許明偉 孫曉松 石洪波 曾東揚(yáng)

腎缺血-再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury, RIRI)是泌尿外科圍手術(shù)期致腎損傷的常見病因。RIRI表現(xiàn)為腎臟血流量急驟減少或中斷，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率急劇下降，繼發(fā)氧化應(yīng)激損傷；再灌注這一病理生理過程中陸續(xù)激活的炎癥因子可進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟各級(jí)血管對(duì)擴(kuò)張血管藥物的敏感性下降，從而加重氧化應(yīng)激所致?lián)p傷[1-2]。雖然圍繞RIRI的發(fā)病機(jī)制已有系列基礎(chǔ)研究及針對(duì)性的處理策略，但RIRI的預(yù)后仍然未見顯著改善，其腎功能受損率及死亡率不容忽視。

在此背景之下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植治療成為了RIRI治療的研究熱點(diǎn)[2-4]。BMSCs來源于骨髓細(xì)胞間質(zhì)，具有多向分化的潛能，可接受外源性基因并可穩(wěn)定性表達(dá)相應(yīng)的基因產(chǎn)物，現(xiàn)已被逐步應(yīng)用于組織工程、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞替代治療方面。但如何通過改進(jìn)BMSCs的相關(guān)特性諸如靶向穩(wěn)定性、旁分泌能力，以期進(jìn)一步增強(qiáng)BMSCs治療RIRI的效果，已成為泌尿外科領(lǐng)域急需解決的問題[3,5]。

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是內(nèi)源性的非編碼RNA，其可通過識(shí)別并結(jié)合在它們目的基因3′-末端未翻譯區(qū)(3′-untranslated regions, 3′-UTR)的互補(bǔ)序列而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制該基因的表達(dá)。其中，miRNA-33a在腎臟組織中表達(dá)豐富，高度保守，廣泛參與包括氧化應(yīng)激損傷在內(nèi)的多種生物學(xué)功能過程，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等多個(gè)目的基因的表達(dá)[6-8]。由此推測(cè)，miRNA-33a能在RIRI的各項(xiàng)病理生理進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)控作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-33a在各類間充質(zhì)干細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其顯著表達(dá)于BMSCs[9]。但miRNA-33a對(duì)于BMSCs的具體影響以及對(duì)于RIRI的病理生理進(jìn)程是否產(chǎn)生干預(yù)作用，還不得而知。有鑒于此，本研究擬通過建立細(xì)胞及體外RIRI損傷模型，研究miRNA-33a對(duì)RIRI的干預(yù)作用，并探尋其可能機(jī)制，從而為進(jìn)一步改進(jìn)RIRI的診療提供研究思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

miRNA-33a mimic、miRNA-33a inhibitor及其陰性對(duì)照均購自武漢邁辰生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞典Roche公司。

二、制備BMSCs

實(shí)驗(yàn)使用的BMSCs取材自SPF級(jí)雄性SD大鼠的BMSCs，采用頸椎脫臼法處死大鼠，去除股骨兩端骨骺，吸取IMDM培養(yǎng)液后，從股骨一端反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打、離心、接種，當(dāng)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%～80%時(shí)，按1∶3的比例傳代至第3代供后期實(shí)驗(yàn)用。

三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

另選取SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，溫度維持在20～22 ℃。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠2只，每周換墊料、消毒籠具2次，飼養(yǎng)至體重220～250 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、飼養(yǎng)、處死均符合倫理要求。將其編號(hào)后依照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組(sham組)、RIRI組、BMSCs組、BMSCs+miRNA-33a mimic組(BMSCs+mimic組)、BMSCs+miRNA-33a inhibitor組(BMSCs+inhibitor組)，每組10只。

