潘偉雄，陳鈺怡，趙锃玨，馮賽祥，仇微紅，葉賀佳，張玲華*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室， 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642；3.廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司， 廣州 511300)

CpG序列是一條含有未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的微生物單鏈DNA片段,能夠通過Toll樣受體9(TLR 9)的識別刺激先天性免疫反應[1]。CpG ODN是人工合成的CpG序列(synthetic oligodeoxynucleotide containing CpG motifs，簡稱CpG ODN)，目前，在臨床和疫苗應用中作為免疫增強劑[2-3]。前期，作者實驗室在雞、魚和豬上對CpG ODN和CpG質(zhì)粒進行了大量研究,有如下發(fā)現(xiàn)：CpG ODN能提升雞特異性免疫[4]；CpG ODN常溫和低溫下均能保護魚類免受細菌感染[5]；CpG質(zhì)粒也與ODN有同樣提升動物體抗感染的先天性和適應性免疫[6]。近來，三葉草生物公司研發(fā)的CpG聯(lián)合鋁佐劑的新冠疫苗的Ⅰ期臨床試驗報告顯示，該疫苗可引發(fā)針對 SARS-CoV-2 的強大體液和細胞免疫反應[7]。以上研究證實了CpG制劑能激發(fā)機體產(chǎn)生顯著的免疫反應，而長期廣泛的應用印證了CpG ODN具有極高的安全性。然而，CpG ODN作為禽用疫苗佐劑的生產(chǎn)成本高昂，即使采用更為廉價CpG質(zhì)粒，大規(guī)模生產(chǎn)中依舊無法負擔，這嚴重阻礙了CpG制劑在畜牧養(yǎng)殖中的推廣應用。有研究表明，CpG制劑聯(lián)合其他免疫刺激物可以提升其作用效果[8]，因而，在本研究中，作者希望尋求生產(chǎn)成本低的生物制劑與CpG制劑協(xié)同，在實現(xiàn)良好的免疫刺激效應的同時，減少CpG制劑的使用量，最終使成本可控。

赤紅球菌(Rhodococcusruber)是一類專性好氧革蘭陽性菌，能被負責識別細菌的TLR2來刺激機體免疫[8]。早在1984年，珊瑚紅球菌(Phodococcuscorrallina,RC)的細胞壁成分就被報道在動物體內(nèi)具有抗腫瘤的免疫特性[9]。此外，還有研究顯示，赤紅球菌提取物能夠抵抗細菌和抗病毒感染，從而達到提高機體免疫的作用[10]。同時，相較于通過細菌單一成分給藥引發(fā)的應答，通過完整菌體細胞的給藥具有增強Th1(T helper)應答而不改變Th2引起的細胞免疫應答的優(yōu)點，其調(diào)節(jié)作用還可以長期持續(xù)[11]。而且，經(jīng)動物試驗證實，赤紅球菌作為免疫佐劑使用具有非特異性地增強體液免疫和細胞免疫應答，提高抗體峰值水平，延長抗體維持期，增強動物疫苗的免疫效果[12-13]。除了以上有關赤紅球菌良好的免疫刺激功效的報道之外，作者還考慮到赤紅球菌的生長速度快、易培養(yǎng)，產(chǎn)業(yè)化成本低，在生產(chǎn)上具有極大的優(yōu)勢。另外，研究指出，TLR2和TLR9能協(xié)同刺激免疫反應[14-16]，同時，哺乳動物TLR9/禽類動物TLR21存在著同源關系和功能相似性[17-18]，推斷赤紅球菌可以作為CpG制劑的聯(lián)合制劑使用來提升禽類疫苗的功效。

