劉青彥，王啟佩

（1.河南省舞鋼市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 舞鋼 462599；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)）

發(fā)展畜牧業(yè)，動物疫病防控是關(guān)鍵，而免疫接種已經(jīng)成為目前防控動物疫病的首選措施，因而免疫效果監(jiān)測就顯得尤為重要，它便于我們準(zhǔn)確了解動物疫病的發(fā)生、傳播和流行情況，掌握畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場的免疫抗體水平和動物疫病保護情況，還能幫助養(yǎng)殖場（戶）建立科學(xué)的免疫程序，考核免疫效果，評價疫苗質(zhì)量，以及幫助我們科學(xué)、公平、客觀評價動物防疫質(zhì)量，對重大動物疫情科學(xué)預(yù)警預(yù)報提供重要依據(jù)，因此，做好免疫抗體檢測對畜牧業(yè)健康快速發(fā)展有著十分重要的意義。

縣級獸醫(yī)實驗室的抗體檢測對象主要包括豬、牛、羊、雞等，豬、牛、羊的抗體檢測主要通ELISA 試驗來完成，雞的抗體檢測通過HA/HI試驗來實現(xiàn)，因HA/HI試驗的步驟較為復(fù)雜，影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多，且每份樣品就有四項（即新城疫、禽流感H5N1-11、H5N1-12、H7N9）抗體需要檢測，筆者從近20 年的檢測工作中總結(jié)出了一套使試驗結(jié)果準(zhǔn)確、快速、高效的措施，該文僅就雞的抗體檢測（HA/HI試驗）加以闡述。

1 做好試驗前的準(zhǔn)備工作

1.1 制備合格的血清

要求待檢血清清亮、無腐敗、無溶血，且編號正確，不重不漏。

1.2 準(zhǔn)備好試驗所需的試劑、器材等物品，并擺放到位

準(zhǔn)備好試驗所需試劑如：新城疫/禽流感分型標(biāo)準(zhǔn)抗原、PBS 液（筆者所在實驗室常用新開啟的生理鹽水代替）、1%紅細(xì)胞懸液等，以及加樣槽、一次性V型塑料反應(yīng)板、適宜量程的移液器及適配滴頭等物品，并將試驗所需的滴頭裝進滴頭盒備用；且將反應(yīng)板做好標(biāo)記，橫豎各標(biāo)上1.2.3.4…，將這些連同廢棄物桶、消毒藥及試驗所需防護用品如一次性手套、口罩等通通準(zhǔn)備好且擺放到位。

1.3 將待檢血清添加到血清稀釋板

將每份待檢血清（約200 ul）按編號順序依次添加到血清稀釋板上并在該板邊緣的特定位置及對應(yīng)的板蓋上做好標(biāo)記，如：一、二、三…（即第一板、第二板、第三板…）。

這一步是使試驗快速、高效的最重要的一步，這樣做可以使雞的四項抗體檢測中的每一項的HI試驗中加血清這一步都可以用八道移液器直接從相應(yīng)稀釋板的相應(yīng)列中吸取，一列的八份樣品剛好可以用八道移液器移到相對應(yīng)的反應(yīng)板上做一板，這避免了每做一項試驗均需從裝樣品的離心管中吸取樣品到反應(yīng)板中這一繁瑣步驟，這使得試驗速度大大提高。

2 準(zhǔn)確把握試驗過程的每個技術(shù)要點

2.1 配制合格的1%紅細(xì)胞懸液

此過程需要強調(diào)的是：①一定要采集至少三只未經(jīng)免疫的健康公雞的血；②采血過程一定加抗凝劑防止凝血；③洗滌紅細(xì)胞時離心機轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)定在1 000～2 000 轉(zhuǎn)/分鐘較為合適，轉(zhuǎn)速切不可設(shè)置太高，若太高，紅細(xì)胞壓得太實會影響其功能甚至導(dǎo)致紅細(xì)胞碎裂；④采集的紅細(xì)胞應(yīng)無污染，否則可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)而影響試驗結(jié)果；⑤洗滌及配制1%紅細(xì)胞一定要用生理鹽水或PBS 液，切不可錯用成純凈水或蒸餾水，否則可能因滲透壓差導(dǎo)致紅細(xì)胞崩解破壞；⑥配制1%紅細(xì)胞的PBS 液pH 值需調(diào)至7.2最合適。

2.2 做好HA試驗，準(zhǔn)確測定抗原效價

HA試驗步驟如下：①在96孔V型微量反應(yīng)板中每孔加25 ulPBS；②從第1 孔加25 ul抗原或病毒液，反復(fù)吹吸3到5次混勻；③第1孔吸取25 ul抗原或病毒液，加入第2孔，混勻后，吸取25 ul加入第3孔，進行2倍系列稀釋至第11孔，從第11孔吸取25 ul棄去，第12孔為PBS對照孔；④每孔加入25 ulPBS；⑤每孔加入25 ul1%體積分?jǐn)?shù)雞紅細(xì)胞懸液；⑥結(jié)果判定：輕扣反應(yīng)板混合物，室溫（約20℃），靜置40 min，環(huán)境溫度過高時可在4℃條件下靜置60 min，當(dāng)對照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時判定結(jié)果。判定時，將反應(yīng)板傾斜60°，觀察紅細(xì)胞有無淚珠狀流淌，完全無淚珠狀流淌（100%凝集）的最高稀釋倍數(shù)判為該抗原的血凝效價。