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照80 mg/kg、1%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，常規(guī)固定消毒，腹正中切口；sham組僅對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉、開腹、游離腎臟操作；RIRI組游離雙側(cè)腎臟后，暴露腎蒂，用微血管鉗夾閉雙側(cè)腎蒂40 min后開放，觀察到腎臟顏色由紫色轉(zhuǎn)為紅色后，逐層縫合，關(guān)閉腹腔，約1 h后經(jīng)尾靜脈注入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液0.5～1.0 ml；BMSCs組于尾靜脈注入含3代BMSCs(1×106/個(gè))的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，劑量相同，其余操作均同RIRI組；BMSCs+mimic組/BMSCs+inhibitor組分別于尾靜脈注入含有相應(yīng)BMSCs細(xì)胞的培養(yǎng)液，其余操作均同RIRI組。

于術(shù)后次日，抽取大鼠尾靜脈血，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量；使用比色法檢測(cè)細(xì)胞SOD、CAT、GPx等抗氧化酶含量，參照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

隨后以頸椎脫臼法處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出腎臟制成蠟塊，隨機(jī)采樣3個(gè)視野，分別行HE和Masson染色，倒置相差顯微鏡，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野觀察各組腎臟病理組織學(xué)的形態(tài)差異，并通過Image Pr0 Plus測(cè)量Masson染色切片的間質(zhì)膠原容積積分(collagen volumetric fraction, CVF)。另對(duì)腎組織蠟塊行增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)免疫組化染色，高倍鏡下于皮髓質(zhì)交界隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)視野，記錄陽性細(xì)胞的分化增殖情況。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，設(shè)定雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于計(jì)量資料進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用SNK法；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)(Q25，Q75)表示，兩組間及多組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性

將第3代BMSCs接種于96孔板，接種次日，細(xì)胞胞體呈圓形或類圓形，偶見少許呈條索形，貼壁尚不穩(wěn)固、細(xì)胞密度低；接種3 d后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，并逐漸向兩端延伸出短棒樣凸起；至接種6～7 d，大部分BMSCs呈梭形或多角形，細(xì)胞基本覆蓋滿板底，如圖1A、B所示。將BMSCs按照不同濃度梯度接種于7個(gè)時(shí)間點(diǎn)(7 d)，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，BMSCs生長(zhǎng)曲線呈S型，細(xì)胞接種后的前3 d為潛伏期，第4天細(xì)胞開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，第7天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線如圖1C所示。

A：接種次日(×200)；B：接種第7天(×200)；C：生長(zhǎng)曲線圖1 BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性

二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建模情況

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模后，sham組及BMSCs組各有1只大鼠未能蘇醒，其余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本于2 h內(nèi)蘇醒并自如活動(dòng)；RIRI組及BMSCs+mimic組各有2只大鼠于術(shù)后2 d內(nèi)死亡，綜合后續(xù)的細(xì)胞因子檢測(cè)及形態(tài)學(xué)檢測(cè)判定，總體造模成功率為88%。

三、各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎功能及抗氧化酶指標(biāo)情況

至造模術(shù)后次日，各組腎功能及抗氧化酶含量情況見圖2。①Scr、BUN水平：相比于sham組，RIRI組的Scr、BUN顯著升高(P<0.05)；BMSCs組相比RIRI組則顯著降低(P<0.05)，但仍顯著高于sham組(P<0.05)；BMSCs經(jīng)過miRNA-33a mimics/inhibitor干預(yù)后，BMSCs+mimic組的Scr、BUN相比BMSCs組顯著升高(P<0.05)，BMSCs+inhibitor組的Scr、BUN相比BMSCs組則顯著降低(P<0.05)。②SOD、CAT、GPx含量：相比于sham組，RIRI組SOD、CAT、GPx含量顯著下降(P<0.05)；BMSCs組相比RIRI組則顯著回升(P<0.05)，且已恢復(fù)至與sham組相同的水平(P>0.05)；BMSCs經(jīng)過miRNA-33a mimics/inhibitor干預(yù)后，BMSCs+mimic組的SOD、CAT、GPx含量相比BMSCs組顯著下降(P<0.05)，BMSCs+inhibitor組的SOD、CAT、GPx含量相比BMSCs組則未見顯著差異(P>0.05)。