禽流感是由禽流感病毒 (avian influenza virus，AIV)引起的一種急性、高度接觸性的人獸共患傳染病[19]，如果在養(yǎng)殖早期不能對其進行有效控制，將會在禽群中迅速傳播和繁殖，造成經(jīng)濟巨大損失和危害公共衛(wèi)生安全。禽流感疫苗對于我國禽流感的防控起著至關重要的作用。目前，在疫苗中常使用的佐劑有鋁佐劑、油乳佐劑、脂質(zhì)體佐劑、微生物類佐劑等，它們各有利弊，主要存在著免疫類型單一、抗體的產(chǎn)生時間長和持續(xù)時間短、品種間和佐劑間效果不確切等問題[20]。近年來，免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑(CpG ODN)，因其具有的免疫調(diào)節(jié)作用以及顯著的安全性[21]，日益受到人們的重視。隨著社會發(fā)展，禽類養(yǎng)殖場不斷規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化，成本低、免疫效力高、持久性良好是禽流感疫苗佐劑的發(fā)展趨勢。因此，在本研究中首次將CpG ODN 和赤紅球菌聯(lián)合使用作為禽流感疫苗的佐劑，希望在進一步強化禽流感疫苗的免疫應答效果的基礎上，既提高疫苗免疫持久性、安全性，又降低CpG ODN的使用成本。本研究檢測了赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑對于提升禽流感疫苗的抗原特異性體液免疫和細胞免疫水平的能力，并通過檢測細胞表面受體的表達情況來探索其提升免疫功效的機制。此外，還研究了該復合佐劑對于系統(tǒng)和局部免疫的效果。本研究確認赤紅球菌的共刺激能在降低CpG ODN用量的同時，進一步強化CpG ODN的免疫增強功效。本研究為CpG制劑作為禽類疫苗佐劑提供高效且成本可控的應用策略奠定了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗雞 1日齡普通黃羽肉雞，購自廣州華農(nóng)正大禽業(yè)有限公司，于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心養(yǎng)至10日齡，使試驗雞適應該養(yǎng)殖環(huán)境。

1.1.2 試驗抗原 H5N2亞型重組禽流感病毒rSD57株抗原由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司制備及提供，血凝效價大于28。

1.1.3 試驗佐劑 CpG ODN，實驗室保存[22]；赤紅球菌(Rhodococcusruber)，菌株由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院廖明教授提供，并按相關專利的方式制備[23]。

1.2 疫苗制備與分組情況

1.2.1 試驗一 取10日齡普通黃羽肉雞100只，隨機分成5組，每組20只，分別經(jīng)頸部皮下注射以下免疫佐劑—疫苗組合，0.33 mL·只-1。每組處理3次重復，所有試驗雞只免疫1次。

表1 免疫佐劑—疫苗分組情況

在接種后第7、14、21、28、35日，分別從雞群中隨機抽取5只進行頸部采血檢測抗體滴度；接種后第0、7、14、21日，每組隨機選3只雞，宰殺取脾和支氣管。第0、7、14、21日所取的各組部分脾樣品用于細胞增殖試驗測淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)和檢測特異性免疫產(chǎn)生的細胞因子IFN-γ和IL-4的相對表達量；第0、7日所取的另一部分脾樣品快速冷凍于液氮中，在-80 ℃保存至分離RNA，檢測IL-12、IFN-γ、TLR2和TLR21的相對表達量。第0、7日所取的支氣管樣品也快速冷凍于液氮后在-80 ℃保存至分離RNA，檢測IL-12和IFN-γ的相對表達量。每組處理3次重復。

1.2.2 試驗二 取10日齡普通黃羽肉雞20只，隨機分成4組，每組5只，分別經(jīng)頸部皮下注射相應的疫苗，0.33 mL·只-1。每組處理3次重復，所有試驗雞只免疫1次。4組所注射的免疫佐劑—疫苗組合分別是PBS組、對照組、CpG+赤紅球菌疫苗組和0.5CpG+赤紅球菌疫苗組。前三組的制備方法與試驗一中的相同；50%CpG+赤紅球菌疫苗組疫苗制備方法：取3 mL rSD57抗原、0.75 mL無菌水和0.75 mLCpG ODN(60 μg·mL-1)，再與10.5 mL礦物油ISA71混合，赤紅球菌按0.5 mg·mL-1水相進行添加(約2.25 mg)，用高剪切乳化機乳化10 min。在疫苗接種后第14、35天，各組分別采血測抗體滴度(HI)。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗體滴度 進行HI試驗。