HA試驗要點為：①加抗原時一定要先潤濕滴頭內(nèi)壁；②抗原倍比稀釋過程中滴頭以伸入液面下2～3 mm為宜；③移液器加樣時應(yīng)垂直懸空；④加紅細(xì)胞時應(yīng)先搖勻再加；⑤在反應(yīng)板上最好做三排，然后取結(jié)果相同的那兩排效價定為抗原效價，此步驟是整個試驗的關(guān)鍵，抗原效價測定的準(zhǔn)確性直接影響所測血樣抗體效價的準(zhǔn)確性。

2.3 根據(jù)抗原效價準(zhǔn)確配制4HAU的病毒抗原

根據(jù)HA 試驗測定的效價配制4HAU 的病毒抗原。4HAU抗原應(yīng)根據(jù)檢驗結(jié)果調(diào)整準(zhǔn)確。例如，如果血凝的終點滴度為1：256，則4HAU=256/4=64（即1：64），取PBS 6.3 ml，加抗原0. 1ml，即通過1：64獲得4HAU。先計算該實驗所需4HAU 抗原的量，然后根據(jù)計算結(jié)果進行配制。為保證所配4HAU抗原的準(zhǔn)確性，通常還要進行4HAU抗原校正。

2.4 把握好HI試驗的技術(shù)要點，準(zhǔn)確測定血清抗體效價

HI試驗步驟如下：①根據(jù)HA試驗測定的抗原效價配制4 個血凝單位（即4HAU）的病毒抗原，4HAU 抗原應(yīng)根據(jù)檢驗結(jié)果調(diào)整準(zhǔn)確；②第1孔至第11孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS作為空白對照；③第1孔加入25 μL血清，第一孔血清與PBS充分混勻后吸取25 μL于第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去，第11孔作為抗原對照；④第1～11 孔均加入25 μL 4HAU 抗原在室溫（約20℃）下靜置30 min或4℃下靜置60 min；⑤每孔加入25 μL 1%體積分?jǐn)?shù)雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，在室溫（約20℃）下靜置40 min或4℃下靜置60 min，空白對照孔紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時判定結(jié)果；⑥結(jié)果判定：當(dāng)抗原對照孔（第11孔）完全凝集且陰性對照血清抗體效價不高于1 ∶4，陽性對照血清抗體效價與已知效價差不超過1個滴度時試驗方可成立。以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI抗體效價。

HI 試驗過程需掌握如下要點：①操作熟練、規(guī)范，加樣仔細(xì)、認(rèn)真，不跳孔、不串孔；②使用移液器時要垂直懸空，傾斜度最好不超過10°；③加樣劑量準(zhǔn)確，動作要求快、準(zhǔn)、穩(wěn)；④樣品倍比稀釋過程中移液器滴頭必須伸入液面以下（以2～3 mm 為宜），以免產(chǎn)生氣泡；⑤每次加紅細(xì)胞前必須先將其搖勻，加后再輕震反應(yīng)板；⑥每加一種樣品都要更換滴頭。

2.5 其他措施使結(jié)果更準(zhǔn)、使試驗更快速、高效2.5.1 劃分“功能區(qū)”

將實驗臺面劃分成六個功能區(qū)：加生理鹽水區(qū)、倍比稀釋區(qū)、加4HAU抗原區(qū)、加紅細(xì)胞區(qū)、震蕩區(qū)及結(jié)果判定區(qū)。這有效避免了加樣過程中的錯加、漏加。

2.5.2 固定移液器

“固定移液器”即每個移液器在相對固定的時間段只加某一種樣品，即某個移液器在相對固定的時間段加生理鹽水的只加生理鹽水，加抗原的只加抗原，這不僅有效避免了因忘記更換滴頭導(dǎo)致的錯誤，更避免了因頻繁更換滴頭造成的浪費，從而大大節(jié)約了滴頭。

3 結(jié)論

通過以上這些措施，不但實驗結(jié)果準(zhǔn)確性得到了充分的保證，還大大節(jié)省了試驗所需的時間，原來需要3～4 d才做完的試驗，現(xiàn)在可以在1 d內(nèi)搞定，這在春秋集中免疫后的集中抗體檢測時，因有大量血樣等待檢測，且每份樣品都有四種抗體需要檢測時的效果尤其凸顯。同時試驗材料消耗及廢棄物的處理成本都大大降低。再者，因為試驗時間大大縮短，所配4HAU 抗原效價基本不變，所配紅細(xì)胞還依然保持強勁活力，從而使試驗結(jié)果更準(zhǔn)確?！?/p>