四、各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟病理組織學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果如圖3所示，與sham組相比，RIRI組腎組織可見明顯腎小管上皮細(xì)胞水腫、腎小管擴(kuò)張、細(xì)胞趨于扁平，周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，BMSCs組的腎小管上皮細(xì)胞水腫程度較輕，未見顯著炎癥反應(yīng)；BMSCs經(jīng)過miRNA-33a mimics/inhibitor干預(yù)后，相比BMSCs組，BMSCs+mimic組腎小管擴(kuò)張程度及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)趨勢(shì)更為明顯，BMSCs+inhibitor組的腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死程度則基本緩解。其結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)RIRI主要損傷部位為腎小管。

Masson染色結(jié)果如圖4所示，sham組腎臟間質(zhì)膠原纖維極少，RIRI組腎臟間質(zhì)則可見明顯纖維化改變及膠原沉積，BMSCs組纖維化程度略有減輕，BMSCs+mimic組的纖維化及膠原沉積程度略嚴(yán)重于BMSCs組，但BMSCs+inhibitor組相比BMSCs組則未見明顯緩解。各組間CVF差異與上述趨勢(shì)相同，相比sham組，RIRI組的CVF顯著升高(P<0.05)；經(jīng)BMSCs治療后，其CVF相比RIRI組顯著下降(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)；BMSCs+mimic組的CVF顯著高于BMSCs組(P<0.05)，BMSCs+inhibitor組的CVF與BMSCs組相比則未見顯著差異(P>0.05)。

另對(duì)腎組織蠟塊行PCNA免疫組化染色，結(jié)果如圖5所示。相比于sham組，RIRI組PCNA陽性細(xì)胞未見顯著改變(P>0.05)；而相比RIRI組及sham組，BMSCs組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)則顯著升高(P<0.05)；BMSCs+mimic組的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)相比BMSCs組顯著下降(P<0.05)，BMSCs+inhibitor組相比BMSCs組則未見顯著改變(P>0.05)。見表1。

A、B：腎功能指標(biāo)；C、D、E：抗氧化酶含量(與sham組相比 *P<0.05；與RIRI組相比 # P<0.05；與BMSCs組相比 & P<0.05)圖2 造模術(shù)后次日各組腎功能及抗氧化酶含量差異

A：sham組；B：RIRI組；C：BMSCs組；D：BMSCs+mimic組；E：BMSCs+inhibitor組圖3 各組腎臟組織HE染色(×200)

A：sham組；B：RIRI組；C：BMSCs組；D：BMSCs+mimic組；E：BMSCs+inhibitor組圖4 各組腎臟組織Masson染色(×200)

A：sham組；B：RIRI組；C：BMSCs組；D：BMSCs+mimic組；E：BMSCs+inhibitor組圖5 各組腎臟組織PCNA染色(×200)

表1 各組腎臟組織病理組織學(xué)相關(guān)參數(shù)差異

討 論

腎缺血損傷可引起腎小管擴(kuò)張、滲出及腎小管上皮細(xì)胞水腫、核濃縮壞死等系列病理變化；當(dāng)病因去除、腎臟血流恢復(fù)，由于再灌注時(shí)間不同決定了不同比例的腎小管上皮細(xì)胞增殖、修復(fù)，而另一部分腎小管上皮細(xì)胞則被破壞，基底膜斷裂，喪失完整性，進(jìn)入纖維化階段，直至發(fā)生腎功能不可逆性損傷[10]。