試驗一，各組接種后第7、14、21、28、35天，分別采血分離血清。制備1%雞紅細胞懸液，用H5N2亞型重組禽流感病毒rSD57株血凝抑制抗原制備4單位抗原(HAU)；在96孔板的1～11孔中加入25 μL PBS，第12孔中加入50 μL PBS；吸取25 μL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25 μL于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去；1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25 μL，靜置30 min；每孔加入25 μL 1 %雞紅細胞懸液，混勻并封板，靜置30 min(可適當延長)，直至對照組(第11孔)紅細胞呈明顯的紐扣狀沉于孔底，每組至少設3個重復。結果以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，用2的指數(shù)表示[24]。每組處理3次重復。

試驗二，各組接種后第14、35天，分別采血分離血清。按上述方法檢測抗體滴度。每組處理3次重復。

1.3.2 細胞增殖和特異性IFN-γ和IL-4誘生試驗 取試驗一疫苗接種后第0、7、14、21天各組的脾臟樣品，制備單細胞懸液，利用淋巴細胞分離液(翌圣，廣州)分離脾淋巴細胞，用不含酚紅指示劑，含10%胎牛血清(Gbico，美國)、0.15%碳酸氫鈉和1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gbico，美國)調(diào)節(jié)細胞懸液達2.5 × 106個細胞·mL-1，細胞懸液以100 μL·孔-1加入96孔細胞培養(yǎng)板中，加入PBS作為陰性對照?？乖越K濃度10 μg·mL-1加入，每組重復3次，在37 ℃、5%CO2孵育24 h。其中，一半的細胞進行細胞增殖試驗，另一半細胞保留作為后續(xù)試驗的材料。每孔加入20 μL MTT(5 mg·mL-1，華奇盛，廣州)，在37 ℃、5%CO2二次孵育6 h。離心機離心除去未反應的MTT,然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩5 min，使結晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm讀取吸光值。淋巴細胞增殖以刺激指數(shù)(SI)表示，SI定義：試驗孔的平均OD值/陰性對照孔的平均OD值[22]。每組處理3次重復。

1.3.3 熒光定量PCR 把按上述細胞增殖試驗操作培養(yǎng)好的細胞懸液(未加MTT和DMSO)和-80 ℃冷凍保存的脾和支氣管樣品提取RNA，然后經(jīng)反轉錄為cDNA，按試劑盒說明書操作(RNA提取試劑盒，翌圣，廣州；cDNA反轉錄試劑盒，碧云天，上海)；利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫,使用β-actin對每個靶基因(引物見表2)的值進行歸一化處理。使用2-ΔΔCt方法計算表達值[25]。

表2 本研究中熒光定量PCR中使用到的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑提升系統(tǒng)免疫應答

2.1.1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升抗原特異性體液免疫應答 為了直觀地了解不同免疫佐劑——疫苗組合的免疫效力，試驗一注射疫苗后第7、14、21、28、35天，對各組分別采血進行HI試驗。試驗結果顯示(圖1)，與對照組相比，自第14天起，各佐劑的抗體滴度都有明顯的上升趨勢，而赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的效果最顯著；在第35天，與對照組和CpG佐劑疫苗組相比，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的抗體滴度都有高度顯著性差異(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)都表明，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN介導了更強的特異性體液免疫應答且抗體持續(xù)時間長。

組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01*. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升疫苗誘導的抗體滴度水平Fig.1 Rhodococcus combined with CpG ODN enhances vaccine-induced antibody titers

