚酸、丹參素,二萜類的丹參酮等,通過抑制炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［11,12］。

本研究通過構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)、韋恩圖以及PPI 網(wǎng)絡(luò)圖得到暢脈樂膠囊抗腦血栓形成的交集靶點(diǎn)267 個(gè),TP53、AKT1、TNF、IL-6 等可能為核心靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),TP53 是程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)和基因組穩(wěn)定血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制及其他功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［13］。AKT1 調(diào)節(jié)幾個(gè)關(guān)鍵的內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞功能,包括細(xì)胞生長、遷移、存活和血管張力,AKT1 的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化和閉塞性冠狀動(dòng)脈疾?。?4,15］。TNF-α 是常見的炎癥因子之一,炎癥反應(yīng)會(huì)提高血腦屏障的通透性,使大量炎性因子如白細(xì)胞介素IL-6、IL-1β 等進(jìn)入腦內(nèi),最終導(dǎo)致腦組織損傷。這幾個(gè)核心靶點(diǎn)與細(xì)胞凋亡信號通路、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等相關(guān),暢脈樂膠囊的活性成分槲皮素、山奈酸、丹參酮、木犀草素、芍藥苷等明顯降低大鼠腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β 含量,抑制炎癥反應(yīng)［16,17］,體現(xiàn)了暢脈樂膠囊多靶點(diǎn)抗腦血栓,同一靶點(diǎn)又受多個(gè)化合物調(diào)控的作用特點(diǎn)。

通過對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析可知,暢脈樂膠囊主要作用于Wnt 通路、PI3KAkt 通路、MAPK 通路及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等信號通路,通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能,抑制炎癥反應(yīng),促使神經(jīng)功能恢復(fù)。Wnt 通路是目前研究最為廣泛且較成熟的一條信號通路,在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等階段均有重要的作用。黃芪甲苷可通過Wnt/β-catenin 通路、Akt-mTOR 通路改善大鼠腦缺血再灌注損傷［18,19］。木犀草素、丹參酮Ⅱ等通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路,干預(yù)缺血性腦卒中,發(fā)揮抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等作用［20］。謝勝偉等［5］的研究結(jié)果顯示暢脈樂膠囊可抑制Wnt 通路中關(guān)鍵激酶的活性,降低內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1 的表達(dá),改善動(dòng)脈粥樣硬化程度。上述已有研究與本研究結(jié)果一致,體現(xiàn)了暢脈樂膠囊可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮對腦卒中后損傷的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、神經(jīng)血管保護(hù)的調(diào)控作用。

綜上所述,本研究采用UPLC-QE-MS 技術(shù)定性了暢脈樂膠囊中的主要化學(xué)成分,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索了暢脈樂膠囊抗腦血栓的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)的“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)相吻合,符合中醫(yī)藥對疾病本質(zhì)的認(rèn)識,為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)之間的相互關(guān)系搭建了橋梁。