間充質(zhì)干細(xì)胞因其不存在類似胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)爭(zhēng)議，近年來被逐步用于各種由缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的疾病研究。許多組織中都存在間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓、骨骼、肌肉、肺、肝等組織以及臍帶血，其中以BMSCs得到廣泛研究[3]。隨著對(duì)相關(guān)干細(xì)胞研究的不斷深入，其再生修復(fù)能力為各類不可逆的缺血性損傷疾病，諸如RIRI的治療提供了新的思路和方法[11]。既往已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，全骨髓移植不能改善腎臟缺血模型的腎功能，但選擇BMSCs移植則有一定效果[12]。究其原因可能為BMSCs通過分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等外胚層細(xì)胞，通過改善局部供血，促進(jìn)組織修復(fù)，從而緩解腎臟缺血再灌注的系列病理進(jìn)程；而全骨髓細(xì)胞的BMSCs含量較少，無法緩解腎臟損傷。但對(duì)于移植BMSCs治療RIRI的病理機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)尚未完全探明。Zhang等[13]的研究顯示，BMSCs可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路增強(qiáng)抗纖維化作用，從而在RIRI過程中保護(hù)腎功能。microRNAs是一類長(zhǎng)約19～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，常通過堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因3′-UTR上種子區(qū)域完全或部分結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。近年來研究提示microRNAs在氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等進(jìn)程中發(fā)揮廣泛調(diào)控作用。其中，既往有關(guān)miRNA-33a的研究大多局限在腫瘤領(lǐng)域，但越來越多的研究提示，miRNA-33a作用較為廣泛，在正常組織細(xì)胞如心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)[6-7]。有研究顯示，miRNA-33a與心肌纖維化、血管重構(gòu)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關(guān)[8]，其在腎臟中的作用研究較少。

本研究通過誘導(dǎo)BMSCs分化為上皮細(xì)胞并轉(zhuǎn)染不同類別miRNA-33a構(gòu)建細(xì)胞學(xué)模型，夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂40 min以建立急性RIRI動(dòng)物模型。試圖探明miRNA-33a對(duì)于BMSCs分化的腎小管上皮細(xì)胞是否存在干預(yù)及表達(dá)，繼而明確能否通過干預(yù)移植的BMSCs來發(fā)揮對(duì)RIRI病理進(jìn)程的調(diào)節(jié)作用。我們將轉(zhuǎn)染miRNA-33a mimic/inhibitor的BMSCs作為干預(yù)手段，輸注至RIRI動(dòng)物模型后，在移植分化的BMSCs對(duì)于RIRI存在治療作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-33a可加快BMSCs氧化應(yīng)激進(jìn)程、損傷腎功能；通過抑制miRNA-33a含量可減緩BMSCs氧化應(yīng)激進(jìn)程，對(duì)于腎功能有一定的保護(hù)作用。

各組病理組織學(xué)結(jié)果亦提示，miRNA-33a可刺激腎小管擴(kuò)張、增加炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，加速腎臟組織纖維化及膠原沉積，抑制miRNA-33a對(duì)于腎小管上皮細(xì)胞腫脹有一定程度的緩解。而作為DNA聚合酶的輔因子，PCNA為DNA復(fù)制和合成所必需，因此PCNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于評(píng)判細(xì)胞增殖活性，繼而反映腎臟修復(fù)的情況[14]。本研究中的PCNA免疫組化染色趨勢(shì)與上述結(jié)果基本一致，予以BMSCs治療后，PCNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高；轉(zhuǎn)染miRNA-33a之后通過抑制抗氧化酶活性，激化氧化應(yīng)激損傷，降低了PCNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

綜上所述，本研究通過系列細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植分化的BMSCs，對(duì)于RIRI存在確切的修復(fù)作用，且上述修復(fù)作用受到miRNA-33a調(diào)控。若及時(shí)抑制miRNA-33a的表達(dá)，可通過降低氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，盡可能修復(fù)腎臟組織或者使腎臟修復(fù)時(shí)間提前，從而改善RIRI的預(yù)后。但miRNA-33a具體的作用靶點(diǎn)及干預(yù)信號(hào)通路尚不得而知，這也將是我們后續(xù)研究的重點(diǎn)。