2.1.2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升抗原特異性細胞免疫應答 研究指出，禽流感疫苗單獨使用產(chǎn)生的特異性細胞免疫水平不高，需要輔助遞送物質(zhì)或佐劑來誘生良好的細胞免疫，進而提升疫苗免疫效果[29]。因而，既能夠誘導體液免疫又能夠誘導細胞免疫的疫苗是研究人員的普遍追求。于是，作者對接種后不同時間分離出的脾淋巴細胞進行了細胞增殖試驗檢測SI值(圖2A)，并給予二次的抗原刺激，檢測其特異性細胞免疫產(chǎn)生的IFN-γ(圖2B)和IL-4(圖2C)的相對表達量。與對照組相比，CpG+赤紅球菌佐劑疫苗組中IFN-γ在第14、21天極顯著上調(diào)(P<0.01),Th2相關細胞因子IL-4略有下降但無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SI指數(shù)的比較中，在第7、21天，CpG佐劑疫苗組和赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI值均高于對照組，且赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI峰值更高，與對照組差異更顯著；盡管第14天赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI指數(shù)較CpG佐劑疫苗組低，但就赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的整體表現(xiàn)，并綜合IFN-γ上調(diào)結果來看，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN發(fā)揮了更良好的細胞免疫刺激效果。疫苗抗原的免疫應答可分為Th1型和Th2型，IFN-γ/IL-4比值(圖2D)反映Th1型免疫的相對強度，數(shù)值升高，Th1型免疫增強。該比值結果顯示，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組在第14、21日時，IFN-γ/IL-4比值較對照組更高, 表明聯(lián)合使用赤紅球菌和CpG ODN作為疫苗佐劑可誘導更強的Th1細胞免疫反應，從而提高疫苗整體的免疫調(diào)節(jié)功能。

A.脾細胞的刺激指數(shù)(SI)；B. IL-4的相對表達量; C. IFN-γ的相對表達量；D. IFN-γ/IL-4的比值。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. Stimulation index (SI); B. The relative expression of IL-4; C. The relative expression of IFN-γ; D. The ratio of IFN-γ/IL-4. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN刺激脾細胞增殖和Th1型免疫反應Fig.2 Rhodococcus combined with CpG ODN stimulates proliferation of spleen cells and Th1-type immune response

2.2 赤紅球菌與CpG ODN的協(xié)同關系

2.2.1 赤紅球菌與CpG ODN協(xié)同上調(diào)TLR2和TLR 21的表達量 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)作為一種信號轉導型抗原識別受體，既可以參與固有免疫，又可以連通適應性免疫和固有免疫之間的關系，而且還參與抗病毒免疫反應[30]。TLR2是動物體內(nèi)識別細菌的關鍵受體，TLR21是雞體內(nèi)識別CpG ODN的受體，作者通過檢測疫苗接種后各組這兩種受體的表達量來探索赤紅球菌和CpG ODN協(xié)同的關系。結果顯示(圖3)，在第7天赤紅球菌疫苗佐劑組較對照組會上調(diào)TLR2表達量且差異極顯著(P<0.01)，而TLR21表達量無顯著差異(P>0.05)；CpG疫苗佐劑組較對照組會極顯著上調(diào)TLR21表達量(P<0.01)，而對TLR2表達量無顯著影響(P>0.05)；CpG+赤紅球菌佐劑疫苗組與對照組相比，TLR2和TLR21表達量均有明顯上調(diào)，差異極顯著(P<0.01)。由此推斷，此前得到的良好的結果，可能是由于這兩種免疫刺激物分別通過TLR2和TLR21的識別，同時來增強免疫應答的。但可以肯定的是，CpG ODN與赤紅球菌之間存在潛在的協(xié)同關系，具體機制有待進一步闡明。

A. TLR21的相對表達量；B.TLR2的相對表達量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of TLR21; B. The relative expressions of TLR2. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖3 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN通過提高TLR2和TLR21的表達形成協(xié)同F(xiàn)ig.3 Rhodococcus combined with CpG ODN forms synergy by increasing the expression of TLR2 and TLR21

2.2.2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN強化局部免疫 動物體的黏膜是接觸到病原體的第一道防線，提升疫苗的局部免疫反應能力是一個重要的優(yōu)化免疫策略[31]。支氣管是動物體的重要黏膜之一，是面對禽流感病毒的“前沿”部位[32]，作者選擇雞的支氣管檢測其Th1型相關細胞因子的相對表達量，檢驗該復合佐劑的局部免疫刺激效果。如圖4結果顯示，CpG+赤紅球菌疫苗組的IL-12和IFN-γ的相對表達量有高度顯著差異(P<0.01vs. vaccine control)，也優(yōu)于單獨的CpG ODN佐劑組。這些結果表明，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN能夠強化動物體局部產(chǎn)生的Th1型免疫反應，在“第一道防線”就發(fā)揮抗病毒功能。

A.IL-12的相對表達量；B.IFN-γ的相對表達量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of IFN-γ; B. The relative expressions of IL-12. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖4 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑刺激局部免疫反應Fig.4 Rhodococcus combined with CpG ODN compound adjuvant stimulates local immune response

2.2.3 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN強化系統(tǒng)免疫 研究指出，局部免疫反應的發(fā)生依賴于系統(tǒng)免疫的協(xié)助和維持[33]，脾中免疫細胞接受抗原刺激之后可以參與到局部免疫的抗外源物質(zhì)的反應之中[34]。因此，檢測了第0、7天所取脾中細胞的IFN-γ和IL-12的相對表達水平，來檢驗赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN聯(lián)合佐劑刺激系統(tǒng)免疫的效果。從試驗結果來看(圖5)，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的IFN-γ和IL-12表達量在第7天大幅上調(diào)，與對照組和CpG疫苗相比差異極顯著(P<0.01)，表明了該復合佐劑能誘導系統(tǒng)免疫，并產(chǎn)生與局部相同的Th1型免疫反應，更有利于病毒清除。

A.IL-12的相對表達量；B. IFN-γ的相對表達量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of IL-12; B. The relative expressions of IFN-γ. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖5 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑刺激全身免疫反應Fig.5 Rhodococcus combined with CpG ODN compound adjuvant stimulates systematic immune response

2.3 赤紅球菌聯(lián)合半劑量CpG ODN的免疫佐劑效果

CpG ODN的安全性是公認的，但是作為動物疫苗來說價格高、成本貴，而赤紅球菌價格低廉、易于培養(yǎng)，同時，從上面的數(shù)據(jù)結果可以得知，赤紅球菌和CpG ODN之間存在協(xié)同機制，能夠提高疫苗的免疫效力和免疫持久性。作者想知道能否通過赤紅球菌來彌補降低CpG ODN用量帶來的免疫效果損失，在保證免疫效果的同時又降低成本。因此，在試驗二中設計了50%劑量的CpG+赤紅球菌佐劑疫苗試驗組，通過檢測各組在第14、35天的抗體滴度來檢驗疫苗的免疫效果。結果顯示(圖6)，全劑量和半劑量的CpG ODN分別與等量的赤紅球菌聯(lián)合作為疫苗佐劑，在第14、35天的抗體滴度并無顯著差異(P>0.05)，證實了此前的猜想。

3 討 論

當前，常用的禽流感疫苗存在著免疫效率低、免疫保護維持時間短、細胞免疫水平低等問題[35]，而疫苗佐劑被認為是提高疫苗免疫效率并豐富免疫類型的解決策略[36]。免疫佐劑的類型多樣、制價不盡相同，其中具備卓越安全性的免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑(CpG ODN)備受關注。降低CpG ODN作為疫苗佐劑的制備和使用成本，是使之在養(yǎng)殖業(yè)中推廣應用的關鍵。

CpG ODN在禽類動物中經(jīng)由TLR21的識別，可以誘發(fā)動物體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應[2-3,37]。它被廣泛應用于畜牧疫苗佐劑，而且用于人類疫苗的制劑也已經(jīng)問世。此外，在作者此前的研究發(fā)現(xiàn)了CpG ODN作為疫苗佐劑具有刺激特異性免疫的功效。大量的動物試驗研究表明，相較于疫苗單獨使用，添加佐劑能誘導更強的特異性細胞免疫反應，提升疫苗的免疫效力[29]。同樣的，在本研究中，通過HI試驗、細胞增殖試驗和檢測IFN-γ和IL-4的相對表達量再次確證了：CpG ODN作為禽流感疫苗的佐劑一樣有提升抗原特異性的體液和細胞免疫功效；并且在HI試驗結果中發(fā)現(xiàn)，免疫后有持續(xù)且較高的抗體滴度水平，表明CpG ODN的免疫保護持續(xù)時間長。試驗結果與預期相符，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑試驗組顯示，赤紅球菌的存在增強了這種提升功效。許多研究證實，赤紅球菌是通過TLR2的識別來刺激機體免疫的，無論是它的提取物還是全菌都具有免疫刺激作用，而全菌更有定向增強Th1型免疫應答的能力，其免疫調(diào)節(jié)持續(xù)時間長。另外，已有報道指出，TLR2與TLR21同源且功能相似的TLR9存在著協(xié)同調(diào)節(jié)免疫反應的關系。據(jù)此，作者希望通過檢測赤紅球菌和CpG ODN各自的TLR受體的相對表達水平，探究兩者的協(xié)同關系。試驗結果顯示，它們之間的協(xié)同關系可能是通過上調(diào)TLR2和TLR21的表達來實現(xiàn)的。但該協(xié)同關系還可能是通過其他多個作用累積達到的，就此需要更深入的探究。在進一步的試驗中，通過分別檢測脾細胞和支氣管細胞的IFN-γ和IL-12的相對表達量，作者發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同關系還誘發(fā)了顯著的系統(tǒng)免疫和局部免疫反應。這表明該復合佐劑滿足當前研究人員中普遍的追求，疫苗及其佐劑的開發(fā)應當同時實現(xiàn)系統(tǒng)和局部免疫[31]。通過檢測IFN-γ/IL-4的比值以及IFN-γ和IL-12的相對表達量，該復合佐劑更傾向于誘導Th1免疫應答，而研究顯示那些觸發(fā)Th1型免疫與高中和抗體誘生反應的佐劑更有可能具有保護作用，并且能夠避免免疫病理的風險[38]。因此，這些結果為進一步探究CpG ODN與赤紅球菌的協(xié)同關系提供了研究基礎。

圖6 赤紅球菌聯(lián)合低劑量CpG ODN仍具有良好的免疫效應Fig.6 Rhodococcus combined with low-dose CpG ODN still has good immune effect

在確認了赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑具有良好的免疫刺激功效之后，進一步探究了如何降低該復合佐劑的使用成本。通過設置半劑量CpG ODN+赤紅球菌的佐劑組合，作者發(fā)現(xiàn)與原劑量組合相比半劑量組合的試驗結果并未顯示出顯著差異。這表明該復合佐劑通過赤紅球菌和CpG ODN之間的協(xié)同關系彌補了CpG ODN劑量降低帶來的免疫效果下降的代價，并達到與原劑量組合同等程度的免疫效果。從成本角度出發(fā)，赤紅球菌具有成本上的顯著優(yōu)勢，它可以經(jīng)由全菌給藥發(fā)揮作用，而且還可以提供長效免疫作用，另外其培養(yǎng)成本低，作用劑量少，完全符合最初選擇它作為CpG ODN輔助佐劑的目標。在使用更低劑量的CpG ODN與赤紅球菌共同發(fā)揮免疫功效這個思路上，由于試驗中只設置了半劑量組，作者認為還可以據(jù)此進一步探索最佳劑量。此外，作者前期的工作已證實制備CpG質(zhì)粒的價格要低于直接使用CpG ODN[22]，因此擬通過CpG質(zhì)粒代替ODN 進一步降低成本。

4 結 論

本研究提出了一種高效、成本可控的赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復合佐劑作為禽流感疫苗的免疫佐劑來解決該疫苗存在的免疫效率等問題。作者通過試驗確認了該復合佐劑優(yōu)良的免疫提升效果，并且從成本角度出發(fā)，探究了降低該復合佐劑使用成本的方法。如此，不僅可以減少抗原和CpG佐劑的用量，節(jié)約成本，而且對于養(yǎng)殖周期40 d左右的肉雞來說，疫苗免疫效力持久性的提高還能減少養(yǎng)殖期間疫苗的注射次數(shù)，更進一步地降低成本。本研究為高效、低成本地應用CpG制劑作為禽類疫苗佐劑奠定了研究基礎。本研究還先行探索了赤紅球菌與CpG ODN的協(xié)同關系，為后續(xù)采用CpG質(zhì)粒來進一步控制制備和使用成本規(guī)劃了方向。